이 연구에서는 CRISPR-Cas12a와 결합된 재조합 중합효소 증폭을 기반으로 하는 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스에 대한 빠르고 민감하며 휴대 가능한 검출 방법이 개발되었습니다.
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방법 논문
CRISPR-Cas12a와 결합된 재조합 중합효소 증폭을 사용한 현장 배치 가능 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스 검출
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
감귤류 재배자에 의한 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스(CLas)의 조기 발견은 조기 개입을 촉진하고 질병의 확산을 예방합니다. 재조합 효소 중합 효소 증폭과 군집된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복/CRISPR 관련 12a(CRISPR-Cas12a) 시스템의 뉴클레아제 활성을 활용하는 형광 리포터를 결합한 신속하고 휴대 가능한 황룡빙(HLB) 진단을 위한 간단한 방법이 여기에 제시됩니다. 이 기술의 감도는 PCR보다 훨씬 높습니다. 또한, 이 방법은 잎 샘플을 사용했을 때 qPCR과 유사한 결과를 보였다. 기존의 CLas 검출 방법과 비교하여 여기에 제시된 검출 방법은 90 분 안에 완료 할 수 있으며 PCR 기계를 사용할 필요가없는 등온 조건에서 작동합니다. 또한 현장에서 휴대용 형광 검출 장치를 통해 결과를 시각화 할 수 있습니다.
서론
황룡빙(HLB)은 전 세계적으로 가장 문제가 되는 감귤류 질병 중 하나입니다1. HLB는 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스(CLas), Ca. L. 아프리카누스 및 Ca. L. 아메리카누스2를 포함하는 체관부 집락화 및 까다로운 박테리아 칸디다투스 리베리박터 종에 의해 발생합니다. 중국과 미국에서 가장 널리 퍼진 HLB 관련 종은 아시아 감귤류 프실라(Diaphorina citri) 또는 접목을 통해 전염되는 CLas입니다.3. CLas에 감염된 후 감귤 나무는 죽을 때까지 성장 감소를 보여줍니다2. CLas에 감염된 감귤류 잎의 일반적인 증상은 얼룩덜룩 한 얼룩, 녹색 섬 (작은 원형 짙은 녹색 점), 두껍고 가죽 같은 잎에 융기 된 코르키 정맥, 불균일 한 황변 싹2입니다. 또한 CLas에 감염된 과일은 작고 편향된 것처럼 보입니다2.
감귤류 품종은 HLB에 내성이 없고 HLB에 대한 치료법이 없기 때문에 ....
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프로토콜
1. 클라스 탐정의 건설
참고: CLas-DETECTR의 구성은 용액 준비, 감귤류 총 DNA 분리, 등온 DNA 증폭 및 결과 시각화의 4단계 프로세스입니다. CLas-DETECTR 분석의 개략도는 그림 1A에 나와 있습니다.
- 용액 준비
- 완충액 A: 6% PEG 200 중 20 mM NaOH를 준비한다. 100mL의 경우 113mg의 NaOH와 6g의 PEG 200을 병에 80mL의 H2O에 넣습니다. 병을 모든 PEG 200이 용해될 때까지 60°C의 수조에서 인큐베이션한다. 그런 다음 H2O를 100mL의 부피에 첨가하십시오.
- 용액 B 준비: 각 반응에 대해 10μL의 RPA 완충액, 0.8μL의 F-RPA-RNRf, 0.8μL의 R-RPA-RNRr 및 3.9μL의ddH2O를 최종 부피 15.5μL에 추가합니다.
참고: F-RPA-RNRf 및 R-RPA-RNRr은 nrdB 유전자에 대한 분석에 사용되는 프라이머입니다. 순서는 표 1 을 참조하십시오. - 용액 C 준비: 각 반응에 대해 1μL의 ssDNA 리포터....
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결과
여기에서는 RPA와 CRISPR-Cas12a 시스템을 결합하여 현장에서 HLB를 진단하는 휴대용 플랫폼인 CLas-DETECTR에 대해 설명했습니다. CLas-DETECTR의 스키마는 그림 1A에 나와 있습니다.
CLas의 존재가 PCR에 의해 확인 된 HLB 감염 및 HLB에 감염되지 않은 Newhall 트리 (그림 1B)의 잎 샘플 (그림 1C)을 CLas-DETECTR 테스트를 받았을 때, HLB 감염 샘플에서는 녹색 형광 신호가 보였지만 HLB 감염되지 않은 샘플 및 음성 대조군에서는 보이지 않았습니다 (그림 1D).
다른 박테리아에서 추출한 핵산을 사용하여 CLas-DETECTR의 특이성을 결정했습니다. CLa.......
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토론
이 연구는 RPA와 CRISPR-Cas12a 시스템을 결합한 CLas-DETECTR라는 이름의 CLas를 탐지하는 신속하고 이식 가능한 방법을 제시합니다. 워크플로는 그림 1에 나와 있습니다. CLas-DETECTR는 특이성과 민감도로 CLas를 검출합니다(그림 2 및 그림 3). 또한 CLas-DETECTR은 뉴홀 리프 샘플을 사용하여 qPCR과 동일한 감도로 CLas를 검출합니다(그림 4). 특히, 검출 결과는 실험실 기반 기기와 독립적인 휴대용 휴대용 장치를 통해 직접 시각화할 수 있으며, 이는 실시간 HLB 진단에 매우 중요합니다.
프로토콜에는 몇 가지 중요한 고려 사항이 있습니다. 첫째, CLas-DETECTR은 qPCR만큼 민감.......
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공개 사항
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 중국 국가 핵심 R & D 프로그램 (2021YFD1400805), 장시성 주요 과학 기술 R & D 프로그램 (20194ABC28007), 장시 교육부 프로젝트 (GJJ201449) 및 장시성 현대 농업 과학 연구의 공동 혁신 (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| AxyPrep DNA 젤 추출 키트 | Corning | 09319KE1 | 중국 |
| 세균 게놈 DNA 추출 키트 | Solarbio | D1600 | 중국 |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China |
| Ex Taq 버전 2.0 플러스 염료 | TaKaRa | RR902A | 중국 |
| 휴대용 형광 검출 장치 | LUYOR | 3415RG | 중국 |
| 홀 펀처 | Deli | 114 | 중국 |
| 마그네슘 아세테이트, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | 영국 |
| NaOH | SCR | 10019718 | 중국 |
| NEB 버퍼 3.1 | NEB | B7203 | USA |
| PCR 스트립 튜브 | LABSELECT | PST-0208-FT-C | 중국 |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | 중국 |
| 퀵-로드 퍼플 1 kb 플러스 DNA 래더 | New England Biolabs | N0550S | USA |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | 영국 |
참고문헌
- Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529(2022).
- Bové, J. M. ....
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재인쇄 및 허가
