본 프로토콜은 심초음파유도 하에 바이러스의 직접 심내내 주사에 의해 래트 및 마우스 심장에서 전이유전자 발현을 위한 방법을 기술한다. 격리 된 Langendorff 관류 심장의 프로그램 된 전기 자극에 의한 심실 부정맥에 대한 심장의 감수성을 평가하는 방법도 여기에 설명되어 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
심장병은 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인입니다. 취급의 용이성과 형질 전환 균주의 풍부함으로 인해 설치류는 심혈관 연구의 필수 모델이되었습니다. 그러나 심장병 환자에서 종종 사망을 유발하는 자발적인 치명적인 심장 부정맥은 설치류 심장 질환 모델에서 드뭅니다. 이것은 주로 인간과 설치류 사이의 심장 전기적 특성의 종 차이 때문이며 설치류를 이용한 심장 부정맥 연구에 도전을 제기합니다. 이 프로토콜은 재조합 바이러스 (아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)의 심초음파-유도 근육내 주사를 사용하여 마우스 및 래트 심실 심근에서 효율적인 전이유전자 발현을 가능하게 하는 접근법을 설명한다. 이 연구는 또한 아드레날린 성 및 프로그램 된 전기 자극을 모두 사용하여 분리 된 Langendorff 관류 마우스 및 쥐 심장을 사용하여 부정맥에 대한 심장 감수성을 신뢰할 수있는 평가를 가능하게하는 방법을 설명합니다. 이러한 기술은 심근 경색과 같은 부상 후 불리한 심장 리모델링과 관련된 심장 리듬 장애를 연구하는 데 중요합니다.
서론
심혈관 질환은 전 세계적으로 주요 사망 원인으로 2017년에만 1,800만 명의 목숨을 앗아갔습니다1. 설치류, 특히 마우스와 쥐는 취급의 용이성과 다양한 형질전환 과발현 또는 녹아웃 라인의 가용성으로 인해 심혈관 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 모델이 되었습니다. 설치류 모델은 질병 메커니즘을 이해하고 심근 경색2, 고혈압3, 심부전4 및 죽상 동맥 경화증5에서 잠재적 인 새로운 치료 표적을 식별하는 데 기본이되었습니다. 그러나 심장 부정맥 연구에서 설치류의 사용은 인간 또는 대형 동물 모델에 비해 작은 심장 크기와 빠른 심박수로 인해 제한됩니다. 따라서 심근 경색 후 생쥐 또는 쥐의 자발적인 치명적인 부정맥은 드물다2. 연구자들은 부정맥 부담이나 부정맥 경향의 의미있는 변화를 보여주지 않고 섬유증이나 유전자 발현과 같은 친 부정맥 기질을 반영 할 수있는 간접적 인 2 차 변화에 집중해야합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 유전자 변형 6,7
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프로토콜
설명 된 모든 방법과 절차는 오타와 대학의 동물 연구 윤리 검토위원회와 오타와 대학 심장 연구소의 생물 안전성 검토위원회의 승인을 받았습니다. 개발된 안전성 프로토콜에는 재조합 아데노바이러스 또는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 다루는 모든 절차가 레벨 II 생물안전 캐비닛에서 수행되었다는 것이 포함됩니다. 바이러스와 접촉 한 모든 항목은 실험 후 철저히 오염 제거되었습니다. Ctnnb1 플록스/플록스 및 αMHC-MerCreMer 마우스(8-12주령, 성별) 및 Sprague-Dawley 쥐(200-250g, 수컷)를 본 연구에 사용했습니다. 동물은 상업적 출처로부터 수득하였다(재료 표 참조). 동물을 다루는 모든 절차는 기관 규제위원회에서 훈련되고 승인 된 직원이 수행했습니다. 모든 절차 중에 적절한 개인 보호 장비가 사용되었습니다.
1. 설치류 심실 조직에서의 바이러스 전이 유전자 발현
참고: 표적 유전자를 발현하는 재조합 아데노바이러스 또는 AAV(역가 1 x 1010 PFU/mL) 또는 AAV9-GFP(역가 1 x 1013 GC/mL)( 재....
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결과
여기에 설명된 프로토콜(그림 1)에 따라 관류되면 분리된 쥐 또는 마우스의 심장이 최소 4시간 동안 리드미컬하고 안정적으로 박동합니다. 실험 설계가 더 긴 기간의 심장 관류를 요구하는 경우, 장기간 관류 후 심근 부종의 발생을 줄이기 위해 관류 용액에 알부민을 첨가하는 것이 도움이됩니다14. 관류 용액에 이소 프로 테레 놀을 포함시키는 것은 심근 경색 및 심부전과 같은 많은 부정맥 상태에서 발생하는 교감 신경계의 활성화를 모방합니다. 프로그래밍된 전기 자극 동안 심장의 성공적인 페이싱은 (1) 연속적인 S1 자극 동안 심장 박동의 1:1 캡처 및 (2) S1 페이싱 중 연장된(또는 더 넓은) QRS 복합체에 의해 확인됩니다(그림 3 및 그림 4). 후자는 심장이 정점에서 진행되고 심실 조직에서 활성화의 느린 전도가 QRS 복합 .......
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토론
Langendorff-관류 및 격리 된 심장 준비의 성공을 위해서는 몇 가지 단계가 중요합니다. 첫째, 심장 수집 중 심장 손상을 피하는 것이 중요합니다 (예 : 실수로 짜내거나 가위로 자르는 경우). 둘째, 수집 된 심장을 가능한 한 빨리 차가운 Tyrode 용액에 넣는 것이 심장 박동을 멈추고 심장의 산소 소비를 줄이기 때문에 중요합니다. 셋째, 대동맥에 삽입하는 바늘이 너무 깊어서는 안되며, 이상적으로는 바늘 끝이 대동맥 판막 수준에 가까워 심장이 관상 동맥을 통해 잘 관류되도록해야합니다. 마지막으로, 관류 바늘의 기포는 대동맥 캐뉼러 형성 전에 제거해야 합니다.—일반적으로 캐뉼러 직전에 몇 초 동안 펌프를 켜서 바늘 끝의 기포를 제거하는 것이 도움이 됩니다.
Langendorff- 관류 심장 제제는 동물에 대한 생체 내 연구에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 심장에 적용되는 약물 (예 :이 연구에서 사용 된 이소 프로 테레 놀)의 농도와 지속 시간을.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없습니다.
감사의 글
이 연구는 캐나다 보건 연구소 (CIHR) 프로젝트 보조금 (PJT-148918 및 PJT-180533, WL), CIHR 조기 경력 조사자 상 (AR8-162705, WL), 캐나다 심장 및 뇌졸중 재단 (HSFC) 맥도날드 장학금 및 신규 조사자 상 (S-17-LI-0866, WL), 학생 장학금 (JW 및 YX), 오타와 대학교 심장 기부 기금의 박사후 연구원 (AL로). 저자는 Richard Seymour 씨의 기술 지원에 감사드립니다. 그림 2 는 승인된 라이선스가 있는 Biorender.com 사용하여 작성되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| 아데노-연관 바이러스 (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
| 아데노바이러스 (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| 아데노바이러스 (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
| Biosafety cabinet (Level II) | Microzone Corporation | N/A | 모델 #: BK-2-4 |
| 부프레노르핀 | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| 염화칼슘 | 시그마-알드리치 | 102378 | |
| D-포도 | 피셔 케미컬 | D16-1 | |
| 이발기 | WAHL 클리퍼 코퍼레이션 | 78001 | |
| 해밀턴 주사기 | 시그마-알드리치 | 20701 | 705 LT, 볼륨 50 μ L |
| 가열 패드 | Life Brand | E12107 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| 이소 프로테레놀 염산염 | 시그마 - 알드리치 | 1351005 | |
| LabChart 8 소프트웨어 | ADInstruments Inc. | ECG 기록용 | 버전 8.1.5 |
| 염화마그네슘 육수화물 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| 마우스(Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| 마우스(α MHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| 현미경 | Leica | S9i | for Langendorff 시스템 |
| MS400 변환기 | VisualSonic Inc. | N/A | |
| 안과 연고 | Systane | DIN 02444062 | |
| 염화칼륨(KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 압력계 | NETECH | DigiMano 1000 | Langendorff 시스템용 |
| 펌프 | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | Langendorff 시스템용 |
| 쥐(Sprague-Dawley, 남성) | Charles River | 400 | |
| 메스 블레이드 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| 메스 핸들 | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| 실리콘 엘라스토머 | Down Inc. | Sylgard 184 | Langendorff 시스템용 |
| 소동물 ECG 시스템 | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 및 Animal Bio Amp |
| 염화나트륨 | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| 수산화나트륨 | Sigma-Aldrich | 567530 | |
| 자극기 | IonOptix | MyoPacer EP | |
| VEVO3100 전임상 이미징 시스템 | VisualSonic Inc. | 해당 사항 없음 |
참고문헌
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139(2020).
- Wang, J., et al. Card....
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