본 프로토콜은 Caenorhabditis elegans에 대한 액체 및 온플레이트 배양에서 지질 보충 방법을 설명하고 벌크 또는 소수의 웜 및 웜 조직으로부터의 종단 연구 및 유전자 전사 분석과 결합합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
Caenorhabditis elegans의 수명 및 유전자 전사 분석을위한 지질 보충
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
노화는 환경 적 및 유전 적 기여로 인한 점진적인 생리적 변화를 특징으로하는 복잡한 과정입니다. 지질은 세포막의 구조적 구성 요소를 구성하고 에너지를 저장하며 신호 분자로 사용하는 데 중요합니다. 지질 대사 및 신호 전달의 조절은 뚜렷한 장수 경로를 활성화하는 데 필수적입니다. 회충 Caenorhabditis elegans 는 지질 대사의 기여와 장수 조절의 신호 전달을 해부하는 우수하고 강력한 유기체입니다. 여러 연구 연구에서 특정 지질 분자의 식단 보충제가 C. elegans 수명을 연장하는 방법을 설명했습니다. 그러나 보충 조건의 사소한 차이로 인해 다른 실험실의 과학자들 사이에서 재현성 문제가 발생할 수 있습니다. 여기에서 C. elegans 에 대한 두 가지 자세한 보충 방법은 접시에 파종 된 박테리아 또는 액체 배양에서 박테리아 현탁액으로 지질 보충을 사용하는 것으로보고되었습니다. 또한 본원에는 몇 가지 웜으로부터 유래된 전체 웜 용해물 또는 해부된 조직을 사용하여 평생 지질 보충 및 qRT-PCR 분석을 통한 수명 분석을 수행하기 위한 세부 정보가 제공된다. 지질 보충에 대한 종단 연구와 전사 조사의 조합을 사용하여 수유 분석은 지질이 수명과 건강한 노화에 어떻게 영향을 미치는지 해부하는 신뢰할 수 있는 접근 방식을 제공합니다. 이 방법론은 또한 소수의 해부 조직 또는 소수의 동물을 사용하여 전사체의 하위 집합의 변화를 평가하기 위해 다양한 영양 스크리닝 접근법에 적용될 수 있습니다.
서론
지질
지질은 유기 용매에 용해되지만 물 1,2에는 녹지 않는 작은 소수성 또는 양친매성 분자입니다. 별개의 지질 분자는 사슬에 포함 된 탄소의 수, 위치, 이중 결합 수 및 글리세롤 또는 인산염을 포함한 결합 구조에 따라 서로 구별됩니다. 지질은 막 이중층을 구성하고, 에너지 저장을 제공하고, 신호 분자 3,4로 작용하는 것을 포함하여 유기체 기능을 조절하기 위해 별개의 세포 내에서 그리고 별개의 세포에 걸쳐 중요한 역할을 합니다.
첫째, 지질은 세포외 환경에서 내부 구획을 분할하는 원형질막과 세포내 세포하막을 포함하는 생물학적 막의 구조적 구성 요소입니다. 둘째, 지질은 척추 동물과 무척추 동물의 주요 에너지 저장 형태입니다. 트리 아실 글리세롤을 포함한 중성 지질은 지방 조직을 포함한 다양한 조직에 장기간 저장됩니다. 선충류에서 Caenorhabditis elegans, 장은 주요 대사성 지방 저장 기관입니다. 그 기능은 영양소의 소화 및 흡수뿐만 아니라 포유류 간세포의 활동과 유....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
그림 1 은 다양한 실험 설정을 사용한 지질 공급의 개략도를 보여줍니다.
1. 지질조절균의 제조
- 5.85 g의 NaCl, 1.0 g의 K2HPO4 및 6.0 g의 KH2PO4 (재료 표 참조)를 999 mL의 탈 이온수에 용해시켜 박테리아 희석식이 제한(BDR) 염기 용액을 제조한다. pH를 0.5 M KOH로 6.0으로 조정한 다음, 0.22 μm 필터를 통해 여과한다.
알림: BDR 용액은 장기 보관을 위해 실온에서 보관할 수 있습니다. - BDR 염기 용액 10mL마다 5mg/mL 콜레스테롤(200프루프 에탄올에 용해됨) 10μL를 추가하여 BDR 배지를 준비합니다.
- OP50 박테리아( 재료 표 참조)를 -80°C 스톡에서 LB-한천 플레이트로 줄무늬로 만들고 37°C에서 밤새 배양합니다.
알림: 37°C에서 하룻밤 배양한 후 OP50 플레이트는 안정적인 공급 결과를 위해 최대 1주일 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다. - OP50 LB-한천....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
지질 보충 시 몇 가지 전체 벌레를 사용한 전사 변화의 검증
몇몇 전체 웜에서 RNA를 추출하고 cDNA로 역전사하는 프로토콜이 재현 가능하고 벌크 웜의 데이터와 비교할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 장에서 리소좀 산 리파아제 lipl-4를 과발현하는 수명이 긴 웜 균주를 사용했습니다 7,8,33,35. 이전 연구3에서 보고된 신경펩티드 처리 유전자 egl-21 및 egl-7,8,33의 전사 유도가 검증되었습니다(그림 2A.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
지질 보충제는 건강한 노화에 대한 특정 지질 종의 직접적인 영향을 설명하기 위해 노화 연구에 사용되었습니다 6,7,23,26,27,31. 그러나 지질 보충 절차는 어려울 수 있으며 실험 간의 불일치로 인해 재현 불가능한 결과가 발생할 수 있습니다. 여기에서는 새로운 과학자들이 기술적 부정확성으로 인한 잠재적 인 함정을 피할 수 있도록 안내하기 위해 첫 번째 상세한 단계별 프로토콜이 문서화되어 있습니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 다음 단락에서 자세히 설명합니다. 지질 연구 도구 상자는 또한 지질 보충 후 소수의 벌레와 특정 벌레 조직에서만 RNA 분리를 도입하여 확장됩니다. 전.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
유지 보수 지원에 대해 P. Svay에게 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), 마치 오브 다임스 재단 (MCW), 웰치 재단 (MCW), HHMI 조사관 (MCW) 및 NIH T32 ES027801 박사 전 학생 펠로우 (MS). 일부 균주는 NIH 연구 인프라 프로그램 사무소 (P40 OD010440)가 자금을 지원하는 CGC에서 제공했습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5mL 유봉 | Genesee Scientific | 93-165P15 | Trizol |
| Agarose | Sigma | A9639-500G | |
| AmfiRivert cDNA 합성 플래티넘 마스터 믹스 | GenDEPOT | R5600 | |
| Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR | ThermoFisher | A28567 | qRT-PCR용 |
| 벤치마크 사이언티픽 StripSpin 12 마이크로 원심분리기 | 벤치마크 사이언티픽 | C1248 | 스핀 다운 PCR 튜브용 |
| Branson 450 디지털 소파니퍼, w/ 1/8" 팁 | Branson Ultrasonic Corporation | 100-132-888R | |
| 클로로포름 | 피셔 사이언티픽 | C298-500 | |
| 콜레스테롤 | 시그마 | C8503-25G | |
| 디메틸설폭사이드(DMSO) | 시그마 | D8418-100ML | |
| Eppendorf 5424 R 원심분리기 | Eppendorf | 22620444R | RNA 추출용 |
| Eppendorf vapo protect mastercycler pro | Eppendorf | 950030010 | 역전사용 |
| Ethanol, Absolute(200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate | Neta Scientific | 665180 | 12-well 라이쿠이드 공급용 플레이트 |
| Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm | Neta Scientific | 664161 | 박테리아 LB 플레이트 및 웜용 10cm NGM 플레이트 |
| Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm | Neta Scientific | 628161 | 웜용 6-cm NGM 플레이트용 |
| Invitrogen nuclease-free water ThermoFisher | AM9937 | ||
| 이소프로아놀 | 시그마 | PX1835-2 | |
| 레바 미솔 하이드로 클로라이드 | VWR | SPCML1054 | |
| lipl-4Tg< / em> | MCW Lab | N / A | 형질 전환 C. elegans< / em> |
| lipl-4Tg; fat-3(wa22) | MCW Lab | N/A | 형질전환 C. elegans |
| Luria Broth Base | ThermoFisher | 12795-084 | |
| 마그네슘 설페이트(MgSO4) | Sigma | M2643-500G | |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode | ThermoFisher | 4483354 | 96-well qPCR 플레이트 |
| MicroAmp 광학 접착 필름 | 적용 BioSystem | 4311971 | 96웰 qPCR 플레이트를 밀봉하기 위한 |
| N2 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | C. elegans wild isolate |
| 에서 뉴클레아제가 없는 물로 지정되지 않는 한 완충액 및 배양 배지를 포함한 모든 시약을 만드는 데 사용되는 탈이온수 | |||
| NanoDrop ND-1000 분광 광도계 | ThermoFisher | N/A | RNA 농도 측정용 |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | C. elegans 식품 |
| 인산칼륨 이염기성 삼수화물(K2HPO4· 3H2O) | Sigma | P5504-1KG | |
| 인산칼륨 일염기성 (KH2PO4) | Sigma | P0662-2.5KG | |
| Power SYBR Green cells-to-Ct kit | ThermoFisher | 4402953 | 몇몇 벌레 또는 벌레 조직의 역전사 및 qPCR용 |
| Power SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | 4367659 | 용 벌크 웜 샘플의 qPCR |
| Pure Bright 살균 울트라 표백제 | KIK 인터내셔널 LLC. | 59647210143 | 6% 가정용 표백제 |
| 함몰부가 있는 벌레 알 준비용 파이렉스 스폿 플레이트 | Sigma | CLS722085-18EA | 벌레 해부용 시계 유리 |
| RNaseZap RNase 오염 제거 용액 | ThermoFisher | AM9780 | |
| 클로라이드 나트륨(NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
| 수산화나트륨(NaOH) | Sigma | SX0590-3 | |
| 인산 나트륨 이염기성 헵타하이드레이트 (Na2HPO4· 7H2O) | Sigma | S9390-1KG | |
| Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge | Thermo | 7500-4337 | 박테리아 수집용 |
| Thermo Sorvall ST 8 원심분리기 | Thermo | 7500-7200 | 벌레 알 준비용 |
| TRIzol 시약 | TheroFisher | 15596018 | RNA 추출 시약 |
| Turbo DNA-free kit | ThermoFisher | AM1907 | RNA 추출에서 DNA 오염 제거용 |
| Vortexer 59 | Denville Scientific INV | S7030 | |
| VWR 일회용 펠릿 믹서 및 무선 모터 | VWR | 47747-370 | 를 사용한 웜 그라인딩용 |
| 웜 수집용. 단종된 모델, VWR에서 Cat# 76269-064 | |||
| 웜 피커 | WormStuff | 59-AWP |
참고문헌
- Fahy, E., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids 1. Journal of Lipid Research. 50, 9-14 (2009).
- Liebisch, G., et al. Update on LIPID MAPS classificatio....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
