세포 이동의 양전자 방출 단층 촬영 이미징: 세포 방사선 표지 방법

요약

여기에 제시된 것은 바로 사용할 수 있는 방사성 표지 합성 [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine([⁸⁹Zr]Zr-DBN)을 사용하여 양전자 방출 단층 촬영(PET) 방사성 동위원소, ⁸⁹Zr(t_1/2 78.4 h)로 세포를 방사성 표지하는 프로토콜입니다. [⁸⁹Zr]Zr-DBN을 사용한 방사성 표지 세포는 투여 후 최대 7일 동안 PET를 사용하여 체내에서 투여된 방사성 표지 세포의 비침습적 추적 및 이미징을 가능하게 합니다.

초록

줄기세포 및 키메라 항원 수용체(CAR) T세포 치료제는 장기 재생을 위한 유망한 치료제이자 다양한 암에 대한 면역 요법으로 부상하고 있습니다. 이러한 분야에서 상당한 진전이 이루어졌음에도 불구하고 살아있는 시스템에서 투여된 치료 세포의 약동학 및 약력학을 더 잘 이해하기 위해서는 아직 더 많은 것을 배워야 합니다. 양전자 방출 단층 촬영(PET)을 사용한 세포의 비침습적 생체 내 추적을 위해 ^89Zr(t_1/2 78.4h)을 사용하여 새로운 [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine([⁸⁹Zr]Zr-DBN) 매개 세포 방사선 표지 방법이 개발되었습니다. 본 프로토콜은 중간엽 줄기세포, 계통 유도 심근세포, 간 재생 간세포, 백혈구, 흑색종 세포 및 수지상세포를 포함한 다양한 세포의 직접 방사선표지를 위한 [⁸⁹Zr]Zr-DBN-매개 즉시 사용 가능한 방사선표지 합성을 기술한다. 개발된 방법론은 방사성 표지된 세포의 특성이나 기능에 영향을 미치지 않고 투여 후 최대 7일 동안 세포 이동에 대한 비침습적 PET 이미징을 가능하게 합니다. 또한, 이 프로토콜은 [89 Zr]Zr-DBN의 방사성 합성, [89 Zr]Zr-DBN의 생체적합성 제형, 방사성 표지를 위한 세포 준비, 그리고 마지막으로 세포의 성공적인 방사성 표지에 필요한 모든 복잡한 세부 사항을 포함하여 [⁸⁹Zr]Zr-DBN을 사용한 세포의 방사성 표지를 위한 단계적 방법을 설명합니다.

서론

줄기세포와 키메라 항원 수용체(CAR) T세포 치료제는 심근부전^1,2, 망막변성2, 황반변성², 당뇨병2, 심근경색^3,4,5, 암6,7,8,9 등 다양한 질병의 치료를 위해 활발히 연구되고 있다^.10. 줄기세포 치료의 두 가지 그럴듯한 접근법 중 줄기세포를 질병 부위에 직접 생착시켜 치료적 반응을 일으키거나, 질병 부위에 부착하지 않고 질병 부위의 미세환경을 변화시켜 간접적인 치료적 반응을 일으킬 수 있다. 간접적인 치료적 반응은 질병을 복구하거나 치료할 수 있는 인자를 방출함으로써 질병 부위의 미세환경에 변....

프로토콜

수지상세포와 흑색종세포를 상업적으로 수득하였다¹⁸. 간세포는 복강경 부분 간절제술 후 돼지의 간에서 분리하였다^22,24. 줄기세포는 골수 흡인^18,19,26으로부터 분리하였다. 지방 조직 유래 줄기 세포는 인간 세포 치료 실험실(Human Cellular Therapy Laboratory, Mayo Clinic Rochester²³)에서 수득하였다. 인간 백혈구는 로체스터²⁵에 있는 메이요 클리닉(Mayo Clinic)의 수혈 의학부(Division of Transfusion Medicine)로부터 받은 수집된 혈액으로부터 분리하였다. 방사선 표지에 사용되는 다양한 세포는 기관 동물 관리 및 사용 위원회, 메이요 클리닉 줄기 세포 연구 감독 소위원회, 수혈 의학 연구 위원회, 기관 생물 안전 위원회 및 방사선 안전 위원회에서 권장하는 지침에 따라 획득 및 사용되었습니다.

결과

본 논문에 제시된 대표적인 결과는 종전의 [⁸⁹Zr]Zr-DBN 합성 및 세포 방사성 표지 연구 18,19,22,23,24,25에서 수집된 것이다. 간단히 말해서, ⁸⁹Zr은 7.5-15 μg의 DFO-Bn-NCS를 사용하여 25-37 °C에서 30 ~ 60 분 내에 DFO-Bn-NCS와 성공적으로 복합화 될 수 있습니다 (표 2). 세포 방사성 표지 효율은 세척 후 방사성 표지된 세포 펠릿에서 관찰되는 보정되지 않은 수율로 20-50%까지 다양합니다(표 1). 18,19,22,2.......

토론

다음은 효과적인 세포 방사선 표지를 위해 최적화가 필요한 프로토콜의 중요한 단계입니다. 프로토콜 단계 1.2 및 1.3에서 사용된 [89 Zr]Zr(HPO 4)₂ 또는 [⁸⁹Zr]ZrCl ₄의 부피에 따라 적절한 부피(마이크로리터)의 베이스를 사용해야 합니다. pH 7.5-8.0의 pH 범위를 달성하기 위해 [89 Zr]Zr(HPO 4)2의 중화에는 1.0M K 2 CO 3 용액을 사용하고 [⁸⁹Zr] ZrCl₄의 중화에는 1.0 M Na ₂CO₃ 용액을 사용해야합니다. 단계 2.1에서, K2HPO4/_KH2PO4및 HEPES를 포함하는 세포 호환 혼합물은 세포 방사성 표지 효율을 증가시키기 위해 [8.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Acetonitrile	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	A996-4
알파 최소 필수 매체	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	12571063
음이온 교환 컬럼	Macherey-Nagel, Inc., Dü ren, 독일	731876	Chromafix 30-PS-HCO3  SPE 45 mg 카트리지
원뿔형 원심분리기 튜브(15 mL)	Corning Inc., Glendale, AZ, USA	352096	Falcon 15 mL 고선명 폴리프로필렌(PP) 원추형 원심분리기 튜브
수지상 세포	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL-11904
DFO-Bn-NCS	Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA	B-705	p-SCN-Bn-Deferoxamine
DMSO	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	276855
용량 보정기	Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA	5130-3234	CRC -55tR 용량 보정기
둘베코' s 변형 된 독수리' S 미디엄	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	30-2002
Fetal Bovine Serum (FBS)	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	30-2020
Hanks Balanced Salt solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	14025092	H-HBSS
염산(미량 금속 기초 등급)	용Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, 미국	A508P212
흑색종 세포	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL-6475
Methanol	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	34860
마이크로 원심분리기 튜브	Eppendorf, Hamburg, Germany	30108442	Protein LoBind 미세 원심분리기 튜브
Murine GM-CSF	R& D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA	415-ML-010
페니실린/스트렙토마이신	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	15140-122
Ca2+ 및 Mg2+	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	10010023	세척 세포용
식염수	Covidien LLC, Mansfield, MA, USA	1020	0.9% 멸균 식염수
셰이커	Eppendorf, 함부르크, 독일	T1317	Thermomixer
실리카 겔-rad-TLC 종이 시트	Agilent Technologies Inc., 미국 캘리포니아주 산타클라라	SGI0001	iTLC-SG

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