여기에서는 인간 대동맥 벽에서 평활근 세포의 생체 내 생체 역학적 변형을 복제하기 위해 인간 대동맥 평활근 세포 장기 온 칩 모델을 개발했습니다.
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방법 논문
대동맥 벽의 생체 역학적 변형을 요약하기 위한 인간 대동맥 평활근 세포 장기 온 칩 모델 구축
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
종래의 2차원 세포 배양 기술 및 동물 모델은 인간 흉부 대동맥류 및 박리(TAAD)의 연구에 사용되어 왔다. 그러나, 인간 TAAD는 때때로 동물 모델에 의해 특성화될 수 없다. 임상 인간 연구와 동물 실험 사이에는 치료 약물의 발견을 방해 할 수있는 명백한 종 차이가 있습니다. 대조적으로, 종래의 세포 배양 모델은 생체 내 생체 역학적 자극을 시뮬레이션할 수 없다. 이를 위해 최근 몇 년 동안 미세 가공 및 미세 유체 기술이 크게 발전하여 생체 역학적 미세 환경을 복제하는 유기체 온 칩 모델을 구축하기위한 새로운 기술을 제공합니다. 이 연구에서는 TAAD에서 중요한 역할을 하는 인간 대동맥 평활근 세포(HASMC)가 경험하는 주기적 변형의 진폭 및 빈도를 포함하여 대동맥 생체역학의 병태생리학적 매개변수를 시뮬레이션하기 위해 인간 대동맥 평활근 세포 장기 온어칩(HASMC-OOC) 모델을 개발했습니다. 이 모델에서 HASMC의 형태는 모양이 길어지고 변형 방향에 수직으로 정렬되었으며 정적 기존 조건보다 변형 조건에서 더 수축적인 표현형을 나타냅니다. 이것은 천연 인간 대동맥 벽의 세포 방향 및 표현형과 일치했습니다. 또한, 이첨판 대동맥판막 관련 TAAD(BAV-TAAD) 및 삼첨판 대동맥판막 관련 TAAD(TAV-TAAD) 환자 유래 1차 HASMC를 사용하여 TAAD에서 HASMC 특성을 복제하는 BAV-TAAD 및 TAV-TAAD 질환 모델을 구축했습니다. HASMC-OOC 모델은 TAAD의 발병기전을 추가로 탐구하고 치료 표적을 발견하기 위해 동물 모델을 보완하는 새로운 시험관 내 플랫폼을 제공합니다.
서론
흉부 대동맥류 및 박리(TAAD)는 높은 이환율 및사망률과 관련된 대동맥벽의 국부적인 확장 또는 박리입니다1. 인간 대동맥 평활근 세포 (HASMC)는 TAAD의 발병 기전에 중요한 역할을합니다. HASMC는 말기 분화 세포가 아니며 HASMC는 높은 가소성을 유지하여 다른 자극에 반응하여 표현형을 전환 할 수 있습니다2. HASMC는 주로 생체 내에서 리드미컬한 인장 변형을 받으며, 이는 평활근 형태학적 변화, 분화 및 생리적 기능을 조절하는 핵심 요소 중 하나입니다3,4. 따라서 HASMC 연구에서 주기적 변형의 역할은 무시할 수 없습니다. 그러나 기존의 2D 세포 배양은 생체 내에서 HASMC가 경험하는 주기적 변형의 생체 역학적 자극을 복제할 수 없습니다. 또한, 동물 TAAD 모델의 구성은 이첨판 대동맥 판막 (BAV) 관련 TAAD와 같은 일부 유형의 TAAD에는 적합하지 않습니다. 또한 임상 인간 연구와 동물 실험 사이의 종 격차는 무시할 수 없습니다. 임상 실습에서 제약 번역을 방해합니다. 따라서, 대동맥 질환의 연구에서 생체 내 생체역학적 ....
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프로토콜
인간 대동맥 검체는 중산 병원, 푸단대학교 윤리위원회(NO. B2020-158). 대동맥 표본은 푸단 대학교 중산 병원에서 상행 대동맥 수술을받은 환자로부터 수집되었습니다. 참여 전에 모든 환자로부터 서면 사전 동의를 얻었습니다.
1. 일차 인간 대동맥 평활근 세포 분리
- 상행 대동맥의 오른쪽 측면 부위를 멸균 PBS, 1x-2x로 씻으십시오.
- 두 개의 안과 겸자로 조직의 내막과 외막 층을 제거하고 배지 층을 유지하여 세포를 수확합니다.
- 미디어 층을 10cm 배양 접시에 놓고 가위로 작은 조각 (2-3mm)으로 자릅니다. 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 평활근 세포 배양액(SMCM) 5mL를 추가합니다.
- 멸균 점 적기로 작은 조직을 배양 병에 넣고 조직을 고르게 펴십시오. 배양 배지를 가능한 한 많이 버린 다음 병을 거꾸로 뒤집습니다.
- 거꾸로 된 배양 병에 2mL의 SMCM을 넣고 37 ° C의 인큐베이터 (5 % CO 2)에1-2 시간 동안 놓은 다음 천천히 오른쪽을 위로 돌리고 SMCM 2mL를 더 추가합니다.
- 5-7 일 배양 후 SMCM을 4mL의 신선한 SMCM....
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결과
HASMC-OOC 모델은 진공 제어 시스템, 순환 시스템 및 PDMS 칩과 HASMC-OOC 모델의 회로도 설계로 구성됩니다(그림 1). 진공 제어 시스템은 진공 펌프, 솔레노이드 밸브 및 PLC 컨트롤러로 구성됩니다. 순환 시스템으로 작용하기 위해 연동 펌프를 사용하여 세포 배양 배지를 새로 고치고 약물을 추가했습니다. PDMS 칩은 2개의 진공 챔버와 세포 성장을 위한 SMCM으로 채워진 중간 챔버로 구성되었다. 칩 구조의 설계에 따라, PMMA 몰드를 제조하고, 3개의 PDMS 슬래브를 몰드에 붓고 70°C에서 2시간 동안 가교하여 제조하였다. 플라즈마로 처리한 후, 3개의 PDMS 슬래브와 2개의 PDMS 멤브레인을 함께 결합시켰다(그림 2). PDMS 칩을 준비할 때 칩의 PDMS 멤브레인 상에서 HASMC를 배양하고 PDMS 칩을 진공 제어 시스템과 순환 시스템에 연결하였다. 전체 시스템의 개략도는
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토론
미세유체 기술의 급속한 발전과 함께, 시험관내에서 하나 이상의 기관의 생물학적 기능 및 구조를 복제할 수 있는 OOC 모델이 최근 몇 년 동안 생물학, 의학 및 약리학15에 응용하기 위해 등장했습니다. OOC는 질병 메커니즘을 탐구하고 전임상 약물 번역 8,16을 촉진하는 데 필수적인 인간 생리적 미세 환경의 주요 기능을 시뮬레이션 할 수 있습니다. OOC는 아직 초기 단계에 있으며 OOC의 설계를 최적화하려면 더 많은 입력이 필요하지만 최근 몇 년 동안 많은 진전이있었습니다17,18. 다른 3차원 세포 배양 모델과 달리 OOC는 조직 발달 및 장기 기능 유지에 필수적인 인체의 생체역학적 매개변수를 모방할 수 있습니다. 심혈 관계의 기관과 조직은 생체 내에.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는이 작업이 상하이시 과학 기술위원회 (20ZR1411700), 중국 국립 자연 과학 재단 (81771971) 및 상하이 항해 프로그램 (22YF1406600)의 보조금으로 지원되었음을 인정합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 4% 파라포름알데히드 | Beyotime | P0099-100ml | 세포 고정화에 사용됩니다 |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | 염색에 사용됩니다 |
| 소 혈청 알부민 | Beyotime | ST025-20g | |
| 칼슘 AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| 세포 배양 플라스크 | 코닝 | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| 상업용 유연 PDMS 멤브레인 | 항저우 대머리 고급 재료 | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | 시그마 | M8318 | |
| 호스 | Runze 유체 | 96410 | 1mm 내경; 3mm 외경; 1mm 벽 두께; 공식 웹 사이트 주소 : https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 | ATCC | Lot Number : 70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | 무료 다운로드 : https://fiji.sc | 형광 강도를 식별하는 데 사용되는 이미징 플랫폼 |
| 인큐베이터 | Thermo Fisher Scientific | 온도, 습도 및 광 노출이 실험 전반에 걸쳐 정확히 동일한지 확인합니다. | |
| 루어 | Runze 유체 | RH-M016 | 공식 웹 사이트 주소 : https://www.runzefluidsystem.com. |
| 현미경 | 올림푸 | ||
| 마우스 콜라겐 | 시그마 | C7661 | |
| 산소 플라즈마 | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| 파스퇴르 피펫 | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | 배양 중 세포의 세균 오염을 방지하는 데 사용되는 항생제. |
| 연동 펌프 | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| 페트리 접시 | Corning | 430167 | |
| PLC 컨트롤러 | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC 공장 | BR010-11T8X2M | 자세한 프로그램 설정은 보충 자료에서 확인할 수 있습니다. 공식 웹사이트 주소: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| 솔레노이드 밸브 | SMC (중국) | VQZ300 | |
| 주사기 | Becton, Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | 세포막 관통 |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | RNA 추출 |
| 트립신에 사용 | Sigma | 15400054 | |
| 진공 필터 | SMC (중국) | ZFC5-6 | 공식 웹 사이트 주소 : https://www.smc.com.cn |
| 진공 펌프 | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| 진공 조절기 | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers< / strong> | |||
| Primer Name | Forward (5 'to 3') | 리버스 (5 '에서 3') | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC, | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
참고문헌
- Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002. Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).
- van Varik, B. J., et al.
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재인쇄 및 허가
