다운스트림 순환 프리 DNA 응용을 위한 표준화된 액체 생검 사전 분석 프로토콜

용어 "액체 생검"은 2010년¹ 차 종양으로부터 기원되는 혈액 및 다른 체액에서 분자(예를 들어, 단백질, 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA)), 세포밖 소포(예를 들어, 엑소좀)의 존재로서 정의되었다. 액체 생검 샘플의 사용은 특정 순간에 특정 영역으로 제한된 조직 생검이 종양 이질성으로 인해 관련 클론을 놓칠 수 있기 때문에 번역 종양학 연구에 혁명을 일으켰습니다. 또한, 액체 생검은 침습적 생검을 피할 수 있기 때문에 원발성 조직이 부족하거나 접근할 수 없는 종양 유형에서 관련 역할을 하며, 이는 환자의 비용과 위험을 감소시킬 수 있기 때문이다. 더욱이, 종양 분자 특성은 주로 치료 압력으로 인해 끊임없이 진화하고 있으며, 액체 생검 샘플은 기준선, 치료, 최상의 반응, 질병 진행 또는 심지어 전과 같은 질병의 다른 임상 및 치료 시간에서 종적으로, 복용 할 수 있기 때문에 종양 클론 역학을 포착 할 수 있습니다. "실시간 액체 생검"의 개념은 종양의 동적 변화를 실시간으로 모니터링 할 수 있으므로이 질병에서 정밀 의학을 가능하게한다는 것을 의미합니다. 액체 생검은 암의 스크리닝 및 조기 발견, 질병의 실시간 모니터링, 최소 잔류 질환의 검출, 치료 저항성에 대한 메커니즘 연구 및 치료 수준¹에서 환자의 계층화를 포함하여 클리닉에서 수많은 잠재적 인 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 질병 재발 및 진행의 조기 발견은 많은 종양 유형에서 충족되지 않은 임상 적 요구이며 암 환자의 생존과 삶의 질을 높이는 핵심 요소입니다. 일상적인 영상화 방식 및 가용성 종양 마커는 이 작업에 필요한 민감도 및/또는 특이성이 부족할 수 있다. 따라서, 신규한 예측 마커는 순환하는 유리 핵산에 기초한 것들과 같은 클리닉에서 긴급하게 필요하다.

액체 생검 연구에 사용되는 샘플의 유형은 혈액, 소변, 타액 및 대변 샘플을 포함하지만 이에 국한되지 않습니다. 다른 종양-특이적 샘플은 세포 아스피레이트, 뇌척수액, 흉막액, 낭종 및 복수액, 객담, 및 췌장 주스²일 수 있다. 전액은 상이한 유형의 암 유래 물질, 순환 종양 세포 (CTC), 또는 엑소좀 및 무세포 순환 종양 DNA (ctDNA)와 같은 단편을 함유할 수 있다. 핵산은 세포밖 소포(EVs)에 캡슐화되거나 세포 사멸 및 손상으로 인해 체액으로 방출될 수 있다. 순환 자유 DNA (cfDNA)는 주로 사멸 또는 괴사 세포로부터 혈류로 방출되며 모든 개체에 존재하며 염증성 또는 종양학 질환에서 증가 된 수준을 보여줍니다³. 엑소좀은 핵산, 단백질 및 지질을 포함하는 세포에 의해 분비되는 작은 세포밖 소포 (∼30-150 nm)이다. 이 소포는 세포 간 통신 네트워크의 일부를 형성하며 일반적으로 많은 유형의 체액에서 발견됩니다². EV 내부에 둘러싸인 핵산은 체액 내의 가혹한 환경으로부터 보호되므로 액체 생검 설정에서 이러한 분자를 연구하는보다 강력한 방법을 제공합니다.

전반적으로, 액체 생검 샘플에서 순환 핵산의 수준은 매우 낮기 때문에 디지털 PCR 또는 차세대 시퀀싱 (NGS)과 같은 검출에 민감한 방법이 필요합니다. 샘플의 사전 분석 관리는 혈액 세포 용해 및 손상되지 않은 DNA의 방출을 방지하여 cfDNA와 게놈 DNA의 오염을 일으키는 데 중요합니다. 또한, 효소 기반 분석 방법의 억제제의 존재를 피하기 위해 샘플을 추출 할 때주의해야합니다.

여기서 우리는 혈장 및 혈청 샘플의 수집 및 저장을위한 표준화 된 방법을 제시하며, 이는 순환 핵산 분석을 포함한 액체 생검 기반 하류 적용을위한 중요한 첫 번째 단계입니다.

혈액 샘플을 추출하기 전에 참여 센터에서 사전 윤리적 승인을 받았습니다. 혈청 및 혈장 분리를 위한 다음의 프로토콜은 생물의학 연구를 위한 윤리적 원리에 따라 수행되었다.

참고: 프로토콜을 시작하기 전에 미리 고려해야 할 사항이 여기에 나와 있습니다. 생물 의학 연구에서 인간 샘플을 사용하려면 사전 윤리적 승인이 필요하며 해당 정보에 입각 한 동의가 필요합니다. 혈액 샘플을 처리하기 위해 클래스 II 생물 안전 캐비닛이 필요합니다. 실험실 코트, 보호 장갑 및 안경은 혈액 매개 병원균에 의한 감염을 피하기 위해 절차 전반에 걸쳐 착용해야합니다. 혈청 샘플의 처리를 위해 최소 30분이 필요하다. 항응고제가없는 튜브에서 혈액을 추출 한 후 혈전 형성을 위해 실온 (RT)에서 30-45 분 동안 유지하십시오. 혈장 준비에는 최소 40분이 소요되며, 시료는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 튜브를 사용할 때 추출 시점으로부터 4시간 이내 또는 세포 안정화 수집 튜브 또는 특정 무세포 DNA 수집 튜브를 사용하는 경우 24-48시간 이내에 처리해야 합니다. 그러나 일부 제조업체에 따르면 샘플은 이러한 특수 튜브에서 최대 2 주 동안 안정적입니다. 용혈을 확인하는 것이 중요하며, 이는 혈장 또는 혈청 분획에 붉은 외관을 줄 것입니다. 토론에서 용혈된 샘플에 대한 문제 해결 섹션을 참조하십시오.

1. 액체 생검 연구를위한 혈청 준비

참고: 이 단계를 수행하는 데 필요한 총 시간은 30분입니다(그림 1).

1. 항응고제 (적색 또는 적색 / 회색 - 검은 색 뚜껑)가 들어있지 않은 튜브에서 4-10 mL의 혈액을 추출하고 RT에서 30-45 분 동안 유지하십시오. 추출 시점으로부터 4 시간 이내에 이러한 샘플을 처리하십시오.
2. 샘플 추출의 시간 및 날짜 및 피험자 식별(ID)을 적절하게 설계된 샘플 데이터베이스에 기록하십시오.
3. 실험실 코트, 보호 장갑 및 안경을 착용하고, 신선한 혈액이 들어있는 튜브를 RT (15°C-25°C)에서 1,600 (± 150) x g에서 10분 동안 원심분리하고, 최대 브레이크를 적용한다.
4. 원심분리 후, 조심스럽게 원심분리기에서 튜브를 제거; 혈청 상청액의 상층부는 맑고 황색을 띠게 될 것이다(그림 2). 샘플에 용혈의 징후가 나타나는지 확인하고(그림 3) 적절한 경우 용혈의 존재를 기록합니다.
5. 클래스 II 생물안전 캐비닛에서, 혈청을 250 μL 분취량으로 수집 튜브로 옮긴다.
   참고 : 분취량의 양은 연구 요구 사항에 맞게 조정되어야합니다.
6. 즉시 혈청을 -80°C의 저장 박스에 직립 동결시키고 샘플 저장 시간을 기록한다.
7. 샘플이 필요한 4시간 내에 처리되었는지 확인합니다.

2. 액체 생검 연구를위한 혈장 준비

참고: 이 단계를 수행하는 데 필요한 총 시간은 40분입니다(그림 4).

1. 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 튜브에서 4-10 mL의 혈액을 추출한다. 추출 시점부터 4 시간 이내에 샘플을 처리하십시오.
2. 샘플 추출의 시간과 날짜 및 주체 ID를 적절하게 설계된 샘플 데이터베이스에 기록합니다.
3. 실험실 코트, 보호 장갑 및 안경을 착용하고, EDTA 튜브를 RT (15°C-25°C)에서 1,600 (± 150) x g에서 10분 동안 원심분리하고, 최대 브레이크를 적용한다.
   주: 다른 수집 튜브를 사용할 때는 제조업체의 지침을 참조하십시오.
4. 원심분리 후, 혈장 상청액은 맑고 황색을 띤 것처럼 보일 것입니다. 샘플이 용혈의 징후를 보이는지 확인하고(그림 3), 일회용 혈청학적 피펫(또는 일회용 전구 피펫 또는 필터 팁이 있는 p1000 피펫)을 사용하여 세포층을 방해하지 않고 혈장(상층액)을 15 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 세포층 위에 플라즈마의 작은 잔류 부피를 남겨 둡니다 (약 5mm).
5. 용혈이 관찰되면 추가 분석을 위해 샘플을 폐기하십시오. (그림 5). 용혈을 평가하려면 토론의 문제 해결 섹션을 참조하십시오.
6. 혈장을 RT (15°C-25°C)에서 15 mL 원심분리 튜브에서 3,000 (±150) x g에서 10-20분 동안 원심분리한다 . 이 단계를 수행하여 첫 번째 원심분리 단계에서 이월된 잔류 손상되지 않은 혈액 세포를 제거하십시오.
7. 원심분리 후, 튜브를 원심분리기에서 조심스럽게 제거하고 일회용 혈청 학적 피펫 (또는 일회용 전구 피펫 또는 필터 팁이있는 p1000 피펫)을 사용하여 혈장 1-4 mL를 폴리프로필렌 극저온 바이알로 옮깁니다. 혈장이 혈액 세포로 오염되지 않도록 잔류 혈장 부피(약 0.3mL 또는 7mm 높이)를 튜브 바닥에 두어야 합니다(그림 5).
8. 혈장을 -80°C에서 보관 박스에 직립 즉시 동결시키고 샘플 저장 시간을 기록한다. 샘플이 필요한 4시간 내에 처리되었는지 확인합니다.
9. P1000을 이용하여 세포층(버피 코트)을 수집하고, 팁을 여과하고, 이를 2 mL 튜브로 옮긴다. 즉시 동결시키고 -80°C에서 보관한다.

항응고제 없이 혈액관을 원심분리한 후, 상층부는 옅은 노란색으로 나타나며 혈청 분획에 해당한다(도 2). 이 분획은 조심스럽게 제거되고 후속 분석을 위해 분취됩니다.

용혈은 혈장 또는 혈청 분획 중 하나에 존재할 수 있으며, 상상은 용혈의 존재 및 정도를 나타내는 붉은 외관을 가질 것이다 (그림 3).

EDTA 튜브의 원심분리 후, 여러 상 또는 층이 명백해질 것이다; 상부 상 (옅은 황색)은 총 혈액량의 55 %를 차지하는 혈장 분획입니다. 얇은 회백색 - 흰색 계면은 백혈구와 혈소판을 포함하고 총 혈액량의 <1 %를 차지하는 버피 코트 층입니다. 하부 단계 (붉은 색)에는 총 혈액량의 45 %를 차지하는 적혈구가 포함되어 있습니다. 백혈구층 1 cm 위에 흡인물을 흡인하고, 세포층이 교란되지 않도록 하여 혈장과 혈장의 오염을 감소시킨다(도 5). 이 분수는 신중하게 제거하고 후속 분석을 위해 분취해야합니다.

혈장 샘플로부터 추출된 cfDNA의 농도 및 완전성은 전기영동 기반 방법을 사용하여 평가되어야 한다. cfDNA는 시판되는 컬럼 기반 키트를 사용하여 추출하였다. 정량화는 cfDNA 용도에 특이적인 겔 기반 시판되는 키트를 사용하여 수행하였다(표 물질). 도 6A는 다운스트림 응용에 사용될 수 있는 고품질의 cfDNA 추출의 예를 도시한다. 반면, 도 6B 는 높은 수준의 게놈 오염을 갖는 부적합한 샘플의 예를 나타낸다.

그림 1: 액체 생검 연구를 위한 혈청 제제. 샘플 원심분리에서 분취액 저장에 이르기까지 혈청 준비 과정의 개요가 표시됩니다. 단계 1: 혈청의 단리를 위한 항응고제가 없는 튜브에 혈액 샘플. 단계 2: 혈액관을 원심분리하여 추출 후 4 h 이내에 혈청을 얻는다. 단계 3: 후속 저장을 위해 혈청 상청액의 상층부를 제거한다. 4 단계 : 혈청 튜브를 -80 °C에서 똑바로 고정 하십시오.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 원심분리 후 항응고제가 없는 튜브에서 채취한 혈액 샘플. 상위는 혈청 분획에 상응한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3: 원심분리 후 용혈된 샘플의 예. 혈장 / 혈청 분획에 해당하는 상위는 용혈로 인해 빨간색으로 나타납니다. 이상적으로는, 이들 샘플은 폐기되어야 하거나, 샘플 내의 용혈의 존재는 일부 다운스트림 적용에 영향을 미칠 수 있기 때문에 기록되어야 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 액체 생검 연구를 위한 혈장 준비. 샘플 원심분리에서 분취량 및 버피 코트 수집의 저장에 이르기까지 혈청 준비 과정의 개요가 표시됩니다. 단계 1: 혈장의 단리를 위해 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 튜브 내의 혈액 샘플. 단계 2: 혈액관을 원심분리하여 추출 후 4시간 이내에 혈장을 얻는다. 단계 3: 혈장 상청액을 세포층을 방해하지 않고 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴다. 단계 4: 혈장을 원심분리하여 첫 번째 원심분리 단계로부터 이월된 임의의 혈액 세포를 제거한다. 단계 5: 혈장을 극저온 바이알로 옮기고 -80°C에서 혈장 튜브를 직립 동결시킨다. 6 단계 : 세포 층 (버피 코트)을 수집하고 -80 °C에서 보관 하십시오.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 5: 원심분리 후의 EDTA 혈액 샘플. 세 개의 가시적 인 층은 신선한 혈액을 함유 한 튜브의 원심 분리 후에 볼 수 있습니다. 상층은 혈장 분획에 해당하고, 얇은 회백색 계면은 버피 코트에 해당하며 백혈구와 혈소판을 포함하고, 하단 상은 적혈구를 포함합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 6: 혈장으로부터 분리된 cfDNA의 전기영동 기반 분석 . (A) 최적 실험의 예. (B) 차선책의 실험의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Beatriz Bellosillo (BB): BB는 Amgen, Astra-Zeneca, Biocartis, Janssen, Merck-Serono, Novartis, Qiagen, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Pfizer 및 BMS로부터 연사, 컨설팅 또는 자문 역할로 영예를 안았습니다. Sara López-Tarruella (SL): SL은 Astra-Zeneca/Daiichi-Sankyo, MSD, Novartis, Pfizer, Roche Pharma, Gilead, Lilly, Pierre Fabre, Seagen, GlaxoSmithKline 및 Veracyte로부터 연사, 컨설팅 또는 자문 역할로 영예를 안았습니다. Noelia Tarazona (NT): NT는 Amgen, Pfizer, Merck-Serono, Servier, SEOM 및 ESMO로부터 연사, 컨설팅 또는 자문 역할로 영예를 받았습니다. Javier Hernandez-Losa (JHL): Astra-Zeneca, Janssen, Novartis, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Lilly 및 Diaceutics로부터 연사, 컨설팅 또는 자문 역할로 영예를 안았습니다. Rodrigo Toledo (RT)는 노바티스로부터이 연구와 관련된 연구 보조금을 받고 AstraZeneca와 Beigene으로부터이 연구와 관련이없는 연구 보조금을보고합니다. 나머지 저자들은 원고와 관련하여 공개되지 않습니다.