Method Article

배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 세포외 소포의 분리, 특성화 및 치료적 적용

DOI:

10.3791/64135

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September 23rd, 2022

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1College of Life Science, Northwest University, 2State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, Fourth Military Medical University, 3Xi'an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 4School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, 5Department of Orthodontics, School of Stomatology, Fourth Military Medical University

In This Article

Summary

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본 프로토콜은 배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 대표적인 EV(엑소좀 및 마이크로베시클)를 분리하고 특성화하기 위한 차등 원심분리를 설명합니다. 이러한 EV의 추가 응용 프로그램도 이 기사에서 설명합니다.

Abstract

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세포외 소포(EV)는 대부분의 세포 유형에서 방출되는 이질적인 막 나노입자이며 유기체 항상성의 생리학적 조절자 및 병리학의 중요한 지표로 점점 더 인식되고 있습니다. 한편, 접근 가능하고 통제 가능한 질병 치료제를 확립할 수 있는 엄청난 잠재력이 나타나고 있습니다. 중간엽 줄기 세포(MSC)는 배양 시 다량의 EV를 방출할 수 있으며, 이는 효과적인 조직 재생을 촉진하고 우수한 확장성과 재현성으로 광범위한 치료 적용을 촉진할 수 있는 가능성을 보여주었습니다. MSC-EV를 수집하고 적용하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜에 대한 요구가 증가하고 있습니다. 여기서는 추가 응용 분야를 위해 배양된 인간 중간엽, 엑소좀 및 마이크로베지클에서 대표적인 EV를 분리하고 특성화하기 위해 차등 원심분리를 기반으로 하는 상세한 프로토콜이 제공됩니다. 이 방법의 적응성은 라벨링, 국소 이식 및 전신 주입과 같은 일련의 다운스트림 접근 방식에 대해 표시됩니다. 이 절차의 구현은 중개 연구에서 간단하고 신뢰할 수 있는 MSC-EV 수집 및 적용의 필요성을 해결할 것입니다.

Introduction

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줄기세포는 자가 재생 능력과 번역 잠재력이 있는 미분화 만능 세포입니다1. 중간엽 줄기세포(MSC)는 실험실에서 쉽게 분리, 배양, 확장 및 정제되며, 이는 여러 번 계대배양한 후에도 줄기세포의 특성을 유지합니다. 최근 몇 년 동안, 중간엽 줄기세포가 치료적 용도에서 측분비 방식으로 작용한다는 견해를 뒷받침하는 증거가 증가하고 있다 2,3. 특히 세포외 소포체(EV)의 분비는 중간엽 줄기세포의 생물학적 기능을 매개하는 데 중요한 역할을 합니다. 대부분의 세포 유형에서 방출되는 이질적인 막 나노입자인 EV는 엑소좀(Exos), 미세소포(MV) 및 더 큰 세포자멸사체(4,5)라는 하위 범주로 구성됩니다. 그 중 엑소스는 40-150nm 크기로 가장 널리 연구된 EV로 엔도솜 기원이며 생리학적 조건에서 활발하게 분비됩니다. MV는 직경 100-1,000nm의 세포 원형질막 표면에서 직접 탈락하여 형성되며, 이는 포스파티딜세린의 높은 발현과 공여 세포의 표면 마커의 발현을 특징으로 한다6. EV에는 RNA,....

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Protocol

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모든 동물 시술은 제4군 의과대학 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 국립 보건원(National Institutes of Health Guide)의 실험 동물 관리 및 사용 가이드(National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행되었습니다. 8주령의 C57Bl/6 마우스(암컷 또는 수컷 모두 선호 없음)를 사용했습니다. 본 연구에 사용된 냉동보존된 인간 탯줄 유래 중간엽(UCMSC)은 상업적 공급원으로부터 입수하였다( 재료 표 참조). 인간 세포의 사용은 제 4 군 의과 대학 윤리위원회의 승인을 받았습니다.

1. 인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 배양

  1. 피펫, 피펫 팁, 10cm 페트리 접시, 자동 온도 조절 장비(수조), 고무 장갑, 75% 알코올, 배양 배지(37°C에서 배양), 치명적인 소 혈청(FBS) 및 100x 페니실린-스트렙토마이신(P/S) 용액( 재료 표 참조).
  2. 20% FBS와 1% P/S를 보충하여 시중에서 판매되는 α-MEM(alpha-Minimum Essential Medium)을 ....

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Results

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배양된 인간 UCMSC의 MV 및 엑소는 실험 워크플로우에 따라 분리됩니다(그림 1). NTA 결과는 인간 중간엽 줄기세포의 엑소 크기가 40nm에서 335nm까지 범위이고 피크 크기가 약 100nm이고 MV의 크기가 50nm에서 445nm이고 피크 크기가 150nm임을 보여줍니다(그림 2). MSC 유래 엑소의 형태학적 특성은 전형적인 컵 모양을 나타냅니다(그림 3). EV는 PKH26에 의해 효율적으로 라벨링되며, 이는 라벨링된 펠릿과 형광 현미경으로 전체적으로 관찰됩니다(그림 4). MSC 유래 EV의 국소 및 전신 주사는 피부 상처 주위 또는 꼬리 정맥을 통해 수행됩니다(그림 5). 따라서, 엑소 및 MV는 성공적으로 분리되고 후속 실험에 적용된다.

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Discussion

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EV는 항원 제시, 유전 물질 수송, 세포 미세 환경 변형 등을 포함한 다양한 생물학적 활동에서 중요한 역할을 하기 위해 부상하고 있습니다. 또한, 질병의 광범위한 적용은 질병의 진단과 치료를 위한 새로운 접근법과 기회를 제공한다21. EV의 치료 응용 구현은 성공적인 분리 및 특성화를 기반으로 합니다. 그러나 표준화된 분리 및 정제 방법의 부족과 낮은 추출 효율로 인해 EV 연구가 방해를 받고 있습니다. 이 기사는 주로 배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 EV의 쉽게 실현 가능한 추출 및 특성화 프로토콜과 국소 주사를 통해 조직 복구를 촉진하고 정맥 주사로 전신 질환을 치료하는 데 라벨링 및 사용할 수 있는 추가 응용 프로그램을 소개합니다. EV 분리를 위한 중간엽 줄기세포의 재현성은 UCMSC의 신생아 기원, 세포의 표준 배양 및 후기 계대 없음을 사용하여 보존됩니다. 이 원고에서는 각각 엑소스와 MV라는 용어가 차등 원심분리 속도에서 수집된 EV를 지칭하는 데 사용되었.......

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Disclosures

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (32000974, 81930025 및 82170988)과 중국 박사후 과학 재단 (2019M663986 및 BX20190380)의 보조금으로 지원되었습니다. 우리는 기초 의학을위한 국립 실험 교육 시범 센터 (AMFU)와 공군 의과 대학 군사 의료 혁신 센터의 분석 및 테스트 중앙 연구소의 도움에 감사드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10% 포비돈-요오드 (베타딘)Weizhenyuan10053956954292상처 소독
보정 용액입자 Metrix110-0020NTA 기기 보정
CarprofenSigma53716-49-7진통제
꼬리 정맥 이미저 KEW 생명 과학KW-XXY꼬리 정맥 이미저
원심분리기Eppendorf5418R원심분리
치명적 소 혈청Corning35-081-CVUCMSCs Formvar
/carbon-coated square meshPBL Assay Science의24916-25투과 전자 현미경
가열 패드Zhongke Life ScienceZ8G5JBMz동물 후처리 관리
헤파린 용액StemCell7980전신 주입
IsofluraneRWD 생명 과학R510-22동물 마취
최소 필수 매체 알파 베이직 (1x)GibcoC12571500BT배양 UCMSCs
나노 입자 추적 분석기Particle MetrixZetaView PMX120나노 입자 추적 분석
PBS (1x)MeilunbioMA0015Resuspend EV
페니실린 / 스트렙토 마이신프로셀 생명 과학PB180120 UCMSCs
포스 포 텅스텐 산배양 Solarbio12501-23-4투과 전자 현미경
피펫Eppendorf3120000224
PKH26 적색 형광 세포 링커 키트Sigma-AldrichMINI26라벨링 EV
피부 생검 펀치Acuderm69038-10-50피부 결함
소프트웨어 ZetaViewParticle Metrix버전 8.05.14 SP7 
온도 조절 장비Grantv-0001-0005수조
투과 전자 현미경HITACHIHT7800투과 전자 현미경
UCMSCsBai'ao UKK220201상업적으로 UCMSCs
초원심분리기BeckmanXPN-100원심분리
초순수 여과수 정화 시스템Milli-QIQ 7000초순수 준비
배양;

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, S., et al. The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619(2020).
  2. Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S.

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Mesenchymal Stem CellsExtracellular VesiclesDifferential CentrifugationMicrovesicle IsolationExosome CharacterizationNanoparticle TrackingFluorescence MicroscopyPKH26 LabelingSystemic InjectionTissue Regeneration

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