인지질 매개체는 3차원 배양에서 형질전환을 유도했습니다.

요약

본 프로토콜은 혈소판 활성화 인자(PAF) 유도 형질전환을 연구하기 위해 변형된 형질전환되지 않은 유방 상피 세포주인 MCF10A의 3D '온탑 ' 배양의 설정을 설명합니다. 면역-형광은 형질전환을 평가하기 위해 사용되었으며 상세히 논의된다.

초록

설치류 모델 및 확립 된 세포주와 같은 암을 연구하기 위해 여러 모델이 개발되었습니다. 발암에 대한 귀중한 통찰력은 이러한 모델을 사용한 연구에 의해 제공되었습니다. 세포주는 유방 종양 발생과 관련된 분자 신호 전달의 조절 완화에 대한 이해를 제공하는 반면, 설치류 모델은 생체 내에서 유방암의 세포 및 분자 특성을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 유방 상피 및 암세포의 3D 배양의 확립은 in vivo 조건을 모방하여 in vivo 모델과 in vitro 모델 사이의 격차를 해소하는 데 도움이 됩니다. 이 모델은 복잡한 분자 신호 전달 이벤트의 조절 완화와 유방 발암 중 세포 특성을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서, 인지질 매개체-유도(혈소판 활성화 인자, PAF) 형질전환을 연구하기 위해 3D 배양 시스템을 변형한다. 면역 조절제 및 기타 분비 된 분자는 유방에서 종양 시작 및 진행에 중요한 역할을합니다. 본 연구에서, PAF에 노출된 유방 상피 세포의 3D acinar 배양물은 극성 손실 및 변경된 세포 특성과 같은 형질전환 특성을 나타내었다. 이 3D 배양 시스템은 종양 미세 환경에서 다양한 소분자 개체에 의해 유도된 유전적 및/또는 후성유전학적 섭동을 밝히는 데 도움이 됩니다. 또한, 이 시스템은 또한 형질전환 과정에 관여할 수 있는 신규한 유전자뿐만 아니라 알려진 유전자의 식별을 위한 플랫폼을 제공할 것이다.

서론

암의 진행을 연구하기 위해 수많은 모델을 사용할 수 있으며, 각 모델은 고유하며이 복잡한 질병의 하위 유형을 나타냅니다. 각 모델은 암 생물학에 대한 독특하고 가치 있는 통찰력을 제공하며 실제 질병 상태를 모방하는 수단을 개선했습니다. 단일층으로 성장한 확립된 세포주는 증식, 침습성, 이동 및 세포자멸사와 같은 시험관 내 중요한 과정에 대한 귀중한 통찰력을^{제공했습니다1.} 2차원(2D) 세포 배양이 여러 환경 섭동에 대한 포유류 세포의 반응을 조사하는 전통적인 도구였지만 조직 수준 반응을 예측하기 위한 이러한 발견의 외삽은 충분히 설득력이 없어 보입니다. 2D 배양의 주요 한계는 생성 된 미세 환경이 유방 조직 자체의 미세 환경과 크게 다르다는 것입니다². 2D 배양은 세포와 세포 외 기질의 상호 작용이 부족하며, 이는 모든 조직의 성장에 필수적입니다. 또한 단층 배양에서 세포가 경험하는 인장력은 이러한 세포의 극성을 방해하여 세포 신호 전달 및 거동 ^3,4,5를 변경합니다. 3차원(3D) 배양 시스템은 체외 <....

프로토콜

1. lrECM에 MCF10A 세포 파종

1. MCF10A 세포(부착성 유방 상피 세포)를 성장 배지에 유지합니다. 4 일마다 세포를 계대하십시오.
   참고: 성장 배지의 구성: 말 혈청(5%), 인슐린(10μg/mL), 하이드로코르티손(0.5μg/mL), 표피 성장 인자, EGF(20ng/mL), 콜레라 독소(100ng/mL) 및 페니실린-스트렙토마이신(100단위/mL)을 포함하는 나트륨 피루브산이 없는 고포도당 DMEM( 재료 표 참조).
2. 실험 시작 20분 전에 얼음에서 lrECM( 재료 표 참조)을 해동합니다. 세포를 파종하는 날은 일반적으로 Day 0으로 간주됩니다.
3. 세포를 트립신화하기 위해, 배지를 흡인하고, 2 mL의 PBS로 세척한다. 900 μL의 0.05 % 트립신 -EDTA를 추가하고 ~ 15 분 동안 또는 세포가 완전히 트립신 화 될 때까지 37 ° C에서 배양합니다.
4. 챔버 커버 유리 슬라이드의 8 개 웰에 lrECM 베드를 준비하십시오 ( 재료 표 참조).
   1. 세포가 트립시니징 중일 때, 각 웰을 60 μL의 lrECM으로 코팅하고 최대 15분 동안 37°C_CO2

결과

MCF10A 세포는 PAF 치료에 노출되면 매우 뚜렷한 표현형을 가진 아시나 구조를 형성합니다. α6-인테그린은 더 많은 정점 염색으로 잘못 국소화된 것으로 밝혀졌습니다. 몇몇 acini는 또한 불연속 염색을 나타내었다 (도 2A). 이 두 표현형은 문헌^24,25에서 입증 된 바와 같이 기저 극성의 상실을 나타냅니다. 이전 보고서는 암 전이에서 α6-인테그린의 논란의 여지가 있는 역할을 나타냅니다. α6- 인테그린은 β1- 또는 β4- 인테그린과 함께 이량 체로 존재합니다. α6β4 서브유닛은 상피 세포에서 헤미데스모솜을 형성하는데 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다²⁶. 이 인테그린의 하향 조절은 전립선 및 유방암의 일부 사례에서 발견되었으며, 여기서 α6β4- 인테그린의 손실은 유방의 유관 암종 (등급 III)에서 발견되었습니.......

토론

확립 된 세포주 기반 모델은 발암 과정을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 세포의 단일층 배양은 암세포의 특징적인 변화를 매개하는 다양한 분자 신호전달 경로에 대한 통찰력을 지속적으로 제공한다³². Ras, Myc 및 돌연변이 된 p53과 같은 잘 알려진 종양 유전자의 역할에 대한 연구는 단층 배양을 모델 시스템^33,34,35,36으로 사용하여 처음보고되었습니다. 그러나, 2D 배양 모델은 생체 내에 존재하는 많은 중요한 구조적 및 기능적 파라미터가 결여되어 있다. 2D 배양에서 약물 스크리닝 연구는 종종 낮은 농도에서도 유의미한 반응(세포 사멸 또는 표적 억제)을 보인 반면, 마우스³⁷에서 관찰했을 때.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.05% 트립신 EDTA	인비트로젠	25300062
16% 파라포름알데히드	Alfa Aesar	AA433689M
안티 마우스 Alexa Flour 488	Invitrogen	A11029
안티 토끼 Alexa Flour 488	Invitrogen	A-11008
BSA	Sigma	A7030
챔버 커버 글라스	Nunc
콜레라 독소	Sigma	C8052-1MG	dH2O에서 1mg/mL
컨포칼 현미경	Leica	Leica SP8
DMEM	Gibco	11965126
EDTA	Sigma	E6758
EGF	Sigma	E9644-0.2MG	dH2O
에서 100mg/mLF(ab')2 마우스 항원에 대해 염소에서 배양된 항체 단편	Jackson Immunoresearch	115-006-006
GM130 항체	Abcam	ab52649
염소 혈청	Abcam	ab7481
Hoechst	Invitrogen	33258
호스 혈청	Gibco	16050122
Hydrocortisone	Sigma	H0888	1 에탄올에 포함된 mg/mL
이미지 처리 소프트웨어	ImageJ
Insulin	Sigma	I1882	10 mg/mL 재고 dH2O
lrECM (Matrigel)	Corning	356231
마운팅 시약 (Slow fade Gold Anti-fade)	Invitrogen	S36937
핵 염색  (훅스트)	Invitrogen	33258
PAF	케이맨 화학 물질	91575-58-5	메틸 카르 바밀 PAF C-16, 에탄올
페니실린 - 스트렙토 마이신	Lonza	17-602E
아지드 나트륨	시그마	S2002
트리스베이스	시그마	B9754
트리톤 X-100	시그마	T8787
트윈 20	시그마	P9416
Vimentin 항체	Abcam	ab92547
α 6-integrin 항체	Millipore	MAB1378

155409에서 10 mg / mL로 조달