여기서 우리는 출생 후 마우스의 중추 신경계의 다른 영역에서 유래 된 성상 세포의 고도로 농축 된 배양물을 생성하고 전사 인자의 강제 발현에 의해 기능적 뉴런으로 직접 전환시키는 상세한 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
직접 뉴런 재 프로그래밍은 다능성 중간체를 통과하지 않고 다른 스타터 세포 집단에서 기능적 뉴런을 생성하는 강력한 접근법입니다. 이 기술은 신경 퇴행성 질환을 앓고있는 환자의 섬유 아세포를 뉴런으로 전환 할 수 있기 때문에 질병 모델링 분야에서 큰 약속을 지닐뿐만 아니라 세포 기반 대체 요법에 대한 유망한 대안을 나타냅니다. 이러한 맥락에서, 주요한 과학적 돌파구는 성상세포와 같은 중추신경계 내에서 분화된 비신경세포가 시험관내에서 기능적 뉴런으로 전환될 수 있다는 것을 입증하는 것이었다. 그 이후로, 성상세포를 뉴런으로 시험관 내에서 직접 재프로그래밍하는 것은 강제 정체성 변환의 기초가 되는 분자 메커니즘과 효율적인 재프로그래밍을 방해하는 장애물에 대한 실질적인 통찰을 제공했다. 그러나, 상이한 실험실에서 수행된 시험관내 실험으로부터의 결과는 성상세포를 분리, 배양 및 재프로그래밍하는데 사용되는 방법의 차이로 인해 비교하기가 어렵다. 여기에서는 자기 세포 분류를 통해 출생 후 생쥐의 중추 신경계의 다른 영역에서 고순도의 성상 세포를 안정적으로 분리하고 배양하는 상세한 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 바이러스 형질도입 또는 DNA 형질감염을 통해 배양된 성상세포를 뉴런으로 재프로그래밍하는 프로토콜을 제공합니다. 이 간소화되고 표준화 된 프로토콜은 세포 동일성 유지의 기초가되는 분자 메커니즘, 새로운 신경 정체성의 확립, 특정 신경 아류형의 생성 및 그 기능적 특성을 조사하는 데 사용될 수 있습니다.
서론
포유동물 중추신경계(CNS)는 매우 복잡하며, 방대한 수의 상이한 뉴런 아형 1,2,3,4,5,6을 포함하는 수백 개의 상이한 세포 유형들로 구성된다. 다른 기관 또는 조직 7,8,9와는 달리, 포유동물 CNS는 매우 제한된 재생 능력을 갖는다; 외상성 뇌 손상 또는 신경 변성에 따른 신경 세포 손실은 돌이킬 수 없으며 종종 운동 및인지 결핍을 초래합니다10. 뇌 기능을 구하기 위해 잃어버린 뉴런을 대체하기위한 다양한 전략이 집중적 인 조사를 받고 있습니다11. 그 중에서도, 체세포를 기능적 뉴런으로 직접 재프로그래밍하는 것은 유망한 치료 접근법12....
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프로토콜
다음 절차는 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 지침 2010/63/EU에 따라 헬름홀츠 젠트럼 뮌헨의 동물 관리 지침을 따릅니다. 해부가 수행되는 기관의 동물 관리 지침을 준수하십시오.
1. 해부, 해리 및 배양 재료의 준비
참고: 생물학적 안전 캐비닛 내의 모든 배양 시약을 준비하고 오토클레이브 또는 멸균 장비만 사용하여 작업하십시오. 해부 및 해리 시약은 생물학적 안전 캐비닛 외부에서 제조될 수 있다.
- T25 배양 플라스크를 H2O에 폴리-D-라이신 (스톡 1 mg/mL; 작업 용액 20 μg/mL)으로 코팅하여 배양 플라스크를 최소2시간 동안 준비한다. 그런 다음H2O로 3x 헹구고 공기 건조하십시오.
- 행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS) 500 mL에 1 M HEPES 완충액 5 mL를 첨가하여 해부 완충액을 준비하십시오.
- 신경 조직 해리 키트로부터 1950 μL의 완충액 X를 첨가하여 여섯 척수 당 하나의 C-튜브 ( 물질 표 참조)를 준비 하십시오 (자료 표 참조). 해부 중에 얼음에 보관....
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결과
성상세포의 일차 배양은 일반적으로 MAC 분류 및 도금 후 7 일에서 10 일 사이에 80 % -90 % 합류율에 도달합니다 (그림 1B). 일반적으로, 단일 T25 배양 플라스크는 약 1-1.5 x 106 세포를 산출하며, 이는 웰 당 5-5.5 x 104 세포의 밀도로 세포를 시딩할 때 20-30 커버슬립에 충분하다. 도금 다음 날, 전지는 일반적으로 커버슬립 표면의 50%-60%를 덮는다(그림 1C). 이 단계에서 배양물은 거의 독점적으로 성상세포로 구성되어 있는 반면, 신경아세포와 같은 다른 세포 유형은 사실상 존재하지 않는다(그림 1D)29.
리프로그래밍 인자는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 형질도입을 통해 또는 DNA 플라스미드.......
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토론
뮤린 성상세포의 일차 배양은 직접적인 뉴런 재프로그래밍을 연구하는 놀라운 시험관내 모델 시스템이다. 실제로, 출생 후 단계에서 단리되었음에도 불구하고, 세포는 전형적인 성상세포 마커(29)를 발현하고, 패터닝 유전자(28,29)의 발현을 유지하며,38세에 생체내 성상세포와 유사하게 증식하는 능력을 유지한다. MACS-매개 단리 후, 세포는 먼저 플라스크에 부착 한 다음 증식하기 시작하여 고도로 농축 된 성상 세포 배양29을 일으킨다. 중요하게도, 배양된 성상세포는 다분화능 세포 상태로 탈분화되거나 불멸화되지 않는다는 것이다. 더욱이, 이들은 리포터 단백질 (예를 들어, DsRed 또는 GFP)의 발현 이후에 자발적으로 뉴런을 생성하지 않지만, 성상세포 동일성을 유지한.......
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 재 프로그래밍을위한 구조를 복제 한 Ines Mühlhahn, 바이러스 생산을위한 Paulina Chlebik, 원고에 대한 의견에 대한 Magdalena Götz와 Judith Fischer-Sternjak에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 트립신/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-디아미디노-2-페닌돌, 딜락테이트(DAPI) | 시그마-알드리치 | D9564 | |
| 안티-마우스 IgG1 알렉사 647 | 써모 피셔 | A21240 | |
| 안티-마우스 IgG1 비오틴 | 서던바이오텍 | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| 안티 마우스 IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| 안티 래빗 Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| 아쿠아 폴리/마운트 | 폴리사이언스 | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | 라이프 테크놀로지 | 13256029 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | 시그마-알드리치 | Cat# A9418 | |
| cAMP | 시그마 알드리치 | D0260 | |
| C-튜브 | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | 라이프 테크놀로지 | 21331020 | |
| 도르소모르핀 | 시그마 알드리치 | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| 소 태아 혈청 | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70&마이크로; m | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS 분리기 | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| 마우스 anti-ACSA-2 MicroBeat 키트 | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| 마우스 IgG1 항-Synaptophysin 1 | 시냅스 시스템 | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| 마우스 IgG2b 항-Tuj-1 (β III-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS 컬럼 | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS 분리기 | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (혈청 감소 매체) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| 토끼 안티 Sox9 | 시그마-알드리치 | 고양이# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
참고문헌
- Johnson, T. S., et al. Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing. Scientific Reports. 10 (1), 18014(2020).
- Lake, B. B., et al.
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