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방법 논문

유세포분석을 통한 노화 종양 세포의 식별 및 농축을 위한 원적색 형광 노화 관련 β-갈락토시다아제 프로브

5.7K 조회수

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DOI:

10.3791/64176

⸱

2022년 9월 13일

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

이 논문에서

요약

세포 배양 또는 쥐 종양 모델에서 화학 요법 약물에 의해 유도 된 노화 암 세포의 형광, 유세포 측정 정량화를위한 프로토콜이 제시된다. 선택적 절차에는 공동 면역염색, 대규모 배치 또는 시점 분석을 용이하게 하기 위한 샘플 고정, 유세포 분석 분류에 의한 생존 가능한 노화 세포의 농축이 포함됩니다.

초록

세포 노화는 노화 세포에서 일반적으로 수년에 걸쳐 발생하는 생물학적 손상에 의해 유발되는 증식 정지 상태이지만 다양한 암 치료에 의해 유발 된 손상에 대한 반응으로 종양 세포에서도 빠르게 나타날 수 있습니다. 종양 세포 노화는 노화 세포가 사멸에 내성을 갖게되고 종양 완화를 차단하면서 종양 악성 종양 및 치료 내성을 악화시키기 때문에 일반적으로 바람직하지 않은 것으로 간주됩니다. 따라서 노화 종양 세포의 식별은 암 연구 커뮤니티의 지속적인 관심사입니다. 다양한 노화 분석이 존재하며, 많은 것이 잘 알려진 노화 마커인 노화 관련 베타-갈락토시다아제(SA-β-Gal)의 활성을 기반으로 합니다.

일반적으로 SA-β-Gal 분석은 고정 된 세포에 발색 기질 (X-Gal)을 사용하여 수행되며 광학 현미경으로 "파란색"노화 세포를 느리고 주관적으로 열거합니다. C12-FDG(녹색) 및 DDAO-갈락토사이드(DDAOG; far-red)를 포함한 세포 투과성 형광 SA-β-Gal 기질을 사용한 개선된 분석은 살아있는 세포의 분석을 가능하게 하고 유세포분석기를 포함한 고처리량 형광 분석 플랫폼의 사용을 가능하게 했습니다. C12-FDG는 SA-β-Gal에 대해 잘 문서화 된 프로브이지만 녹색 형광 방출은 리포 푸신 응집체의 축적으로 인해 노화 중에 발생하는 고유 세포자가 형광 (AF)과 겹칩니다. 원적색 SA-β-Gal 프로브 DDAOG를 활용하여 녹색 세포 자가형광을 노화를 확인하기 위한 보조 파라미터로 사용하여 분석에 신뢰성을 더할 수 있습니다. 나머지 형광 채널은 세포 생존율 염색 또는 선택적인 형광 면역표지에 사용될 수 있다.

유세포 분석을 사용하여 노화 종양 세포의 식별을 위한 이중 매개변수 분석으로 DDAOG 및 리포푸신 자가형광을 사용하는 것을 입증합니다. 생존 가능한 노화 세포의 백분율의 정량이 수행됩니다. 원한다면, 관심있는 세포 표면 항원을 평가하기 위해 선택적인 면역표지 단계가 포함될 수 있다. 확인된 노화 세포는 또한 유세포 분석기로 분류되고 다운스트림 분석을 위해 수집될 수 있습니다. 수집된 노화 세포는 즉시 용해되거나(예를 들어, 면역검정 또는 '오믹스 분석을 위해) 추가로 배양될 수 있다.

서론

노화 세포는 정상적인 생물학적 노화 동안 일반적으로 수년에 걸쳐 유기체에 축적되지만 방사선 및 화학 요법을 포함한 다양한 암 치료에 의해 유발 된 손상에 대한 반응으로 종양 세포에서도 빠르게 발전 할 수 있습니다. 더 이상 증식하지는 않지만 치료 유도 노화(TIS) 종양 세포는 치료 내성에 기여하고 재발을 유발할 수 있습니다1,2,3. TIS 세포에 의해 분비되는 인자는 면역 회피 또는 전이를 촉진하여 종양 악성 종양을 악화시킬 수 있습니다 4,5. TIS 세포는 복잡한 상황별 표현형, 변경된 대사 프로필 및 고유한면역 반응을 발달시킵니다6,7,8. 따라서 다양한 암 치료 접근법에 의해 유도 된 TIS 종양 세포의 확인 및 특성화는 암 연구 커뮤니티의 지속적인 관심 주제입니다.

TIS 종양 세포를 검출하기 위해, 종래의 노화 분석은 주로 노화 마커 효소 인 리소좀 베타-갈 락토시다 제 GLB19의 증가 된 활성을 검출하는 것에 기초하여 널리 사용된다. 중성에 가까운(산성이 아닌) 리소좀 pH에서 검출하면 노화 관련 베타-갈락토시다아제(SA-β-Gal)를 특이적으로 검출할 수 있습니다10. 수십 년 동안 사용되어 온 표준 SA-β-Gal 분석은 청색 발색 베타 갈락토시다제 기질인 X-Gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드)을 사용하여 광학 현미경으로 고정 세포에서 SA-β-Gal을 검출합니다11. X-Gal 분석을 통해 일반적으로 사용 가능한 시약 및 실험실 장비를 사용하여 TIS를 정성적으로 시각적으로 확인할 수 있습니다. 기본 투과광 현미경은 청색 발색의 존재를 평가하는 데 필요한 유일한 기기입니다. 그러나 X-Gal 염색 절차는 감도가 부족할 수 있으며 때로는 색상이 발생하는 데 24시간 이상이 필요합니다. 염색 후에는 광학 현미경으로 청색 발색의 강도 수준을 나타내는 세포를 계수하는 것을 기반으로 개별 노화 세포의 낮은 처리량, 주관적인 점수가 이어집니다. X-Gal은 세포 불투과성이므로 이 분석에는 다운스트림 분석을 위해 회수할 수 없는 용매 고정 세포가 필요합니다. 동물이나 환자의 제한된 샘플로 작업 할 때 이는 큰 단점이 될 수 있습니다.

C12-FDG(5-도데카노일아미노플루오레세인 디-β-D-갈락토피라노사이드, 녹색) 및 DDAOG(9H-(1,3-디클로로-9,9-디메틸아크리딘-2-온-7-일)β-D-갈락토피라노사이드, 원적색)를 포함한 세포 투과, 형광 효소 기질을 사용하는 개선된 SA-β-Gal 분석은 이전에 문헌12,13,14,15에 나타났습니다. DDAOG의 화학적 프로브 구조 및 광학적 특성은 보충 그림 S1에 나와 있습니다. 이러한 세포 투과성 프로브를 사용하면 고정되지 않은 살아있는 세포를 분석할 수 있으며, 발색성 프로브가 아닌 형광 프로브는 고함량 스크리닝 기기 및 유세포분석기를 포함한 신속한 고처리량 형광 분석 플랫폼의 사용을 용이하게 합니다. 분류 유세포분석기는 다운스트림 분석(예: 웨스턴 블로팅, ELISA 또는 'omics)을 위해 세포 배양 또는 종양으로부터 살아있는 노화 세포의 농축 개체군을 회수할 수 있습니다. 형광 분석은 또한 정량적 신호를 제공하여 주어진 샘플 내에서 노화 세포의 백분율을 보다 정확하게 결정할 수 있습니다. 생존성 프로브 및 형광단 표지 항체를 포함한 추가 형광 프로브를 쉽게 추가하여 SA-β-Gal 이상의 표적을 다중화 분석할 수 있습니다.

DDAOG와 유사하게 C12-FDG는 SA-β-Gal의 형광 프로브이지만 녹색 형광 방출은 세포16에 리포푸신 응집체가 축적되어 노화 중에 발생하는 고유 세포 AF와 겹칩니다. 원적색 DDAOG 프로브를 활용하여 녹색 셀룰러 AF를 노화를 확인하기 위한 보조 매개변수로 사용할 수 있습니다17. 이는 SA-β-Gal 외에 두 번째 마커를 사용하여 분석 신뢰성을 향상시키는데, 이는 종종 노화18에 대한 단일 마커로서 신뢰할 수 없을 수 있습니다. 노화 세포에서 내인성 AF의 검출은 표지가 없는 접근 방식이므로 DDAOG 기반 분석의 특이성을 확장하는 빠르고 간단한 방법입니다.

이 프로토콜에서 우리는 시험관 내 배양에서 생존 가능한 TIS 종양 세포를 식별하거나 마우스에서 확립된 약물 처리 종양에서 분리하기 위한 신속한 이중 매개변수 유세포분석 분석으로 DDAOG 및 AF를 사용하는 것을 보여줍니다(그림 1). 이 프로토콜은 광범위한 표준 상용 유세포분석 분석기 및 분류기와 호환되는 형광단을 사용합니다(표 1). 표준 유세포분석 분석을 이용한 생존가능한 노화 세포의 백분율의 정량이 가능하다. 원한다면, 선택적인 면역표지 단계를 수행하여 관심있는 세포 표면 항원을 노화와 동시에 평가할 수 있다. 확인된 노화 세포는 표준 형광 활성화 세포 분류(FACS) 방법론을 사용하여 농축할 수도 있습니다.

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그림 1: 실험적 워크플로. DDAOG 분석의 요점을 요약한 개략도. (a) TIS 유도 약물을 포유동물 배양 세포에 첨가하거나 종양 보유 마우스에 투여한다. 그런 다음 TIS의 발병에 시간이 허용됩니다 : 세포의 경우, 치료 후 4 일; 마우스의 경우 총 22 일, 5 일마다 3 회 치료와 7 일 회복. 세포가 수확되거나 종양이 현탁액으로 해리됩니다. (B) 샘플을 Baf로 처리하여 30 분 동안 SA-β-Gal 검출을 위해 리소좀 pH를 조정합니다. 그런 다음 DDAOG 프로브를 60 분 동안 추가하여 SA-β-Gal을 검출합니다. 샘플을 PBS에서 2x 세척하고, 생존성 염색을 간단히 첨가한다(15분). 임의로, 샘플은 개방 형광 채널에서 형광 항체로 염색될 수 있고/있거나 추후 분석을 위해 고정될 수 있다. (C) 샘플은 표준 유세포 분석기를 사용하여 분석됩니다. 생존 가능한 세포는 빨간색 DDAOG (SA-β-Gal을 나타냄) 대 녹색자가 형광 (리포 푸신)을 보여주는 점도표로 시각화됩니다. TIS 세포의 백분율을 결정하기 위한 게이트는 처리되지 않은 대조군 샘플에 기초하여 확립된다(도시되지 않음). 분류 세포분석기(FACS)를 사용하는 경우 TIS 세포를 수집하여 추가 시험관 내 분석을 위해 배양에 다시 넣거나 분자 생물학 분석을 위해 용해 및 처리할 수 있습니다. 약어 : DDAO = 9H- (1,3- 디클로로 -9,9- 디메틸 아 크리 딘 -2- 온); DDAOG = DDAO-갈락토사이드; TIS = 치료 유도 노화; FL-Ab = 형광단-접합 항체; Baf = 바필로마이신 A1; SA-β-Gal = 노화-관련 베타-갈락토시다제; PBS = 인산염-완충 식염수; FACS = 형광 활성화 세포 분류. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

형광단감지전 / 엠 (nm)사이토 미터 레이저 (nm)세포계 검출기/대역통과 필터(nm)
다오그사β갈645/6601640670 / 30
AF리포푸신< 600488525 / 50
이력서450생존 능력408/450405450 / 50
체육항체/표면 마커565/578561582 / 15

표 1: 형광단 및 세포분석기 광학 사양. 이 프로토콜에 사용되는 세포분석기 사양은 총 4개의 레이저와 15개의 방출 검출기가 있는 기기에 대해 나열됩니다. 645/660 nm에서 검출된 DDAOG는 SA-β-Gal1에 의해 절단된 프로브의 형태이다. 절단되지 않은 DDAOG는 460/610nm에서 낮은 수준의 형광을 나타낼 수 있지만 프로토콜의 세척 단계에 의해 제거됩니다. 약어 : DDAO = 9H- (1,3- 디클로로 -9,9- 디메틸 아 크리 딘 -2- 온); DDAOG = DDAO-갈락토사이드; AF =자가 형광; PE = 피코 에리트 린; SA-β-Gal = 노화 관련 베타-갈락토시다아제.

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프로토콜

설명 된 모든 동물 작업은 시카고 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.

1. 저장 용액의 준비 및 보관

알림: 세포를 흐름 분류할 경우 모든 용액은 멸균 기술을 사용하여 준비하고 0.22μm 필터 장치를 통해 여과해야 합니다.

  1. DMSO에서 5 mg / mL의 DDAO- 갈락토사이드의 저장 용액을 준비하십시오. 튜브당 50 μL(또는 원하는 부피)의 분취량. 어둠 속에서 -20 ° C에서 최대 1 년 동안 보관하십시오.
  2. DMSO 중 1 mM에서 바필로마이신 A1의 저장 용액을 준비한다. 튜브당 50 μL(또는 원하는 부피)의 분취량. -20 ° C에서 최대 6 개월 동안 보관하십시오.
  3. DMSO 중 1 mM에서 칼세인 바이올렛 450 AM의 스톡 용액을 준비한다. 튜브당 50 μL(또는 원하는 부피)의 분취량. 어둠 속에서 -20 ° C에서 최대 1 년 동안 보관하십시오.
  4. 시험관 내에서 배양된 세포의 처리를 위해, 적절한 용매에 노화 유도제의 10mM 농축 스톡 용액을 준비하고 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 멸균한다. −20 °C에서 보관하거나 제조업체의 지시에 따라 보관하십시오.
    참고: 생체 내에서 (종양이 확립된 마우스에게) 노화 유도 화학 요법제를 전달하려면 약제가 USP 등급이어야 하며 주사 직전에 농축 재고에서 식염수로 희석되어야 합니다.
  5. 사용 중인 세포주에 대한 완전한 배양 배지를 준비합니다.
    참고: 예를 들어, DMEM 1x + 10% FBS + 1x 글루타민 대체물 + 1x 페니실린/스트렙토마이신을 사용하여 B16-F10 또는 A549 세포용 배지를 준비합니다. 배지는 멸균 상태로 유지해야합니다. 다른 세포주-특이적 배지 제형이 사용될 수 있다. 글루타티온과 같은 특정 성분은 경우에 따라 노화의 시작을 방해 할 수 있습니다. 노화의 시작이 예상보다 낮거나 대조 화학 요법 제에서 관찰되지 않는 경우 다양한 배지 제형의 경험적 테스트를 수행해야합니다.
  6. 염색을 준비하고 완충액을 씻으십시오.
    1. 염색 절차에 사용하기 위해 1x PBS에 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 준비합니다. 2 g의 BSA를 200 mL의 PBS에 녹이고 실온에서 10분 동안 또는 완전히 녹을 때까지 저어줍니다.
    2. 세척 완충액으로 1x PBS에서 0.5% BSA를 준비합니다. 단계 1.6.1에서 제조된 1% BSA 100mL를 0.5% BSA용 1x PBS 100mL에 희석한다.
    3. 완충액은 4°C에서 최대 1개월 동안 보관합니다.
  7. 1x PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드를 준비하십시오. 편의성과 안정성을 위해 시중에서 판매되는 밀봉된 파라포름알데히드 앰플(예: 16% v/v)을 사용하십시오: 2.5mL의 16% PFA + 7.5mL의 1x PBS(= 10mL의 4% PFA). 실험 당 필요한 총 부피에 따라 준비된 양을 조정하십시오.
    알림: 셀 고정을 위해서만 필요에 따라 준비하십시오. 매번 신선하게 준비하십시오.
  8. FACS 분류 완충액을 준비합니다 : 1x PBS, 1 mM EDTA, 25 mM hepes, 1 % BSA (pH 7.2). 0.22 μm 여과 장치를 통해 제균 여과하고 4°C에서 최대 1개월 동안 보관한다.
    참고: FACS 정렬에 대해서만 필요에 따라 준비하십시오. 유동 분류 완충액 제형은 FACS 기기에 따라 다를 수 있습니다. 위의 공식은이 연구에 사용 된 기기와 호환됩니다 ( 재료 표 참조). 제조업체의 지침을 참조하십시오.
  9. 종양 해리 용액을 준비하십시오 : RPMI-100 배지에서 1640 μg / mL Liberase TL + 1640 μg / mL DNAse I (FBS 또는 기타 보충제 없음). 스톡 용액은 Liberase TL (제조업체의 지시에 따라 준비 및 보관) 및 DNAse I (이중 증류수 [ddH2O]에서 100mg / mL, -20 ° C에서 보관)을 보관하는 데 유용합니다.
    알림: 종양만 사용하는 경우 필요에 따라 준비하십시오. 매번 신선하게 준비하십시오.

2. 배양된 암세포에서 화학요법 약물에 의한 노화 유도

알림: 이 섹션의 모든 세포 조작 단계는 멸균 관행을 사용하여 생물안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. 이 섹션은 부착 세포 유형에 대해 작성되었습니다. 현탁 세포는 언급된 바와 같이 적절한 변형과 함께 사용될 수 있다.

  1. 공급업체 또는 사용된 특정 세포주를 제공한 실험실의 표준 프로토콜에 따라 암 세포주를 성장시킵니다.
    참고: 낮은 계대 세포(p < 10)는 일반적으로 처리되지 않은 세포 샘플에서 더 낮은 수준의 복제 노화, 즉 더 낮은 배경이 있기 때문에 선호됩니다.
  2. 약물에 의한 노화 유도 하루 전에 트립신-EDTA 0.25%(또는 권장)로 세포를 수확합니다. 동일한 부피의 완전한 배양 배지를 추가하여 트립신을 중화시키고 세포 현탁액을 멸균 원추형 튜브로 옮깁니다.
    참고: 이 단계는 현탁 셀에는 필요하지 않습니다.
  3. 표준 혈구계 방법을 사용하여 세포를 계수하고 세포/mL를 기록합니다. 표준 6웰 플라스틱 배양 접시에서 1 × 10 3-10 × 103 cells/cm2에서 세포를 플레이트합니다.
    참고: 최적의 도금 밀도는 세포의 증식 속도에 따라 달라지며 사용자가 결정해야 합니다. 세포는 치료 시 약 10%-20% 컨플루언시에서 로그 단계 성장에 있어야 합니다(즉, 도금 후 18-24시간 배양 후). 부유 세포의 시작 밀도(세포/mL)는 사용자가 결정해야 합니다. 6웰 플레이트는 일반적으로 하나의 표준 유세포분석 샘플에 대해 웰당 충분한 노화 세포를 생성합니다. 유동 분류의 경우, 다운스트림 분석을 위해 충분한 수의 노화 세포를 회수할 수 있도록 훨씬 더 큰 표면적(예: 다중 P150 플레이트)을 사용해야 합니다(≥1 × 106).
  4. 플레이팅된 세포를 5%CO2 및 습도 팬이 있는 37°C 인큐베이터에서 밤새도록(18-24 h) 배양한다.
  5. 도금된 세포를 노화 유도 화학 요법 약물로 처리합니다. 적어도 하나의 양성 대조군, 예를 들어 에토포시드 (ETO) 또는 블레오마이신 (BLM)을 포함한다. 약물 당 중복 우물을 준비하십시오. 차량 전용으로 처리된 한 세트를 제어로 포함합니다.
    알림: 각 실험제에 대한 용량 곡선은 사용 중인 세포주에서 노화 유도를 위한 최적의 농도를 결정하기 위해 사용자가 테스트해야 합니다.
  6. 노화의 시작을 허용하기 위해 5%CO2 및 습도 팬이 있는 37°C 인큐베이터에서 4일 동안 세포를 배양한다. 광학 현미경을 사용하여 예상되는 형태 변화를 매일 검사합니다.
    알림: 3-5일의 잠복기는 노화 발병 속도에 따라 허용될 수 있습니다. 배지를 변경하고 원하는 대로 제제를 재적용(또는 재도포하지 않음)하여 건강한 성장 조건을 촉진하는 동시에 노화 세포의 허용 가능한 비율을 달성할 수 있습니다.
  7. 노화가 시작된 후, 트립신-EDTA 0.25%를 첨가하여 37°C에서 5분 동안 세포를 수확한다. 세포가 현탁액으로 해리되면 동일한 부피의 완전한 배지로 트립신을 중화시킵니다.
    참고: 이 단계는 현탁액에서 성장하는 세포에는 필요하지 않습니다. 표면 마커 염색이 수행되는 경우 트립신-EDTA는 세포의 표면 항원을 일시적으로 파괴할 수 있으므로 사용을 피하십시오. 대신, 멸균 플라스틱 세포 스크레이퍼(또는 표면 항원을 보존하도록 설계된 대체 해리 시약)를 사용하여 단층을 부드럽게 해리합니다.
  8. 혈구계를 사용하여 각 샘플의 세포를 계수합니다. 각 샘플에 대한 셀/mL를 계산합니다.
    참고: 트리판 블루를 추가하여 이 시점(즉, 약물 처리로 인해)에서 죽은 세포의 백분율을 평가할 수 있지만 DDAOG 염색 워크플로우 동안 형광 생존율 염료로 세포 사멸도 측정합니다.
  9. 분취량 ≥0.5 × 시료당 106 세포를 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.
    참고: 샘플당 세포 수는 모든 샘플에서 표준화되어야 합니다.
  10. 4°C의 미세 원심분리기에서 1,000× g 에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 상청액을 제거하십시오.
    알림: 냉장 마이크로 원심분리기를 사용할 수 없는 경우 특정 탄성 셀 유형에 대해 주변 온도에서 원심분리를 수행하는 것이 허용될 수 있습니다.
  11. 섹션 4의 DDAOG 염색을 진행합니다.

3. 생쥐에서 확립 된 종양에서 화학 요법 약물에 의한 노화 유도

참고: 종양 세포가 FACS로 분류되는 경우 생물안전 캐비닛에서 작업하고 멸균 기기, 절차 및 시약으로 작업하여 각 단계에서 멸균을 보장합니다.

  1. 표준 방법에 따라 암세포를 피하에 주사하여 마우스 종양 모델을 만듭니다(예: Appelbe et al.19).
    참고: 주사할 암세포의 수, 주사 부위 및 적절한 마우스 균주는 각 프로토콜에 맞게 최적화되어야 합니다. 여기서, B16-F10 세포를 식염수 0.1mL(1 × 107 cells/mL)에 1 × 106 세포로 피하 주사하였다.
    1. 주사를 수행하기 전에 trypan blue를 사용하는 세포의 생존율이 >90 %인지 확인하십시오. 마우스를 이소 플루 란으로 마취하십시오.
    2. 6-7주령의 암컷 C57/BL6 마우스를 3% 이소플루란과 공기의 혼합물로 마취시키고 멸균된 생물안전 캐비닛 내에 배치된 유도 챔버에서 이러한 조건 하에서 유지합니다. 마우스의 발을 부드럽게 꼬집어 마취를 확인하십시오. 시술 중 각막 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 멸균 수의학 연고를 바르십시오. 절차 중에 가열 램프를 사용하여 마우스 체온을 유지하십시오.
    3. 멸균 생물안전 캐비닛 내부에서 작업하면서 유도 챔버에서 마우스를 제거하고 3% 이소플루란 공급을 제공하는 노즈 콘과 접촉하도록 놓습니다. 깨끗한 전기 면도기를 사용하여 주사 부위의 측면 부위를 면도하십시오. 주사 직전에 튜브를 수동으로 뒤집어 준비된 세포 현탁액을 간단히 혼합하고 멸균 0.5G 바늘이 장착된 멸균 27mL 주사기를 사용하여 면도한 측면에 세포 현탁액을 피하 주사합니다. 후드에서 마우스를 제거하고 복구 케이지로 옮깁니다.
    4. 회복 케이지에서 마우스가 흉골 누운 자세를 유지하고 올바른 반사를 보여 주며 케이지에서 안전하게 움직일 수있을만큼 충분한 의식을 회복 할 때까지 마우스의 활력 징후를 지속적으로 모니터링하십시오. 마우스를 방치하거나 종양 세포 접종을받은 동물을 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사로 돌려 보내지 마십시오. 접종된 모든 마우스를 매일 모니터링하여 체중 감소, 활동/이동성 감소 및 신경학적 증상을 확인합니다. 모든 범주에서 심각한 증상을 보이는 마우스를 안락사시킵니다. 접종 후 통증 증상을 보이는 마우스의 경우 부 프레 노르 핀 (0.1-0.2 mg / kg)을 한 번 피하 투여하십시오.
      참고: 부프레노르핀 후 지속적인 통증을 보이는 마우스는 안락사시켜야 합니다.
  2. 암세포 접종 후 5-7 일부터 2-3 일마다 캘리퍼스로 종양 성장을 측정합니다. 종양이 부피가 50mm 3 ± 10mm3에 도달하면 노화 치료를 시작하십시오.
    참고 :이 연구에서는 10mg / kg의 USP 등급 독소루비신 염산염 (DOX) 또는 PEG화 리포좀 독소루비신 (PLD)을 0.9 % 염화나트륨 주사 (USP)로 투여했습니다. 약물은 종양이 50mm 3 ± 10mm3에 도달했을 때부터 시작하여 5 일에 한 번씩 복강 내 3 회 주사되었습니다. 마우스는 종양에서 TIS의 발병을 허용하기 위해 최종 치료 후 7일 동안 회복되었습니다. 노화 유도 투여량 및 다른 치료 및/또는 종양 모델에 대한 조건은 최적화되어야 한다.
  3. 최종 약물 치료 후 7일째에, 실험실 동물 작업 가이드라인에 따라CO2 과량투여 및 자궁경부 탈구 또는 다른 승인된 방법으로 마우스를 희생시킨다. 종양을 절제하고 멸균 RPMI 성장 배지로 채워진 멸균 튜브 또는 6 웰 플레이트에 수집합니다 (처리 중 생존력을 보존하기 위해).
    참고: 조직학적 검사(예: X-Gal 또는 면역조직화학)를 수행하는 경우 여기에서 종양을 이등분할 수 있으며, O.C.T. 매립 배지에서 절반의 스냅 냉동을 하고 냉동 조직 조직학을 위한 표준 절차를 사용하여 냉동 절제할 수 있습니다. 나머지 종양 절반은 해리 및 DDAOG 염색을 위한 풍부한 물질을 생성해야 합니다.
  4. 하나의 종양을 5mL의 RPMI 배지가 들어있는 P100 플라스틱 접시에 옮깁니다. 메스를 사용하여 종양을 조각으로 만듭니다.
  5. 부유 세포와 파편이 들어있는 종양 조각 현탁액 5mL를 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 큰 파편이 있는 경우 이 현탁액을 옮기기 위해 25mL 혈청학적 피펫의 더 넓은 팁을 사용하십시오. 재료를 수집하기 위해 추가 양의 멸균 RPMI로 접시를 헹굽니다. 뚜껑을 덮고 원추형 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
  6. 나머지 종양에 대해 3.45-3.5 단계를 반복하십시오. 교차 오염을 피하기 위해 각 종양에 대해 별도의 플레이트와 메스를 사용하거나 종양 사이에 PBS로 잘 헹굽니다. 각 종양을 다지기 위해 5mL의 신선한 배지를 사용하십시오.
  7. 종양 해리 용액을 준비하십시오 : RPMI-100 배지 (FBS 제외)에서 1640 μg / mL 리베라 제 TL + 100 μg / mL DNAse I.
    참고: 종양 해리 용액에 대한 많은 효과적인 제형이 존재하며 다양한 제조업체의 다양한 효소 및 기타 성분을 포함할 수 있습니다. 성분의 최적 농도는 종양 유형에 따라 크게 다를 수 있습니다. 적혈구가 종양에 많이 존재하는 경우 적혈구 용해가 추가로 수행 될 수 있습니다. 죽은 세포가 문제인 경우 죽은 세포 제거 키트를 사용할 수 있습니다. 사용자가 높은 생존력과 오염 세포, 결합 물질 및 파편의 낮은 존재를 제공하는 최적의 종양 해리 조건을 독립적으로 결정하는 것이 좋습니다.
  8. 원뿔형 튜브의 모든 종양 샘플을 1,000 × g (4 ° C)에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 제거하십시오.
  9. 종양 물질의 부피에 따라 각 종양 샘플에 1-5mL의 종양 해리 용액을 추가합니다. 튜브에 종양 물질 펠릿을 초과하는 1-2mL가 있는지 확인하십시오. 적당한 속도로 소용돌이를 섞습니다.
  10. 샘플을 37 ° C 인큐베이터에 넣고 45 분 동안 빠르게 회전시킵니다. 15분마다 잠시 소용돌이.
  11. 각 샘플을 100μm 세포 여과기를 통해 50mL 원뿔형 튜브로 여과합니다. 샘플의 점성이 너무 높아 필터를 통과할 수 없는 경우 RPMI-1640 배지 10mL를 추가하여 희석합니다. 필터를 RPMI 배지로 헹구어 잔류 세포를 수집합니다.
  12. 혈구계를 사용하여 각 샘플에 대한 세포/mL를 계산합니다.
  13. 분취량은 종양 샘플 당 5 × 106 세포의 2개 이상의 복제물.
  14. 1,000 × g (4 ° C)에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 제거하십시오.
  15. (선택 사항) 원하는 경우 나중에 DDAOG 염색을 위해 종양 샘플을 동결보존합니다.
    1. 해리된 종양 세포 펠렛을 동결보존 배지에 재현탁합니다: 50% FBS, 40% RPMI-1640, 10% DMSO, 5 × 106 cells/mL의 멸균 조건 하에서 제조.
    2. 세포 현탁액 1mL를 각 냉동 바이알에 분취합니다.
    3. -80 ° C에서 이소프로판올 세포 냉동 용기에서 24 시간 동안 냉동 비알을 동결시킵니다. 그런 다음 장기 보관을 위해 액체 질소 냉동 보관으로 옮깁니다 (>1 주).
    4. 염색이 필요한 경우 얼음에서 냉동 바이알을 해동하고 섹션 4의 DDAOG 염색을 진행합니다.
      참고: 일부 종양은 동결보존을 통해 생존 가능하지 않을 수 있으며 이 과정에 대한 복원력은 관심 있는 종양 모델에 대해 사용자가 평가해야 합니다.
  16. DDAOG 염색에 대해서는 섹션 4로 진행합니다.

4. 세포 또는 종양 샘플에서 SA-β-Gal의 DDAOG 염색

  1. 1 μM의 최종 농도를 위해 1 mM 바필로마이신 A1 스톡을 1:1,000x의 DMEM 배지(FBS 제외)로 희석합니다.
  2. 준비된 Baf-DMEM 용액을 1 × 106 cells/mL의 농도로 세포 펠릿 샘플(2.11단계 또는 3.16단계)에 추가합니다.
    참고: 예를 들어, 샘플당 0.5 × 106 셀을 사용하는 경우 0.5mL의 Baf-DMEM을 추가합니다. 종양의 경우 5 mL의 Baf-DMEM에서 5 × 106 세포를 염색 할 수 있습니다.
  3. 느린 속도로 설정된 회전 장치/셰이커에서 37°C(CO2 제외)에서 30분 동안 배양합니다.
    참고: 용액을 산성화하여 Baf 및 DDAOG 염색을 방해할 수 있는 염색 공정을 위한 CO2 인큐베이터를 피하십시오.
  4. 세척하지 않고 DDAOG 원액(5mg/mL)을 1:500x(최종 10μg/mL)에 각 샘플에 추가합니다. 혼합 할 피펫. 37 ° C (CO2없이)의 회전 장치 / 셰이커에서 60 분 동안 교체하십시오. 직사광선을 피하십시오.
  5. 4°C에서 1,000 x g 에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 상청액을 제거하십시오.
  6. 튜브와 피펫당 1mL의 얼음처럼 차가운 0.5% BSA로 세척하여 혼합합니다. 튜브를 4°C에서 1,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 제거합니다. 이 단계를 2x 반복하여 세포를 완전히 씻으십시오. 상청액을 제거하고 계속 진행하십시오.
    알림: 원하지 않는 형광 방출(460/610nm)을 나타낼 수 있는 절단되지 않은 DDAOG를 제거하려면 4.6단계의 세척 단계를 수행하는 것이 중요합니다.
    참고: 세포 표면 마커에 대한 면역 염색의 경우 아래 섹션 5로 진행하십시오.
  7. (선택 사항) 추후 분석을 위한 DDAOG 염색 세포의 고정 및 보관
    1. 세척된 각 샘플에 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드 0.5mL를 적가합니다. 혼합 할 피펫.
    2. 실온에서 10분 동안 배양합니다.
    3. 세포를 1mL의 PBS로 2x 세척합니다.
    4. 유세포분석 전에 4°C에서 최대 1주일 동안 샘플을 보관하십시오.
      참고: 고정 샘플의 경우 4.8단계를 건너뜁니다.
  8. 칼세인 바이올렛 450 AM 스톡(1 mM)을 1:1,000x로 희석하여 1% BSA-PBS(최종 1μM)로 희석합니다. 300 μL (배양된 세포 샘플의 경우) 또는 1,000 μL (종양 샘플의 경우)를 단계 4.6으로부터의 세척된 세포 펠릿에 첨가한다. 어둠 속에서 얼음 위에서 15 분 동안 배양하십시오.
  9. 유세포분석 설정(섹션 6)으로 진행합니다.

5. (선택 사항) DDAOG와 조합된 세포 표면 마커에 대한 면역염색

참고: 모든 유세포분석 실험과 마찬가지로 DDAOG만 있고 형광 항체만 있는 단일 염색 대조군 샘플을 준비하여 형광 채널에서 누화(있는 경우)를 결정해야 합니다. 누화가 관찰되는 경우, 표준 유세포 분석 보상이 수행되어야 한다(20).

  1. 단계 4.6에서 수득한 세포 펠렛을 100 μL의 염색 완충액(1x PBS 중 1% BSA)에 재현탁시킨다.
  2. 세포 종(마우스 또는 인간)에 적합한 Fc 수용체 차단 시약을 제조업체가 권장하는 적정에 추가합니다. 24°C에서 10분 동안 배양합니다.
  3. 형광단 접합 항체를 제조업체가 권장하는(또는 사용자가 결정한) 적정으로 추가합니다. 빛으로부터 보호되는 얼음 위에서 20 분 동안 배양하십시오.
  4. 4 °C에서 1,000 × g 으로 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 상청액을 제거하십시오.
  5. 튜브와 피펫당 1mL의 얼음 냉세척 완충액(0.5% BSA-PBS)으로 세척하여 혼합합니다. 튜브를 4° C에서 1,000 ×g에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 제거한다. 이 단계를 2x 반복하여 세포를 완전히 씻으십시오.
  6. 1 mM 칼세인 바이올렛 450 AM을 1:1,000x에서 1% BSA-PBS로 희석합니다. 단계 5.5에서 세척된 세포 펠릿에 300 μL를 첨가한다. 어둠 속에서 얼음 위에서 15 분 동안 배양하십시오.
  7. 유세포 분석 (섹션 6-7)을 진행하십시오.

6. 유세포분석기 설정 및 데이터 수집

  1. 세포 샘플을 유세포분석 기기와 호환되는 튜브로 옮깁니다. 튜브를 얼음 위에 놓고 빛으로부터 보호하십시오.
    참고: 세포 현탁액에서 응집체가 관찰되면 분석 전에 현탁액을 70-100μm 세포 스트레이너에 통과시킵니다. 40μm 스트레이너는 더 큰 노화 세포 중 일부를 배제 할 수 있으므로 사용하지 마십시오.
  2. 참조된 소프트웨어( 재료 표 참조)에서 1) FSC-A 대 SSC-A 도트 플롯, 2) 보라색 채널 히스토그램, 3) 원적색 채널(예: APC-A) 대 녹색 채널(예: FITC-A) 도트 플롯을 엽니다.
    참고: 이중 제외 플롯과 단일 채널 히스토그램도 사용할 수 있지만 반드시 필요한 것은 아닙니다.
  3. 세포분석기 데이터 수집을 시작합니다.
    1. DDAOG로 염색된 차량 전용 제어 샘플을 흡기 포트에 놓습니다. 낮은 섭취 속도에서 샘플 데이터 수집을 시작하십시오.
    2. 사건의 >90%가 플롯 내에 포함되도록 FSC 및 SSC 전압을 조정합니다. 셀이 그림에 잘 맞지 않으면 영역 배율 설정을 0.33-0.5단위로 낮춥니다.
    3. 데이터를 기록하지 않고 차량 전용 샘플을 제거합니다.
    4. (선택 사항) 무지개 교정 마이크로스피어 한 방울을 PBS 1mL가 있는 세포분석기 튜브에 추가합니다. 튜브를 세포계 흡입구에 놓습니다. 샘플 데이터 수집을 시작합니다.
    5. 무지개 마이크로스피어의 상단 피크가 각 채널에서 104-10 5 단위의 상대 형광 범위에 있고 모든 피크가 각 채널에서 잘 분리되도록 보라색, 녹색 및 원적색 채널 전압을 조정합니다. 10,000개의 이벤트를 기록합니다. 튜브를 제거하십시오.
  4. DDAOG로 염색된 양성 대조군 샘플(예를 들어, BLM, ETO)을 흡기 포트에 놓는다. 저속에서는 샘플 데이터를 수집합니다. FSC, SSC, 보라색, 녹색 및 원적색 채널에서 이벤트를 관찰하여 이벤트의 90% 이상이 모든 플롯에 포함되도록 합니다. 차량 전용 제어와 비교하여 AF 및 DDAOG 신호의 증가를 찾으십시오.
  5. 분류 세포분석기를 사용하는 경우 이 단계에서 정렬을 시작합니다.
    1. 기록 보관을 위해 대조군 샘플과 정렬된 각 샘플에 대해 10,000개의 셀을 기록합니다.
    2. 원하는 양의 세포(≥1 × 106 이 일반적으로 적합함)를 3-5mL의 배양 배지가 있는 기기에 적합한 수집 튜브에 분류합니다.
    3. 분류 후 다운스트림 배양 또는 분석으로 진행합니다.
    4. 정렬된 샘플의 일상적인 분석을 위해 섹션 7로 건너뜁니다.
  6. 형광 항체를 사용하는 경우 섹션 5에서 준비한 염색되지 않은, 단일 염색 및 이중 염색된 샘플을 사용하여 여기에서 채널 전압을 최적화하십시오.
    알림: 여기에 사용된 보정된 유세포분석기의 경우 최적의 채널 전압은 일반적으로 250에서 600(중간 범위) 사이로 떨어지지만 최적의 전압 및 채널 전압 범위는 기기마다 다릅니다. 볼륨을 사용하지 마십시오.tage 신호를 억제하거나 노이즈를 증폭할 수 있는 매우 낮거나 높은 범위에서.
  7. 6.1-6.5단계를 완료하고 필요에 따라 세포계 설정을 조정한 후 모든 샘플에 대한 데이터를 기록합니다. 모든 샘플 기록에 대해 설정이 균일하게 유지되는지 확인합니다. 배양된 세포 샘플당 ≥10,000개의 이벤트 또는 종양 세포 샘플당 ≥100,000개의 이벤트를 기록합니다.
    참고: 데이터 수집 소프트웨어(예: FACSDiva)를 사용하여 게이팅 및 분석을 수행할 수 있지만 별도의 분석 소프트웨어(FlowJo)를 사용하여 수집 후 수행할 완전한 게이팅 및 분석 워크플로는 아래 섹션 7에 설명되어 있습니다. 획득 후 분석은 세포분석기 워크스테이션에서 시간을 줄이고 전용 분석 소프트웨어에 포함된 추가 도구를 활용하는 데 선호됩니다.
  8. 샘플 데이터를 .fcs 파일 형식으로 저장합니다. 유세포 분석 소프트웨어(예: FlowJo)가 장착된 워크스테이션 컴퓨터로 파일을 내보냅니다. 섹션 7로 이동합니다.

7. 유세포 분석 데이터 분석

참고: 제시된 워크플로는 FlowJo 소프트웨어를 사용합니다. 대안적인 유세포분석 데이터 분석 소프트웨어는 이 섹션에 설명된 주요 단계를 유사하게 따르는 경우 사용할 수 있습니다.

  1. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 6.7단계의 .fcs 데이터 파일을 엽니다.
  2. 레이아웃 윈도우를 엽니다.
  3. 모든 샘플을 레이아웃 창으로 끌어다 놓습니다.
  4. 게이트 생존 세포.
    1. 먼저 차량 전용 컨트롤의 샘플 데이터를 두 번 클릭하여 데이터 창을 엽니다.
    2. 데이터를 보라색 채널 히스토그램으로 시각화합니다. 죽은 세포보다 더 밝은 형광을 기반으로 CV450으로 염색된 생존 세포를 식별합니다.
    3. 단일 게이트 히스토그램 도구를 사용하여 생존 가능한 셀만 포함하도록 게이트를 그립니다. 실행 가능한 게이트의 이름을 지정합니다.
    4. 그런 다음 샘플 레이아웃 창에서 실행 가능한 게이트를 다른 셀 샘플로 끌어 게이트를 균일하게 적용합니다.
    5. 레이아웃 창에서 모든 샘플을 보라색 채널(생존력) 히스토그램으로 시각화합니다. 계속하기 전에 생존 가능한 세포 게이팅이 샘플 전체에서 적절한지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 필요에 따라 조정하십시오.
      참고: 생존력 염색은 치료 또는 종양에 따라 변이를 나타낼 수 있습니다.
  5. 게이트 노화 세포.
    1. 차량 전용 컨트롤에 대한 제어된 실행 가능한 셀 데이터를 두 번 클릭하여 데이터 창을 엽니다.
    2. 데이터를 원적색 채널(DDAOG) 대 녹색 채널(AF)에 대한 점도표로 시각화합니다.
    3. 사각형 게이팅 도구를 사용하여 DDAOG+ 및 AF+ (오른쪽 위 사분면)인 셀의 <5%를 포함하도록 게이트를 그립니다. 게이트의 이름을 노인으로 지정하십시오.
    4. 그런 다음 샘플 레이아웃 창에서 노화 게이트를 다른 셀 샘플의 실행 가능한 하위 집합으로 끌어 게이트를 균일하게 적용합니다.
    5. 레이아웃 창으로 섹션 7.4에서 제어된 실행 가능한 모든 셀 하위 집합을 끌어다 놓습니다. 실행 가능한 모든 샘플을 원적(예: APC-A) 대 녹색 채널(예: FITC-A) 점도표로 시각화합니다.
    6. 7.5.3단계에서 그린 노화 게이트가 모든 플롯에서 표시되고 차량 전용 제어용 게이트가 ≤5%-10% 노화 셀을 나타내는지 확인합니다.
  6. 위의 단계를 사용하여 노화 세포의 백분율이 결정되면 FlowJo 플롯을 사용하여 결과 데이터를 제시하고 데이터 테이블에 요약하거나 표준 소프트웨어를 사용하여 통계적으로 분석합니다.

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결과

SA-β-Gal에 의한 노화의 검출을 위한 X-Gal 및C12-FDG에 대한 DDAOG의 비교가능성을 입증하기 위해 여러 실험을 수행하였다. 먼저, X-Gal을 사용하여 ETO에 의해 유도된 노화 B16-F10 흑색종 세포를 염색하였다(도 2A). ETO 처리 된 세포의 하위 집합에서 강렬한 파란색이 발생한 반면 다른 세포는 덜 강렬한 파란색 염색을 나타 냈습니다. 형태학은 대부분의 ETO 처리된 세포에서 확대되었다. 형광 SA-β-Gal 기질C12-FDG(녹색) 또는 DDAOG(원적색)로 ETO 처리된 세포를 염색한 결과, X-Gal과 유사한 염색 패턴과 강도 변화가 나타났습니다(그림 2B). 그러나, 녹색C12-FDG 방출은 세포 AF와 중첩되었고(도 2C), 이는 노화 세포(...

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토론

지난 10여 년 동안 유세포분석은 종양 면역학의 새로운 인기, 저비용 유세포분석기의 개발 및 학술 기관의 공유 기기 시설 개선으로 인해 암 연구에서 보다 일반적인 분석 플랫폼이 되었습니다. 대부분의 최신 기기에는 보라색, 청록색 및 적색에서 원적색 광학 어레이가 장착되어 있기 때문에 다색 분석이 이제 표준입니다. 따라서, 이 DDAOG 프로토콜은 광범위한 유세포분석기와 호환될 가능성이 높다. 물론 모든 유세포분석기는 사용자가 평가해야 합니다. DDAOG 분석에 추가 형광단(예: 형광성, 접합 항체)을 추가할 때 특별한 주의를 기울여야 합니다. 채널 간 형광단 혼선의 평가는 다른 모든 관련 채널에서 시각화된 단일 염색 대조군을 사용하여 수행해야 합니다. 중첩이 관찰되면, 스펙트럼 보상은 전형적인 방법에 따른 보정을 위해 수행될 수 있다(20 ).

본원에 나타낸 연구 결과는 주로 DDAOG 유세포분석 분석이 세포 또는 종양에서 화학요법 약물...

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공개 사항

저자는이 연구에 대해 선언 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

유세포분석 기기에 대한 지원을 해주신 시카고 대학교의 세포분석 및 항체 핵심 시설에 감사드립니다. 시카고 대학의 동물 연구 센터는 동물 주택을 제공했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Bafilomycin A1Research Products InternationalB40500
블레오마이신 설페이트 Cayman13877
소 혈청 알부민(BSA)US BiologicalA1380
Calcein Violet 450 AM 생존 염료ThermoFisher Scientific65-0854-39eBioscience
DPP4 항체, PE 접합체Biolegend137803Clone H194-112
세포주: A549 인간 폐 선암종미국형 배양 컬렉션CCL-185
세포주: B16-F10 마우스 흑색종미국형 배양 컬렉션CRL-6475
세포 스크레이퍼Corning3008
세포 여과기, 100 &마이크로; mFalcon352360
DDAO-GalactosideLife TechnologiesD6488
DMEM 매체 1xLife Technologies11960-069
DMSOSigmaD2438
DNAse ISigmaDN25
독소루비신, 염산염 주사 (USP)PfizerNDC 0069-3032-20
독소루비신, PEGylated liposomal (USP)Sun PharmaceuticalNDC 47335-049-40
EDTA 0.5 MLife Technologies15575-038
Etoposide 케이맨12092
FBS오메가 FB-11
Fc 수용체 차단 시약Biolegend101320안티 마우스 CD16/32
유세포 분석기(세포 분석기)Becton Dickinson(BD)다양한LSRFortessa
유세포 분석기(세포 분류기)Becton Dickinson(BD)다양한FACSAria
GlutaMax 100xLife Technologies35050061
HEPES 1 MLonzaBW17737
Liberase TLSigma5401020001Roche
Paraformaldehyde 16%Electron Microscopy Sciences15710
페니실린/스트렙토마이신 100xLife Technologies15140122
인산염 완충 식염수(PBS) 1xCorningMT21031CVDulbecco의 PBS(칼슘 및 마그네슘 제외)
무지개 보정 입자, 울트라 키트SpheroTechUCRP-38-2K3.5-3.9 µ m, 2E6/mL
RPMI-1640 매체 1xLife Technologies11875-119
염화나트륨 0.9% (USP)Baxter Healthcare Corporation2B1324
Cytometer 데이터 수집용 소프트웨어, "FACSDiva"Becton Dickinson (BD)n/a라이선스 BD에 문의
Cytometer 데이터 분석용 소프트웨어, "FlowJo"TreeStar해당 사항없음
Trypsin-EDTA 0.25%Life Technologies25200-114
라이센스에 대해 TreeStar에 문의하십시오.

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