세포 배양 또는 쥐 종양 모델에서 화학 요법 약물에 의해 유도 된 노화 암 세포의 형광, 유세포 측정 정량화를위한 프로토콜이 제시된다. 선택적 절차에는 공동 면역염색, 대규모 배치 또는 시점 분석을 용이하게 하기 위한 샘플 고정, 유세포 분석 분류에 의한 생존 가능한 노화 세포의 농축이 포함됩니다.
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방법 논문
유세포분석을 통한 노화 종양 세포의 식별 및 농축을 위한 원적색 형광 노화 관련 β-갈락토시다아제 프로브
이 논문에서
요약
초록
세포 노화는 노화 세포에서 일반적으로 수년에 걸쳐 발생하는 생물학적 손상에 의해 유발되는 증식 정지 상태이지만 다양한 암 치료에 의해 유발 된 손상에 대한 반응으로 종양 세포에서도 빠르게 나타날 수 있습니다. 종양 세포 노화는 노화 세포가 사멸에 내성을 갖게되고 종양 완화를 차단하면서 종양 악성 종양 및 치료 내성을 악화시키기 때문에 일반적으로 바람직하지 않은 것으로 간주됩니다. 따라서 노화 종양 세포의 식별은 암 연구 커뮤니티의 지속적인 관심사입니다. 다양한 노화 분석이 존재하며, 많은 것이 잘 알려진 노화 마커인 노화 관련 베타-갈락토시다아제(SA-β-Gal)의 활성을 기반으로 합니다.
일반적으로 SA-β-Gal 분석은 고정 된 세포에 발색 기질 (X-Gal)을 사용하여 수행되며 광학 현미경으로 "파란색"노화 세포를 느리고 주관적으로 열거합니다. C12-FDG(녹색) 및 DDAO-갈락토사이드(DDAOG; far-red)를 포함한 세포 투과성 형광 SA-β-Gal 기질을 사용한 개선된 분석은 살아있는 세포의 분석을 가능하게 하고 유세포분석기를 포함한 고처리량 형광 분석 플랫폼의 사용을 가능하게 했습니다. C12-FDG는 SA-β-Gal에 대해 잘 문서화 된 프로브이지만 녹색 형광 방출은 리포 푸신 응집체의 축적으로 인해 노화 중에 발생하는 고유 세포자가 형광 (AF)과 겹칩니다. 원적색 SA-β-Gal 프로브 DDAOG를 활용하여 녹색 세포 자가형광을 노화를 확인하기 위한 보조 파라미터로 사용하여 분석에 신뢰성을 더할 수 있습니다. 나머지 형광 채널은 세포 생존율 염색 또는 선택적인 형광 면역표지에 사용될 수 있다.
유세포 분석을 사용하여 노화 종양 세포의 식별을 위한 이중 매개변수 분석으로 DDAOG 및 리포푸신 자가형광을 사용하는 것을 입증합니다. 생존 가능한 노화 세포의 백분율의 정량이 수행됩니다. 원한다면, 관심있는 세포 표면 항원을 평가하기 위해 선택적인 면역표지 단계가 포함될 수 있다. 확인된 노화 세포는 또한 유세포 분석기로 분류되고 다운스트림 분석을 위해 수집될 수 있습니다. 수집된 노화 세포는 즉시 용해되거나(예를 들어, 면역검정 또는 '오믹스 분석을 위해) 추가로 배양될 수 있다.
서론
노화 세포는 정상적인 생물학적 노화 동안 일반적으로 수년에 걸쳐 유기체에 축적되지만 방사선 및 화학 요법을 포함한 다양한 암 치료에 의해 유발 된 손상에 대한 반응으로 종양 세포에서도 빠르게 발전 할 수 있습니다. 더 이상 증식하지는 않지만 치료 유도 노화(TIS) 종양 세포는 치료 내성에 기여하고 재발을 유발할 수 있습니다1,2,3. TIS 세포에 의해 분비되는 인자는 면역 회피 또는 전이를 촉진하여 종양 악성 종양을 악화시킬 수 있습니다 4,5. TIS 세포는 복잡한 상황별 표현형, 변경된 대사 프로필 및 고유한면역 반응을 발달시킵니다6,7,8. 따라서 다양한 암 치료 접근법에 의해 유도 된 TIS 종양 세포의 확인 및 특성화는 암 연구 커뮤니티의 지속적인 관심 주제입니다.
TIS 종양 세포를 검출하기 위....
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프로토콜
설명 된 모든 동물 작업은 시카고 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
1. 저장 용액의 준비 및 보관
알림: 세포를 흐름 분류할 경우 모든 용액은 멸균 기술을 사용하여 준비하고 0.22μm 필터 장치를 통해 여과해야 합니다.
- DMSO에서 5 mg / mL의 DDAO- 갈락토사이드의 저장 용액을 준비하십시오. 튜브당 50 μL(또는 원하는 부피)의 분취량. 어둠 속에서 -20 ° C에서 최대 1 년 동안 보관하십시오.
- DMSO 중 1 mM에서 바필로마이신 A1의 저장 용액을 준비한다. 튜브당 50 μL(또는 원하는 부피)의 분취량. -20 ° C에서 최대 6 개월 동안 보관하십시오.
- DMSO 중 1 mM에서 칼세인 바이올렛 450 AM의 스톡 용액을 준비한다. 튜브당 50 μL(또는 원하는 부피)의 분취량. 어둠 속에서 -20 ° C에서 최대 1 년 동안 보관하십시오.
- 시험관 내에서 배양된 세포의 처리를 위해, 적절한 용매에 노화 유도제의 10mM 농축 스톡 용액을 준비하고 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 멸균한다. −20 °C에서 보관하거나 제조업체의 ....
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결과
SA-β-Gal에 의한 노화의 검출을 위한 X-Gal 및C12-FDG에 대한 DDAOG의 비교가능성을 입증하기 위해 여러 실험을 수행하였다. 먼저, X-Gal을 사용하여 ETO에 의해 유도된 노화 B16-F10 흑색종 세포를 염색하였다(도 2A). ETO 처리 된 세포의 하위 집합에서 강렬한 파란색이 발생한 반면 다른 세포는 덜 강렬한 파란색 염색을 나타 냈습니다. 형태학은 대부분의 ETO 처리된 세포에서 확대되었다. 형광 SA-β-Gal 기질C12-FDG(녹색) 또는 DDAOG(원적색)로 ETO 처리된 세포를 염색한 결과, X-Gal과 유사한 염색 패턴과 강도 변화가 나타났습니다(그림 2B). 그러나, 녹색C12-FDG 방출은 세포 AF와 중첩되었고(도 2C), 이는 노화 세포(.......
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토론
지난 10여 년 동안 유세포분석은 종양 면역학의 새로운 인기, 저비용 유세포분석기의 개발 및 학술 기관의 공유 기기 시설 개선으로 인해 암 연구에서 보다 일반적인 분석 플랫폼이 되었습니다. 대부분의 최신 기기에는 보라색, 청록색 및 적색에서 원적색 광학 어레이가 장착되어 있기 때문에 다색 분석이 이제 표준입니다. 따라서, 이 DDAOG 프로토콜은 광범위한 유세포분석기와 호환될 가능성이 높다. 물론 모든 유세포분석기는 사용자가 평가해야 합니다. DDAOG 분석에 추가 형광단(예: 형광성, 접합 항체)을 추가할 때 특별한 주의를 기울여야 합니다. 채널 간 형광단 혼선의 평가는 다른 모든 관련 채널에서 시각화된 단일 염색 대조군을 사용하여 수행해야 합니다. 중첩이 관찰되면, 스펙트럼 보상은 전형적인 방법에 따른 보정을 위해 수행될 수 있다(20 ).
본원에 나타낸 연구 결과는 주로 DDAOG 유세포분석 분석이 세포 또는 종양에서 화학요법 약물.......
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공개 사항
저자는이 연구에 대해 선언 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
유세포분석 기기에 대한 지원을 해주신 시카고 대학교의 세포분석 및 항체 핵심 시설에 감사드립니다. 시카고 대학의 동물 연구 센터는 동물 주택을 제공했습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Bafilomycin A1 | Research Products International | B40500 | |
| 블레오마이신 설페이트 | Cayman | 13877 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | US Biological | A1380 | |
| Calcein Violet 450 AM 생존 염료 | ThermoFisher Scientific | 65-0854-39 | eBioscience |
| DPP4 항체, PE 접합체 | Biolegend | 137803 | Clone H194-112 |
| 세포주: A549 인간 폐 선암종 | 미국형 배양 컬렉션 | CCL-185 | |
| 세포주: B16-F10 마우스 흑색종 | 미국형 배양 컬렉션 | CRL-6475 | |
| 세포 스크레이퍼 | Corning | 3008 | |
| 세포 여과기, 100 &마이크로; m | Falcon | 352360 | |
| DDAO-Galactoside | Life Technologies | D6488 | |
| DMEM 매체 1x | Life Technologies | 11960-069 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| DNAse I | Sigma | DN25 | |
| 독소루비신, 염산염 주사 (USP) | Pfizer | NDC 0069-3032-20 | |
| 독소루비신, PEGylated liposomal (USP) | Sun Pharmaceutical | NDC 47335-049-40 | |
| EDTA 0.5 M | Life Technologies | 15575-038 | |
| Etoposide | 케이맨 | 12092 | |
| FBS | 오메가 | FB-11 | |
| Fc 수용체 차단 시약 | Biolegend | 101320 | 안티 마우스 CD16/32 |
| 유세포 분석기(세포 분석기) | Becton Dickinson(BD) | 다양한 | LSRFortessa |
| 유세포 분석기(세포 분류기) | Becton Dickinson(BD) | 다양한 | FACSAria |
| GlutaMax 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES 1 M | Lonza | BW17737 | |
| Liberase TL | Sigma | 5401020001 | Roche |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 100x | Life Technologies | 15140122 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) 1x | Corning | MT21031CV | Dulbecco의 PBS(칼슘 및 마그네슘 제외) |
| 무지개 보정 입자, 울트라 키트 | SpheroTech | UCRP-38-2K | 3.5-3.9 µ m, 2E6/mL |
| RPMI-1640 매체 1x | Life Technologies | 11875-119 | |
| 염화나트륨 0.9% (USP) | Baxter Healthcare Corporation | 2B1324 | |
| Cytometer 데이터 수집용 소프트웨어, "FACSDiva" | Becton Dickinson (BD) | n/a | 라이선스 BD에 문의 |
| Cytometer 데이터 분석용 소프트웨어, "FlowJo" | TreeStar | 해당 사항 | 없음 |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-114 |
참고문헌
- Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy. Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).
- Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent cells in cancer therapy: fri....
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재인쇄 및 허가
