일차 세포와 배양된 세포에서 세포질 및 핵 Long RNA의 제조

요약

현재 프로토콜은 배양된 세포를 사용하여 핵 및 세포질 분획에서 RNA를 분리한 다음 qPCR을 사용하여 검증하는 효율적이고 유연한 방법을 제공합니다. 이것은 다른 RNA 준비 키트를 효과적으로 대체하는 역할을 합니다.

초록

세포 내 구성 요소의 분리는 수년 동안 세포 생물학의 핵심 도구였으며 그 위치가 기능에 어떤 영향을 미칠 수 있는지에 대한 유용한 통찰력을 제공할 수 있었습니다. 특히, 핵 및 세포질 RNA의 분리는 암세포와 약물의 새로운 표적을 찾는 맥락에서 중요해졌습니다. 핵-세포질 RNA 추출을 위한 키트를 구입하는 것은 일반적인 실험실 환경에서 필요한 많은 재료를 찾을 수 있는 경우 비용이 많이 들 수 있습니다. 더 비싼 키트나 기타 시간이 많이 소요되는 공정을 대체할 수 있는 본 방법을 사용하면 수제 용해 완충액, 벤치탑 원심분리기 및 RNA 분리 정제 컬럼만 있으면 핵 및 세포질 RNA를 분리할 수 있습니다. 용해 완충액은 핵막의 무결성에 영향을 미치지 않고 세포의 외막을 부드럽게 용해시켜 세포 내 구성 요소를 방출하는 데 사용됩니다. 그런 다음 핵은 용해 용액보다 높은 밀도를 갖기 때문에 간단한 원심분리 단계로 분리할 수 있습니다. 원심분리는 밀도 차이에 따라 이러한 영역을 분리하여 핵의 세포 내 요소를 세포질의 하위 요소와 분리하는 데 사용됩니다. 원심분리를 통해 서로 다른 성분이 분리되면 RNA clean-up kit를 사용하여 RNA 함량을 정제하고 qPCR을 수행하여 분리 품질을 검증하고 서로 다른 분획의 핵 및 세포질 RNA의 양으로 정량화합니다. 통계적으로 유의미한 수준의 분리가 달성되어 프로토콜의 효과를 보여줍니다. 또한, 이 시스템은 다양한 유형의 RNA(총, 작은 RNA 등)의 분리에 적용할 수 있어 세포질-핵 상호작용에 대한 표적 연구를 가능하게 하고 핵과 세포질에 존재하는 RNA의 기능 차이를 이해하는 데 도움이 됩니다.

서론

세포 내 구성 요소로의 세포 분획은 정의된 생화학적 영역의 분리 및 연구를 가능하게 하고 특정 세포 과정의 국소화와 이것이 기능에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 결정하는 데 도움이 됩니다¹. 상이한 세포내 위치로부터 RNA를 분리하면 전사 수준 사건 및 핵과 세포질 사이의 다른 상호작용에 대한 유전적 및 생화학적 분석의 정확성이 향상될 수 있으며, 이는 현재 프로토콜²의 주요 목적이다. 이 프로토콜은 세포질 및 핵 RNA의 분리를 보장하여 핵 수출에서 각각의 역할을 결정하고 핵 및 세포질에서 RNA의 세포 내 국소화가 세포 과정에서의 기능에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 이해하기 위해 개발되었습니다. 일반적인 실험실 환경의 재료를 사용하여 결과의 품질을 위태롭게 하지 않으면서 이전에 확립된 프로토콜보다 더 효과적이고 저렴하게 핵 및 세포질 분획을 달성할 수 있었습니다³.

또한 세포질과 핵 사이의 분자 교환은 이러한 영역을 분리하여 직접 연구할 수 있습니다. 보다 구체적으로, 전사체를 이해하는 것은 발달과 질병을 이해하는 데 필수적입니다. 그러나 RNA는 주어진 시간에 다른 성숙 수준에 있을 수 있으며 다운스트림 분석을 ....

프로토콜

K562 세포는 본 연구에 사용된다. 이 프로토콜은 1 x 10^6-5 x 10⁶⁰⁰ 만 셀에 대해 작동하도록 최적화되었습니다. 그러나 볼륨을 적절하게 늘려 더 큰 셀 수량에 맞게 절차를 확장할 수 있습니다.

1. 0.25x 용해 완충액의 제조

1. 표 1A에 제공된 다음 성분을 혼합하여 0.25x 용해 완충액을 준비합니다.
   참고: 샘플에는 약 300μL의 0.25x 용해 완충액이 필요합니다. 권장 부피 = 샘플 수 x 300μL.

2. 핵 및 세포질 분획의 분리

1. 1.5 mL 튜브를 사용하여 2000 x g(실온)에서 5분 동안 원심분리를 통해 세포를 펠렛화합니다. 흡인 피펫을 사용하여 상청액을 버립니다.
   참고: K562 세포는 이 프로토콜 동안 활용되었습니다. 그러나, 상기 프로토콜은 다양한 세포주에 적용될 수 있다.
2. 펠릿을 300μL의 얼음처럼 차가운 0.25x 용해 완충액에 재현탁합니다.
   알림: 2분 동안 얼음에 보관하고 45초마다 튜브를 회전시켜 세포가 ....

결과

핵 및 세포질 분리가 달성되었는지 확인하기 위해 qPCR을 수행하여 결과를 검증했습니다. 그렇게 함으로써, 관심 영역에 특이적인 프라이머는 핵 및 세포질 분획 수준을 입증하는 데 활용되었습니다. 본 연구에서는 MALAT1과 TUG1을 각각 핵과 세포질 프라이머로 사용하였다. 함께, 그들은 핵 원소에 대한 양성 대조군으로 MALAT1을 사용하여 높은 수준의 핵 분획을 입증할 수 있는 반면, 세포질 분획은 낮을 것으로 예상됩니다. 반대로, TUG1이 세포질 요소에 대한 양성 대조군으로 존재하는 경우, 세포질 분획 수준은 핵 분획 수준보다 높을 것으로 예상됩니다. 이는 Nuclear 및 Cytoplasmic RNA 분리를 확인하는 양성 결과의 예인 그림 2에서 볼 수 있습니다.

MALAT1을 사용한 샘플에서 세포질 분획 수준이 관찰되는 음성 결과를 그림 3에서 볼 수 있습니다. .......

토론

프로토콜 전반에 걸쳐, 관심 있는 세포주에 가장 효과적이도록 요소를 최적화하기 위한 몇 가지 단계가 취해졌다. 프로토콜 내의 단계는 비교적 간단하지만 프로토콜의 중요한 측면에서 분석 및 사소한 조정이 필요할 수 있습니다. 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 용해 완충액의 농도를 관심 세포주와 세포 표적에 따라 적절한 농도로 수정하는 것입니다. 용해 완충액의 이용은 세포막의 파괴에 크게 좌우되므로, 서로 다른 세포주 간에 세포 취약성과 막 투과성에 약간의 차이가 있기 때문에 서로 다른 세포주에서 용해 완충액의 효과에는 자연스러운 차이가 있다¹². 1x 용해 완충액의 기준선에서 시작하여 용해 완충액의 농도를 0.25x로 점진적으로 감소시키면서 프로토콜의 단계를 수행하여 보다 효과적인 결과를 보장했습니다. 이 실험은 궁극적으로 많은 수의 세포 내 성분을 분리하는 것을 목표로 하기 때문에 용해 완충액의 농도가 관심 세포주에 최적화되도록 하는 것이 최고의 수율과 최상의 결과를 달성하는 데 중요합니다.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	Agilent TapeStation 시스템은 DNA 및 RNA 시료의 시료 품질 관리를 위한 자동 전기영동 솔루션입니다.
0.5 % Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	용해 완충액
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	제조	에 사용 15568025 용해 완충액
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	제조	핵 분획 확인에 사용됩니다.
MicroAmp Optical 96-Well 반응 플레이트(바코드 포함	Thermo-Fischer	4326659	Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode는 빠르고 효율적인 PCR 증폭을 위해 타의 추종을 불허하는 온도 정확도와 균일성을 제공하도록 최적화되었습니다. 96웰 형식의 단일 경질 폴리프로필렌 조각으로 구성된 이 플레이트는 Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR 시스템 및 열 순환기와 호환됩니다.
MicroAmp 광학 접착 필름	Thermo-Fischer	4311971	Applied Biosystems MicroAmp 광학 접착 필름은 qPCR 중 마이크로플레이트에 적용할 때 well-to-well 오염 및 시료 증발 가능성을 줄입니다
. PBS	Gibco	20012-023	인산염 완충 식염수(PBS)는 해리 전 세포 세척과 같은 다양한 세포 배양 응용 분야에 사용되는 균형 잡힌 염 용액입니다. 세포 또는 조직 샘플을 운반하고, 계수를 위해 세포를 희석하고, 시약을 준비합니다.
Qiagen RNA 클린업 키트-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA 클린업 키트는 효소 반응의 효율적인 RNA 클린업과 다양한 방법으로 정제된 RNA의 클린업을 가능하게 합니다. 프로토콜 전반에 걸쳐 언급된 RW1, RLT, RW1 버퍼를 포함합니다.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR 소프트웨어. 분획 시료 분석을 위한 설계 및 분석 소프트웨어 RLT
Buffer	Qiagen	79216	Lysis Buffer from RNA clean-up kit
RPE Buffer	Qiagen	1018013	Wash Buffer from RNA clean-up kit
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	Wash Buffer from RNA clean-up kit
Taqman Gene-Expression Assays	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan 유전자 발현 어세이는 32종의 진핵생물 종과 수많은 미생물에 걸쳐 280만 개 이상의 어세이를 통해 업계에서 가장 큰 규모의 사전 설계된 어세이 모음입니다. TaqMan 유전자 발현 어세이를 사용하면 SYBR Green 프라이머를 최적화하는 데 시간을 낭비하지 않고 용융 곡선을 실행하고 분석하는 데 추가 시간을 할애하지 않고 빠르게 결과를 얻을
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix는 여러 5' 뉴클레아제 DNA 애플리케이션을 위한 마스터 믹스가 필요할 때 이상적인 시약 솔루션입니다. Applied Biosystems 시약은 TaqMan 어세이 및 Applied Biosystems 실시간 시스템으로 검증되어 항상 민감하고 정확하며 신뢰할 수 있는 성능을 보장합니다.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer Hs00215501_m1		세포질 분획 확인에 사용됩니다.
UltraPure DEPC 처리된 물	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC 처리된 물은 RNA와 함께 사용하기에 적합합니다. 0.1% 디에틸피로카보네이트(DEPC)로 배양하여 제조한 후 고압멸균하여 DEPC를 제거합니다. 멸균 여과.

에 사용 Hs00273907_s1 ) 프로토콜 중에 사용된 수 있습니다.