감염 중 한천 및 조직에서 자란 박테리아 집락의 이미징 질량 분석 분석을 통한 미생물 협력 조사

인간 마이크로바이옴은 박테리아, 바이러스, 고세균 및 기타 미생물 진핵생물의 분자 상호 작용을 포함하는 매우 역동적인 생태계입니다. 최근 몇 년 동안 미생물 관계가 집중적으로 연구되었지만 화학적 수준 ^1,2에서 미생물 과정에 대해 이해해야 할 것이 많이 남아 있습니다. 이는 부분적으로 복잡한 미생물 환경을 정확하게 측정할 수 있는 도구를 사용할 수 없기 때문입니다. 지난 10년 동안 이미징 질량분석법(IMS) 분야의 발전으로 생물학적 기질^3,4에서 많은 대사 산물^, 지질 및 단백질의 현장 및 표지 없는 공간 매핑이 가능해졌습니다. MALDI(Matrix-assisted laser desorption/ionization)는 질량분석법으로 측정하기 위해 UV 레이저를 사용하여 얇은 조직 절편의 표면에서 물질을 제거하는 것과 관련된 이미징 질량분석법에 사용되는 가장 일반적인 이온화 기법으로 부상했습니다⁴. 이 공정은 시료 표면에 균일하게 적용된 화학 매트릭스를 적용하여 용이하게 되며, 시료 표면 전체에 걸쳐 래스터 패턴으로 순차적 측정을 수행할 수 있습니다. 그런 다음 분석물 이온 강도의 히트 맵이 데이터 수집 후에 생성됩니다. 이온화 소스 및 샘플링 기술의 최근 발전으로 영양소 한천에서 자란 박테리아⁵ 및 포유류 ^6,7,8 세포 표본과 같은 비전통적인 기질의 분석이 가능해졌습니다. IMS에 의해 제공되는 분자 공간 정보는 감염^동안 미생물-미생물 및 숙주-미생물 상호작용의 생화학적 통신에 대한 독특한 통찰력을 제공할 수 있다 9,10,11,12,13,14.

클로스트리디오이데스 디피실 감염(Clostridioides difficile infection, CDI)이 발생하면, C. 디피실(C. difficile)은 위장관에서 빠르게 변화하는 미생물 환경에 노출되며, 여기서 다미생물 상호작용은 감염 결과에 영향을 미칠 수 있다^15,16. 놀랍게도, 감염 동안 C. difficile과 상주 미생물 사이의 상호 작용의 분자 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 예를 들어, 장내구균은 장내 미생물군집에 있는 기회주의적 공생 병원체의 한 종류이며 CDI^17,18,19,20에 대한 감수성 및 중증도 증가와 관련이 있습니다. 그러나 이러한 병원체 간의 상호 작용에 대한 분자 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 장내 마이크로바이옴의 이러한 구성원 간의 소분자 통신을 시각화하기 위해, 박테리아 거대 콜로니를 여기에서 한천에서 성장시켜 통제된 환경에서 미생물-미생물 상호 작용 및 박테리아 생물막 형성을 시뮬레이션했습니다. 그러나 박테리아 배양 표본의 MALDI 이미징 질량 분석 분석에서 대표적인 대사 분포를 얻는 것은 이러한 샘플의 높은 수분 함량과 고르지 않은 표면 지형으로 인해 어렵습니다. 이것은 주로 한천의 높은 친수성 특성과 수분 제거 중 불균일한 한천 표면 반응에 기인합니다.

한천의 높은 수분 함량은 또한 균질한 MALDI 매트릭스 코팅을 달성하는 것을 어렵게 만들 수 있으며 진공²¹에서 수행되는 후속 MALDI 분석을 방해할 수 있습니다. 예를 들어, 많은 MALDI 소스는 0.1-10 Torr의 압력에서 작동하며, 이는 한천에서 수분을 제거하기에 충분한 진공이며 샘플의 변형을 일으킬 수 있습니다. 진공 환경에 의해 유도된 한천의 이러한 형태학적 변화는 건조된 한천 물질에서 기포 발생 및 균열을 유발합니다. 이러한 아티팩트는 슬라이드에 대한 한천의 부착을 감소시키고 샘플이 기기 진공 시스템으로 분리되거나 박리되는 원인이 될 수 있습니다. 한천 샘플의 두께는 슬라이드에서 최대 5mm까지 떨어져 있을 수 있으며, 이로 인해 기기 내부의 이온 광학 장치에서 불충분한 클리어런스가 생성되어 기기 이온 광학 장치가 오염 및/또는 손상될 수 있습니다. 이러한 누적 효과는 기본 미생물 생화학적 상호 작용보다는 표면 지형을 반사하는 이온 신호의 감소를 초래할 수 있습니다. 한천 샘플은 진공 분석 전에 균일하게 건조되고 현미경 슬라이드에 강하게 부착되어야 합니다.

이 논문은 한천 배지에서 성장한 박테리아 배양 거대 콜로니의 제어된 건조를 위한 샘플 준비 워크플로우를 보여줍니다. 이 다단계의 느린 건조 공정(이전에 보고된 것과 비교)은 현미경 슬라이드에 장착된 한천 샘플의 버블링 또는 균열 영향을 최소화하면서 한천이 균일하게 탈수되도록 합니다. 이 점진적인 건조 방법을 사용하여 샘플을 현미경 슬라이드에 강력하게 부착하고 후속 매트릭스 적용 및 MALDI 분석에 사용할 수 있습니다. 이것은 공생 및 기회 병원체인 Enterococcus faecalis의 존재 여부에 관계없이 CDI를 보유하는 한천 및 쥐 조직 모델에서 성장한 C. difficile의 모델 박테리아 콜로니를 사용하여 예시됩니다. 박테리아 및 조직 모델에 대한 MALDI 이미징 질량 분석 분석을 통해 아미노산 대사 산물 프로파일의 공간 매핑이 가능하여 생체 에너지 미생물 대사 및 통신에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.

참고: 동물 실험은 필라델피아 아동 병원의 동물 관리 및 사용 위원회와 펜실베니아 대학교 페렐만 의과대학(프로토콜 IAC 18-001316 및 806279)의 승인을 받았습니다.

주의: 클로스트리디움 디피실리 (C. difficile) 및 엔테로코커스 패칼리 스(E. faecalis)는 BSLII 병원체이므로 각별히 주의하여 취급해야 합니다. 필요한 경우 적절한 오염 제거 프로토콜을 활용하십시오.

1. 박테리아 배양 거대 콜로니의 성장 및 익일 선적 준비

1. C. difficile과 E. faecalis의 하룻밤 배양물을 준비하고 0.5% 효모 추출물과 0.1% l-시스테인(BHIS)이 보충된 뇌-심장-주입 배지의 혐기성 챔버(85% 질소, 10% 수소, 5% 이산화탄소)에서 37°C에서 개별적으로 성장시킵니다. 모든 도금 된 샘플에 1.5 % 한천을 사용하십시오.
2. 박테리아 배양 배지를 600nm(OD₆₀₀)에서 광학 밀도로 표준화합니다. 각 거대콜로니 5 μL를 BHIS + l-시스테인 한천 플레이트 상에 플레이트하고 37°C에서 7일 동안 혐기성으로 성장시킨다. 혼합 종 거대 콜로니의 경우 도금 전에 박테리아 배양 배지를 1:1 비율로 혼합합니다.
3. 저항계를 사용하여 전도성 코팅이 된 슬라이드의 측면을 식별하여 인듐 주석 산화물(ITO) 코팅 현미경 슬라이드를 준비합니다. 끝이 다이아몬드로 장식된 스크라이브를 사용하여 현미경 슬라이드의 ITO 코팅 면을 에칭하고 라벨을 붙입니다.
4. 한천 성장 플레이트에서 전체 배양액을 절제한 다음 ITO 코팅된 현미경 슬라이드에 장착하면서 한천과 슬라이드 사이에 기포가 갇히지 않도록 합니다.
   참고: 한천 배지의 수분 함량은 배양액이 현미경 슬라이드 표면에 자연스럽게 부착되도록 해야 합니다. 이 과정을 예시하는 비디오는 Yang et ^al.22의 보충 문서에 제공됩니다.
5. 보호를 위해 콜로니를 현미경 슬라이드 박스에 넣습니다. 슬라이드 박스를 8인치 x 8 크기의 생물학적 위험 표본 이송 백에 소수의 건조제 펠릿과 함께 보관하고 추가 처리 및 분석을 위해 하룻밤 동안 배송할 수 있도록 밀봉합니다.
   알림: 박테리아 성장과 신진대사를 늦추고 분석할 때까지 박테리아 표본의 고정을 유지하기 위해 주변 조건에서 배송할 때 박테리아 배양을 위한 건조한 환경을 유지하는 것이 중요합니다. 이 운송 방법은 광범위한 실험을 통해 최적화되었으며 드라이 아이스에 냉동 된 식민지를 운송하는 것보다 선호됩니다. 건조 전의 주요 온도 변화는 장착된 한천 샘플 아래에서 분리 및 기포를 유발하는 경향이 있습니다.

2. C. difficile + E. faecalis 박테리아 거대 콜로니의 주변 건조

1. ITO 코팅된 현미경 슬라이드에 장착된 아가로스 박테리아 콜로니를 포장재로부터 제거한다. 샘플을 실온에서 48-72시간 동안 건조제가 있는 건조 상자에 넣습니다.
   알림: 이것은 현미경 슬라이드 표면에서 한천 배지의 버블링, 균열 또는 분리를 최소화하는 온화하고 느린 건조 과정입니다.
2. 오염된 모든 포장재를 적절하게 폐기하고 적절한 살균/살포자 소독제로 작업 공간의 오염을 제거하십시오.
3. 한천 표면의 변형(예: 버블링, 균열, 분리)에 대해 콜로니를 육안으로 검사합니다.
   알림: 아가로스 표면의 높이가 눈에 띄게 감소하고 슬라이드를 가로질러 평평하게 놓여야 합니다.

3. C. difficile + E. faecalis 박테리아 거대 콜로니의 진공 및 열 매개 건조

참고: 한천 샘플에서 과도한 수분을 쉽게 제거할 수 있도록 맞춤형 진공 건조 장치(그림 1)가 제작되었습니다. 이 장치는 HEPA 바이오필터, 콜드 트랩 및 박테리아 샘플이 배치되는 스테인리스 스틸 챔버에 일렬로 연결된 로터리 베인 진공 펌프를 사용합니다. 가변 전압 변압기는 절연 전선 필라멘트에 연결되어 사용자가 챔버를 가열하여 건조 과정을 신속하게 처리할 수 있습니다.

1. 샘플 챔버의 진공 라인을 닫고 로터리 베인 펌프의 전원 스위치를 켜서 진공 펌프가 예열되고 적절한 진공 압력에 도달할 수 있도록 합니다.
2. 가변 볼륨을 켭니다tage 변압기를 사용하여 챔버를 감싸고 있는 와이어 필라멘트를 가열합니다. 진공 챔버의 내부 온도가 ~50°C에 도달할 때까지 가변 전원 공급 장치를 조정합니다. 펌프가 예열되는 동안 드라이 아이스와 100 % 에탄올 슬러리를 콜드 트랩의 응축기에 넣습니다.
   알림: 콜드 트랩은 샘플의 모든 증기 또는 포자를 응축하고 로터리 베인 펌프 시스템과 진공 펌프 오일의 오염을 방지합니다.
3. 렌치를 사용하여 16mm 이중 클로 플랜지 클램프를 풀어 진공 챔버를 엽니다. 아가로스 샘플을 챔버에 삽입하고 16mm 이중 클로 플랜지 클램프로 챔버를 단단히 밀봉합니다.
4. 펌프 밸브를 열어 챔버를 비우십시오. 샘플을 60-120분 동안 건조시킵니다(예: ~150mTorr에서).
   알림: 이 건조 시간은 작은 한천 섹션에서 대부분의 수분을 제거하기에 충분합니다. 수분 제거를 위한 최적의 건조 시간과 한천 높이 감소에 대한 경험적 결정은 개별 설정 및 샘플에 따라 필요할 수 있습니다. 건조 시간이 상당히 길어지면 건조된 한천이 부서지기 쉽고 균열이 발생하기 쉽습니다.
5. 완료되면 로터리 베인 펌프의 밸브를 닫고 외부 밸브를 주변 공기로 열어 진공 챔버를 주변 압력으로 천천히 배출합니다. 앞서 언급된 프로토콜을 사용하여 챔버를 열고, 건조된 아가로스 샘플을 챔버로부터 제거한다.
6. 매트릭스가 적용될 때까지 건조제가 있는 건조 상자에 샘플을 보관하십시오.
   알림: 그림 2 는 건조 전후의 한천 표면 이미지를 보여줍니다.

4. 로봇 스프레이를 통한 MALDI 매트릭스 적용

참고: 아가로스 샘플이 완전히 건조되고 배양 섹션의 높이가 눈에 띄게 감소한 후 로봇 매트릭스 분무기를 사용하여 화학적 MALDI 매트릭스 화합물의 얇은 코팅을 균일하게 적용합니다. 이 절차는 화학 흄 후드와 장갑, 실험실 안경 및 실험실 코트를 포함한 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 수행해야 합니다.

1. 적절한 MALDI 행렬을 선택합니다. 이 프로토콜을 따르려면 음이온 모드에서 아미노산의 유리한 탈착 및 이온화를 위해 1,5-디아미노나프탈렌(DAN) MALDI 매트릭스를 사용하십시오.
2. 10/10(v/v) 아세토니트릴/물에 90mg/mL DAN MALDI 매트릭스 용액 10mL를 준비합니다. HPLC 등급 용매를 사용하고 30 분 동안 초음파 처리 한 다음 로봇 분무기 주사기 펌프에 도입하기 전에 0.2 μm 나일론 주사기 필터를 통해 용액을 여과합니다. 또한 매번 사용 사이에 분무기 라인이 깨끗한지 확인하기 위해 세척 용액을 준비하십시오.
   알림: 세척 용액은 분무기 라인에서 매트릭스 및 기타 오염 물질의 용해도를 높이고 시스템에서 쉽게 제거할 수 있도록 선택됩니다. 본원에 사용된 세척 용액은 90/10 (v/v) 아세토니트릴/물, 50/50 (v/v) 물/메탄올, 99/1 (v/v) 아세토니트릴/아세트산, 및 95/5 (v/v) 물/수산화암모늄이다.
3. 시료를 분무기 트레이에 부착하고 준비된 용액을 분무기 라인에 적재합니다(그림 3). 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 매트릭스 화합물의 균일한 코팅을 위해 필요한 파라미터( 노즐 온도 30°C, 8회 통과, 유량 0.1mL/분, CC 패턴, 건조 시간 0초, 10psi)를 지정합니다.
   참고: 대부분의 병원체는 일반적으로 작은 유기산 또는 염기인 MALDI 매트릭스의 적용에 의해 비활성화되는 것으로 일반적으로 받아들여지고 있습니다.
4. 분무 순서가 끝나면 분무기 트레이에서 샘플을 제거하고 분석될 때까지 건조 캐비닛에 보관합니다.

5. MALDI 이미징 질량 분석 데이터 수집을 위한 박테리아 거대 콜로니 준비

참고: 모든 이미징 질량 분석 분석은 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명(FTICR) 질량 분석기를 사용하여 수행되었습니다. 이 기기에는 Nd:YAG MALDI 레이저 시스템(2kHz, 355nm)이 장착되어 있습니다.

1. 매트릭스 코팅된 샘플을 MALDI 타겟 플레이트 현미경 슬라이드 어댑터에 삽입하고 영구 마커를 사용하여 샘플 영역을 둘러싸는 최소 3개의 기준 마커를 스크라이브합니다(그림 4). 평판 스캐너를 사용하여 기준 마커를 포함한 현미경 슬라이드의 광학 이미지를 획득합니다.
   알림: 기준 마커를 사용하면 광학 이미지를 MALDI 카메라에 등록할 수 있습니다.
2. 질량 교정, MALDI 레이저 설정, 이온 광학 파라미터 및 ICR 셀 조건을 포함하여 원하는 질량 범위, 감도 및 분해능에 최적화된 MS 기기 분석법을 정의합니다. 이 방법의 경우, 관심 대사 산물의 m/z 값을 포함하는 CASI(Continuous accumulation of selected ions) 접근법을 사용하여 음이온 모드에서 기체상 신호 농축을 위해 m/z 100에서 200까지 100Da 질량 창을 선택합니다.23
3. 계측기의 이미지 수집 소프트웨어를 열고 설정 마법사를 사용하여 파일 이름과 위치, MS 수집 방법, 샘플링할 관심 영역 , 이미지의 공간 해상도 를 정의합니다.
   참고: 100-300 μm의 공간 분해능은 일반적으로 박테리아 거대 콜로니 이미징에 사용됩니다.
4. 모든 파라미터가 정의되면, 수집 시퀀스를 시작하여 정의된 관심 영역의 각 픽셀에서 질량 스펙트럼을 연속적으로 수집합니다.
   참고: 이미지 획득 시간은 기기 설정에 따라 다르지만 일반적으로 5,000-10,000픽셀이 포함된 이미지의 경우 2-6시간 범위입니다.

6. 이미징 질량 분석법 데이터 분석 및 화합물 식별

1. 이미지 획득 후 이미징 질량 분석 플랫폼을 위한 공급업체별 파일 형식인 ".mis" 파일 확장자로 데이터를 저장합니다. flexImaging 또는 SCiLS 소프트웨어 패키지에서 데이터 파일을 열거나 .mzml과 같은 비독점 데이터 형식으로 내보내고 공급업체 중립적인 소프트웨어(예: Cardinal²⁴ 또는 MSIreader^25,26)를 사용하여 시각화합니다.
   참고: flexImaging에서 이미징 데이터를 열면 평균 질량 스펙트럼이 표시되며, 이는 샘플링된 영역에서 검출된 모든 이온의 평균 강도를 나타냅니다. 관심 피크는 정확한 질량 측정을 기반으로 잠정적으로 식별할 수 있습니다. 일반적으로 5ppm 이상의 질량 정확도는 FTICR 질량 분석기에서 대사 산물을 식별하기에 충분합니다.
2. 참조된 소프트웨어를 사용하여 관심 피크에 대한 질량 창을 정의하여 샘플링된 영역에 걸쳐 이온 분포의 가색 히트 맵을 생성합니다.
   1. 평균 질량 스펙트럼 디스플레이에서 관심 피크를 확대하고 피크 프로파일 영역을 포함하는 적절한 질량 창을 선택합니다.
   2. 강조 표시된 매스 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 매스 필터 추가...를 선택합니다. 고분해능 정확한 질량 측정에 의해 결정된 의심되는 대사 산물에 대한 임시 식별을 사용하여 선택한 m/z 값에 레이블을 지정합니다.
   3. 강도 임계값을 선택하여 false-color 히트 맵에 의해 표시되는 분석물 이미지의 동적 범위를 조정합니다. 질량 필터링 파라미터를 추가로 조정하여 질량 창이 피크 프로파일의 영역을 포함하도록 한 다음 질량 필터를 추가합니다.
      참고: 강도 정규화는 측정된 영역에서 상대적 정량화를 개선하기 위해 적절하게 수행될 수 있습니다. 본 실험에서는 CASI 데이터 수집(vide infra)을 활용했는데, 이는 총 이온 수(TIC) 및 제곱 평균 제곱근(RMS) 정규화 방법을 부정확하게 만들 수 있습니다. 이와 같이, 본 명세서에 도시된 모든 이온 이미지는 정규화 없이 디스플레이된다.

7. 비감염 대조군 및 C. difficile 에 감염된 마우스 맹장 조직의 준비 및 선적

1. 4-8주령 C57BL/6 수컷 마우스에 항생제(0.5mg/mL 세포페라존 또는 0.5mg/mL 세포페라존 + 1mg/mL 반코마이신)를 5일 동안 임 의 로 음용수에 접종한 후 2일의 회복 기간과 후속 감염을 실시합니다.
2. 동물을_CO2 질식에 의해 안락사시키고 마우스 맹장 기관을 즉시 적출한다. 증류수에 최적 절단 온도(OCT) 화합물의 20% 혼합물을 포함합니다.
3. 샘플을 드라이 아이스에 놓고 분석을 위해 포장하고 배송하십시오. 분석될 때까지 -80°C에서 보관한다.

8. 감염되지 않은 대조군 verus C. difficile 에 감염된 마우스 맹장 조직의 냉동 절편

1. 100% 에탄올로 헹구어 모든 냉동 절편 장비를 세척하고 샘플을 저온 유지 장치 챔버에 넣기 전에 건조시키십시오. 전도성 코팅이 있는 슬라이드의 측면을 식별하기 위해 저항계를 사용하여 ITO 코팅된 현미경 슬라이드를 준비합니다. 끝이 다이아몬드로 장식된 스크라이브를 사용하여 현미경 슬라이드의 ITO 코팅 면을 에칭하고 라벨을 붙입니다.
   알림: 장갑, 실험실 안경, 실험실 코트 및 저온 유지 장치 슬리브를 포함한 적절한 개인 보호 장비를 착용해야 합니다.
2. 연구용 cryomicrotome에서 cryosectioning을 수행합니다. OCT 포매 마우스 ceca 조직을 -80°C 냉동고에서 드라이아이스 상의 cryomicrotome 챔버(챔버 온도 30°C, 물체 온도 -28°C)로 옮깁니다. 이미징 질량분석법(예: 비감염 대조군 대 C. 디피실 감염)을 사용하여 비교할 조직 샘플을 동일한 현미경 슬라이드에 장착하여 두 조직 유형의 동일한 샘플 준비를 보장하고 정확한 대사 산물 비교를 가능하게 합니다.
3. cryomicrotome 챔버 내에서 추가 OCT 용액을 사용하여 OCT 내장 조직을 샘플 척에 장착합니다. OCT 용액이 굳은 후 척을 시편 헤드에 고정합니다. 장기의 원하는 조직 깊이/평면에 도달하기 위해 10-50μm 단위로 냉동 절개를 시작합니다.
4. 조직의 최적 단면에 도달하면 12μm 두께로 절편을 수집하기 시작합니다. 아티스트 페인트 브러시를 사용하여 슬라이스를 부드럽게 조작하고 테프론 코팅된 현미경 슬라이드에 놓습니다.
5. ITO 코팅 현미경 슬라이드를 조직 섹션 위에 롤링하여 테프론 코팅 슬라이드에서 조직을 픽업합니다. ITO 코팅된 슬라이드의 뒤쪽에 손바닥을 눌러 조직 섹션을 현미경 슬라이드에 해동합니다. 조직 섹션이 반투명에서 불투명/무광택 질감으로 전환될 때까지 마운트 해동을 계속합니다.
6. 드라이아이스에 조직 장착형 현미경 슬라이드를 건조제가 있는 드라이 박스로 옮겨 당일 분석을 위해 보관하거나 -80°C에서 장기간 보관할 수 있습니다.

9. 매트릭스 적용 및 MALDI 이미징 질량 분석법을 위한 비감염 대조군 대 C. difficile 에 감염된 마우스 맹장 조직의 준비

1. 4단계에 설명된 것과 동일한 프로토콜(노즐 온도 30°C, 8회 통과, 0.1mL/분 유속, CC 패턴, 건조 시간 0초, 10psi)을 사용하여 MALDI 매트릭스 적용을 수행합니다.
2. 5단계와 6단계에서 설명한 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 MALDI 이미징 질량분석법을 수행합니다.
3. 여러 생물학적 복제물에서 이온 이미지를 분석하고 위에서 참조한 SCiLS 통계 소프트웨어를 사용하여 강도 상자 그림 비교를 통해 유의성에 대한 결과를 비교합니다.
   참고: 적절한 통계 테스트 및 비교는 응용 프로그램에 따라 다르며 공간 분할, 분류 모델 및 차별 및 상관 스펙트럼 기능을 결정하기 위한 비교 분석이 포함될 수 있습니다. 비교 분석에는 유의한 특징에 p-값 할당, 조직 비교를 위한 주성분 분석 생성, 변동 식별을 위한 상자 그림 시각화가 포함될 수 있습니다. 또한 이미징 질량 분석법에 따라 헤마톡실린 및 에오신(H&E)을 통해 염색된 조직 부분의 명시야 현미경을 사용하여 조직을 시각화하는 것도 유용합니다. 이를 통해 조직의 형태학적 특징을 명확하게 식별할 수 있으며 숙련된 병리학자와 상의하여 분석할 수 있습니다.

우리는 미생물-미생물 상호 작용에서 아미노산의 역할을 연구하기 위해 E. faecalis 및 C. difficile 과 공동 집락화된 모델 박테리아 콜로니 및 마우스의 대사산물 MALDI 이미징 질량 분석법을 수행했습니다. 한천에서 자란 박테리아 거대 콜로니는 박테리아 생물막 형성의 뚜렷한 생화학적 변화를 분석하기 위한 잘 정의된 모델 역할을 합니다. 한천 배지에서 성장한 박테리아 배양 거대콜로니에 대한 제어된 건조 공정을 보장하여 한천 표면의 변형과 균열을 최소화하는 것이 중요합니다. 이는 상온 및 상압에서 건조제를 사용한 예비 건조와 고온에서 수행되는 보다 빠른 진공 보조 건조 단계를 포함하는 2단계 공정을 통해 달성되었습니다. 맞춤형 건조 장치를 사용하여 한천 탈수를 촉진하는 동시에 샘플에서 박테리아 오염 물질 또는 포자의 방출을 포착했습니다(그림 1). 추가 진공 건조 단계는 샘플이 완전히 탈수되고 MS 진공에 노출될 때 변형되지 않도록 하는 데 필요합니다.

한천 절편은 처음에 샘플 높이가 2-4mm였으며(그림 2A) 건조 프로토콜에 따라 높이가 ~0.5mm로 감소했습니다(그림 2B). 이 샘플 준비 프로토콜 동안 샘플 표면 전체에 걸쳐 균일한 건조를 보장하는 것이 중요합니다. 시료 높이의 편차가 크면 시료 표면에서 초점이 흐려지는 MALDI 레이저 빔이 발생하여 이온화 효율과 분석물 이온 강도에 해로운 영향을 미칠 수 있습니다. 실패한 건조 공정의 예가 그림 2D에 나와 있는데, 한천 표면이 기포를 일으키고 갈라져 추가 분석을 위해 샘플을 사용할 수 없게 되었습니다. 박테리아 샘플이 완전히 건조되면 로봇 분무기를 사용하여 DAN MALDI 매트릭스 층을 도포합니다(그림 3). 이 기기를 사용하면 스프레이 파라미터를 정밀하게 제어할 수 있어 균일한 매트릭스 코팅을 적용할 수 있습니다(그림 2C).

매트릭스 적용 후 샘플이 포함된 현미경 슬라이드를 FTICR MS에서 분석하기 위해 슬라이드 어댑터에 삽입합니다(그림 4). 슬라이드의 좌표는 먼저 측정할 영역 주변의 슬라이드에 기준 표시를 그려 이미징 질량 분석 수집 소프트웨어와 기기 카메라 사이에 등록됩니다(그림 4에서 "+" 기호로 표시됨). 그런 다음 평판 스캐너를 사용하여 슬라이드를 디지털 방식으로 스캔하여 광학 이미지를 기록한 다음 flexImaging 소프트웨어에서 획득 시퀀스를 정의하는 데 사용합니다. 우리는 대사 산물 음이온의 투과 및 검출을 위해 질량 분석 기기 설정을 최적화했습니다. CASI 기체상 이온 농축을 사용하여 조직 표면에서 관찰된 화합물 배열을 포함하는 m/z 150 ± 50Da(그림 5A)에서 이온을 선택적으로 축적하도록 이온 분리 창을 정의했습니다. 특히 여기 C. difficile 감염에 대해 우리는 박테리아 이화 작용 동안 흥미롭고 변화하는 역할을 보여주는 아미노산 경로를 발견했습니다. 정확한 질량 측정을 기반으로 이온 신호는 m/z 131.083 및 m/z 173.104에서 오르니틴(0.34ppm 질량 오차; 그림 5B) 및 아르기닌 (0.43 ppm 질량 오차; 도 5C)를 각각 참조한다.

박테리아 거대 콜로니의 이미징 질량 분석법은 C. difficile 단일 배양 및 C. difficile + E. faecalis 공동 배양 콜로니에서 수행되었습니다(그림 6). MALDI 매트릭스 적용 후 샘플의 광학 이미지는 콜로니 생물막의 외부 영역으로 확장되는 관심 획득 영역을 강조 표시합니다(그림 6A, C). 이러한 샘플의 이미징 질량 분석법은 오르니틴 및 아르기닌 아미노산 대사 산물의 공간 매핑을 허용하며, 이는 E. faecalis의 존재 하에서 변경되고 차별적으로 국한되는 것으로 밝혀졌습니다(그림 6B, D). 예를 들어, 아르기닌은 C. difficile + E. faecalis 공동 배양에 비해 C. difficile 단일 배양에서 훨씬 더 풍부합니다(그림 6D). 또한 C. difficile 포자, C. difficile 포자 + E. faecalis 세포(wt)(5 × 10 8/mL) 또는 C. difficile 포자 + E. faecalis(ArcD 돌연변이) 세포(5 × 10 8/mL)를 모두 포함하는 트랜스포존 돌연변이 에 감염된8주령의 무균 C57BL/6 암컷 마우스를 사용하여 이미징 질량 분석 분석을 감염 마우스 모델로 확장했습니다(그림 7)27 . 마우스 맹장을 채취하여 장기 모양과 충실도를 유지하기 위해 25% OCT 화합물로 냉동했습니다. OCT 화합물은 또한 냉동 절편 동안 얇은 조직 절편을 지지하는 데 도움이 되었습니다. 위에서 언급한 프로토콜과 유사하게 조직 절편을 DAN MALDI 매트릭스 층으로 코팅하고 평판 광학 스캐너를 사용하여 스캔하고(그림 7B) MALDI 이미징 질량 분석법으로 분석합니다(그림 7C). 이미징 질량 분석 후 조직 절편에 대해 조직학적 염색을 수행하고, 조직 형태를 평가하기 위해 고해상도 명시야 광학 스캐닝을 사용했습니다(그림 7A). 상피 세포층은 대조군 조직에 비해 감염 동안 명확하게 염증이 발생합니다.

그림 1: 집에서 만든 진공 건조 장치. 맞춤형 진공 건조 장치는 한천 샘플에서 수분을 신속하게 제거하는 데 사용됩니다. 샘플을 진공 챔버에 넣고 로터리 베인 펌프를 사용하여 밀봉 및 배출한 다음 가변 전압 변압기를 사용하여 가열합니다. 샘플의 모든 오염 증기/포자는 콜드 트랩 및 HEPA 인라인 필터에 갇혀 있습니다. 일반적으로 100-150mTorr의 압력이 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 박테리아 거대 콜로니의 건조 및 준비. 한천 샘플의 광학 이미지 (A) 건조 및 진공 보조 건조를 사용한 수분 제거 전 및 (B) 후. (C) 1,5-디아미노나프탈렌 MALDI 매트릭스를 로봇 분무기를 사용하여 건조시킨 후 박테리아 공동 배양에 적용합니다. (D) 건조에 실패하면 일반적으로 한천 내에서 균열 및 기포가 발생하여 추가 분석에 사용할 수 없게 됩니다. 약어: DAN = 1,5-디아미노나프탈렌; MALDI = 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 아가로스 샘플에 대한 MALDI 매트릭스의 로봇 스프레이. (A) HTX M5TM 분무기 및 (B) MALDI 매트릭스 적용을 위해 로봇 매트릭스 분무기에 로드된 아가로스 샘플의 이미지. 약어: MALDI = 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 분석을 위해 로드된 샘플이 있는 질량 분석기 어댑터. 매트릭스 코팅된 아가로스 샘플은 MALDI 분석을 위해 MTP 슬라이드 어댑터에 로드됩니다. 기준 마커는 검은색 더하기 기호("+")로 표시됩니다. 약어: MALDI = 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 확인된 대사산물 이온 피크의 대표적인 질량 스펙트럼. (A) 박테리아 배양 샘플의 음이온 모드 MALDI 분석을 통해 수십 개의 대사 산물을 검출할 수 있습니다. 고분해능의 정확한 질량 측정을 통해 m/z 131.083(0.34ppm 질량 오차)에서 (B) 오르니틴과 m/z 173.104(0.43ppm 질량 오차)에서 (C) 아르기닌을 잠정적으로 식별할 수 있습니다. 질량 스펙트럼은 m/z 150에서 75,000의 질량 분해능(FWHM)을 사용하여 획득됩니다. 약어: MALDI = 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화; FWHM = 절반 최대에서 전체 너비. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 박테리아 거대 콜로니의 이미징 질량 분석 분석. (A,C) 아가로스 샘플의 광학 이미지는 이미징 질량 분석 분석을 위한 측정 영역을 보여주며, 흰색 점선으로 강조 표시됩니다. (비,디) 오르니틴(m/z 131.083, 0.038ppm) 및 아르기닌(m/z 173.104, 0.60ppm)에 대한 MALDI 이온 이미지는 박테리아 배양 전반에 걸쳐 고유한 공간 분포를 보여줍니다. 절대 강도 척도는 패널 B와 D에 표시된 공동 배양 이온 이미지에 대해 다릅니다. 예를 들어, 아르기닌은 패널 C와 D의 공동 배양에 비해 C. difficile 단일 배양에서 훨씬 더 풍부하며, 이는 이 강도 척도가 단일 배양에서 아르기닌의 풍부함에 상대적이며, 이 공동 배양에는 아르기닌이 존재하지 않는 것으로 보입니다. 반대로, A와 B의 공동 배양은 아르기닌의 강도를 더 낮은 절대 강도 척도에 투영하는데, 이는 이것이 이미지의 유일한 샘플이기 때문입니다. 약어: MALDI = 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화; CASI = 선택된 이온의 연속 축적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 감염된 쥐 맹장 조직의 이미징 질량 분석 분석. (A) 감염된 마우스 ceca의 헤마톡실린 및 에오신 염색 조직의 명시야 현미경 이미지를 통해 조직 형태를 시각화할 수 있습니다. (B) 마우스 ceca 조직의 광학 이미지는 DAN MALDI 매트릭스 층을 적용한 후의 샘플을 보여줍니다. (C) 오르니틴(m/z 131.083, 0.88ppm) 및 아르기닌(m/z 173.104, 0.15ppm)에 대한 MALDI 이온 이미지는 조직 샘플 전반에 걸쳐 고유한 공간 분포를 표시합니다. 약어: MALDI = 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화; DAN = 1,5-디아미노나프탈렌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 경쟁하는 재정적 이익을 선언하지 않습니다.