방법 논문

엔 페이스 마우스 배아에서 평면 형태형성 분석을 위한 심내막 쿠션 준비

DOI:

10.3791/64207

⸱

2022년 7월 27일

 ,  , 
1Intercellular Signalling in Cardiovascular Development and Disease Laboratory, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), 2Ciber de Enfermedades Cardiovasculares

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

고전적으로, 마우스 배아 판막 원초의 심내막은 횡단, 관상 또는 시상 절편을 사용하여 분석되었습니다. 판막 형성 영역에서 심내막의 2차원 이미징에 대한 우리의 새로운 접근 방식은 판막 발달 중 심내막의 평면 극성 및 세포 재배열 분석을 가능하게 합니다.

초록

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포유류 심장의 발달을 뒷받침하는 세포 및 분자 메커니즘에 대한 연구는 인간의 선천성 심장병을 해결하는 데 필수적입니다. 원시 심장 판막의 개발은 국소 유도 성 심근 및 심내막 신호에 반응하여 심장의 방실 관 (AVC) 및 유출로 (OFT) 영역에서 심내막 세포의 상피 - 중간 엽 전이 (EMT)를 포함합니다. 세포가 박리되어 심내막과 심근 사이에 위치한 세포 외 기질 (심장 젤리)을 침범하면 원시 심내막 쿠션 (EC)이 형성됩니다. 이 과정은 심내막이 박리 된 세포가 남긴 틈을 채워야하며 축을 따라 수렴 (좁게) 또는 확장 (길게)하기 위해 스스로를 재구성해야 함을 의미합니다. 현재의 연구는이 과정에 관여하는 요인의 세포 내 국소화를 조절하는 데 평면 세포 극성 (PCP) 경로를 연루시켰다. 고전적으로, 심장 판막 발달의 초기 단계는 배아 심장의 단면 또는 콜라겐 젤에서 배양 된 생체 외 AVC 또는 OFT 체 외 이식편에서 연구되었습니다. 이러한 접근법은 apico-basal 극성의 분석을 허용하지만 상피면 내의 세포 거동 또는 이동하는 세포의 형태 학적 변화에 대한 분석은 허용하지 않습니다. 여기에서는 판막 생성 영역에서 심내막을 세포의 평면 필드로 시각화 할 수있는 실험적 접근 방식을 보여줍니다. 이 실험적 접근법은 판막 개발 중에 OFT 및 AVC의 심내막 내에서 PCP, 평면 토폴로지 및 세포 간 통신을 연구 할 수있는 기회를 제공합니다. 심장 판막 형태 형성과 관련된 새로운 세포 메커니즘을 해독하면 심내막 쿠션 결함과 관련된 선천성 심장 질환을 이해하는 데 기여할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

심장은 포유류 배아의 첫 번째 기능 기관입니다. 마우스에서 배아일(E) 7.5 전후, 양측 심장전 중배엽 세포는 복부 쪽에서 심장 초승달을 형성한다1. 심장 초승달에는 심근과 심내막2의 전구 세포를 포함하는 두 개의 심장 전 세포 집단이 있습니다. E8.0 주변에서 심장 전구체는 정중선에서 융합되어 두 개의 상피 조직인 외부 심근과 심장 젤리라는 세포외 기질로 분리된 특수 내피인 내부 심내막으로 구성된 원시 심장 튜브를 형성합니다. 나중에 E8.5에서 심장 튜브는 오른쪽으로 반복됩니다. 루프가 있는 심장은 유출로(OFT), 심실 및 심실관(AVC)과 같은 특정 분자 서명을 가진 다양한 해부학적 영역을 가지고 있습니다.3. 처음에는 심장 튜브가 세포4의 추가를 통해 유입 측에서 확장되지만, E9.5에서 집중적 인 심장 증식은 챔버의 팽창 및 섬유주 네트워크5의 확립을 초래한다. 판막 형성은 AVC (미래의 승모판 및 삼첨판 판막)와 OFT (미래의 대동맥 및 폐동맥 판막)에서 발생합니다.

심내막은 판막 발달에 중요한 역할을합니다. 심내막 세포는 AVC 및 OFT에서 상피-중간엽 전이(EMT)를 거쳐 판막 발달 초기에 나타나는 구조인 심내막 쿠션을 형성합니다. 다른 신호 경로가이 과정을 활성화합니다. 마우스의 E9.5에서 심근 유래 BMP2에 반응하여 심내막에서 활성화 된 NOTCH는 부착 접합 (AJ)의 막 횡단 구성 요소 인 혈관 내피 카드 헤린 (VE- 카드 헤린)의 발현을 직접 억제하는 TGFβ2 및 달팽이 (SNAI1)의 활성화를 통해 AVC 및 OFT 영역에서 심내막 세포의 침습성 EMT를 촉진합니다.6,7,8 . OFT에서, EMT를 개시하기 위한 심내막의 활성화는 FGF8 및 BMP4에 의해 매개되며, 그의 발현은 NOTCH 9,10,11,12에 의해 활성화된다.

EMT의 진행은 세포가 모양을 바꾸고, 이웃과의 접합부를 끊고 다시 만들고, 박리하고, 이동하기 시작함에 따라 세포 역학을 포함합니다13. 이러한 변화에는 AJ 리모델링 및 점진적 분해 14,15, 평면 세포 극성 (PCP) 신호 전달, apico-basal 극성 (ABP)의 손실, 정점 수축 및 세포 골격 조직 16,17이 포함됩니다. ABP는 세포의 전후축을 따라 단백질의 분포를 나타냅니다. 발달중인 심장에서 심근 세포의 ABP 조절은 심실 발달에 필요합니다18. PCP는 조직의 평면을 가로 질러 세포 내에서 단백질의 분극화 된 분포를 말하며 세포 분포를 조절합니다. 안정된 기하학적 구조를 가진 상피는 육각형 모양의 세포로 구성되며, 3 개의 세포 만 정점 19,20,21,22에서 수렴합니다. 상피 형태 형성 동안 발생하는 세포 분열, 이웃 교환 또는 박리와 같은 다양한 세포 과정은 꼭짓점에 수렴하는 세포의 수와 주어진 세포가 갖는 이웃 세포의 수를 증가시킵니다22. PCP와 관련된 이러한 세포 행동은 상이한 신호전달 경로, 액틴 역학, 또는 세포내 트래피킹에 의해 조절될 수 있다(23).

마우스에서 판막 발달을 연구하는 생성된 데이터는 E8.5 및 E9.5 배아 심장의 횡단, 관상 또는 시상 절편으로부터 얻어졌으며, 여기서 심내막은 세포의 장 대신에 세포의 선으로서 도시된다 - 심내막은 심장관(24)의 전체 내부 표면을 덮는다. 배아 절편은 마우스 배아의 심내막에서 PCP의 분석을 허용하지 않습니다. 우리의 새로운 실험 방법은 대표적인 결과에서 볼 수 있듯이 심내막 세포 분포, AJ 이방성 및 단일 세포 모양 분석을 가능하게 합니다. 이러한 유형의 데이터는 이 보고서에 표시되지 않은 PCP와 관련된 다른 분자에 대한 설명과 함께 PCP 분석에 필요합니다. 전체 장착 면역 형광, 특정 샘플 준비 및 유전자 변형 마우스의 사용은 마우스의 판막 발달 시작시 심내막에서 평면 극성 분석을 가능하게합니다.

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프로토콜

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동물 연구는 Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) 동물 실험 윤리위원회와 마드리드 공동체 (참조 PROEX 155.7 / 20)의 승인을 받았습니다. 모든 동물 절차는 실제 법령 1201/2005에 따라 스페인 법률에서 제정된 실험 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 동물의 보호에 관한 EU 지침 2010/63EU 및 권장 사항 2007/526/EC를 준수했습니다.

1. AVC 및 / 또는 OFT의 준수 (Xiao et al. 25)

  1. 오후에 여성 mTmG 와 남성 VE-Cadherin-Cre-ERT/+ 사이에 십자가를 설정하십시오.
  2. 다음날 아침, 질 플러그를 확인하십시오. 질 플러그가있는 경우 반나절 (E0.5)로 계산하십시오. 관심 있는 실험에 따라 8일 또는 9일을 계산합니다.
  3. 해부 24 시간 전에 옥수수 기름에 희석 한 5mg / mL 4-OH- 타목시펜 50μL로 임산부를 경구 위관 영양하십시오.
    참고: 이 용량은 GFP 양성 클론의 존재에 의해 밝혀진 제한된 양의 CRE 매개 재조합을 유도합니다. 적절한 용량은 4-OH- 타목시펜의 새로운 배치마다 결정되어야합니다.
  4. 자궁 경부 탈구로 E8.5 또는 E9.5에서 임산부를 희생하십시오.
  5. 임신 한 쥐의 복부를 가위로 열고 가위와 가느 다란 집게를 사용하여 배아가 들어있는 자궁을 제거합니다.
  6. 자궁을 0.1 % 트윈 -20 (PBT)과 함께 얼음처럼 차가운 1x 인산염 완충 식염수 (PBS)가 들어있는 페트리 접시에 넣습니다.
  7. 해부 현미경과 미세한 집게를 사용하여 자궁에서 개별 결정을 제거하십시오.
  8. 가는 핀셋을 사용하여 배아가 있는 디시두아의 흰색 부분을 절개하고 당기지 않도록 부드럽게 제거하고 끝이 잘린 P1000을 사용하여 신선한 PBT가 있는 새로운 페트리 접시에 배아를 옮겨 배아가 부러지지 않고 통과할 수 있을 만큼 큰 직경을 남깁니다.
  9. 유전형 분석을 위해 난황낭 (0.5mm2) 또는 꼬리 조각 (뒤쪽 끝에서 머리쪽으로 5-10 개의 체세포를 세는 것)을 가져 와서 100μL의 적절한 완충액으로 소화하십시오.
  10. 흄 후드 아래에서 배아를 4°C의 미세 원심분리기(2mL) 튜브에 담긴 멸균 여과된 PBS의 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드(4% PFA)로 옮깁니다. 배아를 뉴테이터에서 4°C에서 2시간에서 밤새(O/N)까지 고정합니다.
  11. 흄 후드 아래에서 배아를 건드리지 않고 미세 원심분리기 튜브에서 4% PFA 고정액을 제거합니다. PFA는 적절한 용기에 넣어 폐기하십시오.
  12. 차가운 PBT에서 배아를 실온(RT)에서 각각 10분 동안 5회 세척합니다.
  13. 가는 집게를 사용하여 심장을 제거하고 새 PBT가 있는 새 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

2. 마우스 배아 심장의 전체 마운트 면역 형광

  1. PBT를 PBSTr (PBS의 0.4 % 트리톤 X-100)로 교체하고 오비탈 셰이커의 RT에서 샘플을 각각 3 회, 5 분 동안 세척합니다.
  2. PBSTr을 차단 용액 (10 % 열 불 활성화 소 혈청이있는 PBSTr)으로 교체하십시오. 오비탈 셰이커에서 4°C에서 2시간에서 O/N까지 배양합니다.
  3. 차단 용액을 원하는 농도의 1차 항체가 포함된 차단 용액으로 교체합니다(항-GFP 또는 항-VE-Cadherin 항체의 경우 1:1000 희석액 사용). O/N을 4°C의 오비탈 셰이커에서 배양합니다.
  4. 4°C에서 O/N 인큐베이션 후, 오비탈 쉐이커 상에서 RT에서 1.5시간 동안 인큐베이션한다. 이 단계는 신호 대 잡음비를 높이는 데 매우 중요합니다.
  5. 최대 3번의 향후 실험을 위해 1차 항체 용액을 제거하고 4°C에서 유지합니다(최상의 보존을 위해 최종 농도 0.02%까지 아지드화 나트륨 추가).
  6. 배아를 PBSTr로 각각 3 분 동안 3 회 세척하십시오.
  7. 배아를 PBSTr 3x로 4°C에서 오비탈 쉐이커에서 각각 30분 동안 세척한다.
  8. 마지막 세척 후, 1차 항체 숙주 종에 대한 1:1000 형광 접합 2차 항체를 포함하는 차단 용액 1mL를 추가합니다. 또한 용액에 1:3000 DAPI를 첨가하고 배아 O/N을 4°C의 오비탈 쉐이커에서 배양합니다.
  9. 4°C에서 O/N 인큐베이션 후, 오비탈 쉐이커 상에서 RT에서 1.5시간 동안 인큐베이션한다. 이 단계는 신호 대 잡음비를 높이는 데 매우 중요합니다.
  10. 배아를 PBSTr로 각각 3 분 동안 3 회 세척하십시오.
  11. 배아를 PBSTr 3x-5x로 RT의 궤도 쉐이커에서 각각 30분 동안 세척합니다.

3. 마우스 배아 AVC 또는 OFT 장착

  1. PBS가 들어있는 페트리 접시 (35mm)에 하트를 놓습니다.
  2. 텅스텐 와이어와 가는 집게를 사용하여 AVC 또는 OFT를 분리하고 세로로 절단합니다(26).
  3. 커버슬립(22mm x 22mm), 슬라이드(60mm x 24mm), 집게, 적절한 팁이 있는 P200 피펫, 종이 타월 및 DAPI 없이 형광용 수성 글리세롤 기반 장착 매체를 준비합니다.
  4. Xiao, C. et al.25에서와 유사한 접근 방식을 사용하여 0.3-0.6cm 떨어진 슬라이드에 두 개의 테이프 스트립을 붙여 샘플이 찌그러지지 않고 원래 모양을 보존 할 수있는 3D 실내 공간을 만듭니다.
  5. 조심스럽게 최소 부피의 버퍼를 사용하여 절단된 P200 팁 피펫을 사용하여 테이프 스트라이프 사이의 슬라이드에 샘플을 떨어뜨립니다. 정확도를 높이려면 해부 현미경을 사용하십시오.
  6. 가는 집게를 사용하여 심내막이 위를 향하도록 샘플을 놓습니다(슬라이드에서 심근 아래로).
  7. 종이 타월로 과도한 PBS를 제거한 다음(샘플을 만지지 마십시오) RT에서 1-2분 동안 샘플을 건조시켜 샘플이 슬라이드에 달라붙도록 합니다.
  8. 40μL의 수성 기반 장착 매체를 조직에 추가합니다.
  9. 두 개의 테이프 위에 커버 슬립을 놓고 바늘이나 집게로 티슈 위로 천천히 내립니다. 기포를 만들지 마십시오.
  10. 커버슬립의 각 꼭지점에 매니큐어 한 방울을 사용하여 커버슬립을 밀봉합니다.
  11. 매니큐어가 마르면 흡수성 종이 타월을 사용하여 커버슬립 측면에서 과도한 장착 매체를 청소합니다. 커버 슬립을 움직이지 마십시오.
  12. 커버슬립 가장자리를 따라 매니큐어를 추가하여 완전히 밀봉하여 장착 용지 증발을 방지합니다.
  13. 직립 또는 도립 컨포칼 현미경을 사용하여 일반 보기의 경우 10x로, 자세한 이미지의 경우 3x 줌으로 63x로 이미지를 촬영합니다.

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결과

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이 프로토콜을 사용하여 생성 된 데이터는 수행 할 수 있음을 보여줍니다 en AVC의 심내막의 얼굴 영상. 첫 번째 목표는 세포 분해능에서 판막을 형성하는 동안 심내막의 세포 모양을 분석하는 것이 었습니다 (그림 1). E9.5에서 개별 심내막 세포를 강조하기 위해, 우리는 두 개의 트랜스제닉 마우스 균주를 사용하였다. (1) ROSA mT / mG는 세포막에서 형광이 검출되는 2 색 형광 Cre 리포터 대립 유전자 (tdTomato / mT 및 EGFP / mG)입니다. Cre-매개 활성화가 없으면 전이유전자는 tdTomato (mT)를 발현합니다. Cre-매개 활성화 시, tdTomato 발현은 특정 세포 및 클론 유도체27에서 EGFP 형광 발현 (mG)으로 대체된다. (2) Cdh5CreE...

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토론

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심내막은 배아 심장 튜브의 전체 내부 표면을 덮는 상피 단층입니다. 판막 발달 동안 장래의 판막 부위의 심내막 세포는 EMT를 겪으므로 심내막 세포는 세포 골격을 변형시키고 재배열하여 심내막에서 심장 젤리쪽으로 박리됩니다. 우리와 다른 사람들은 심내막이 세포 6,8,24,32의 행으로 표시되는 E8.5 및 E9.5 배아 심장의 횡단 절편을 분석하여 마우스 배아의 판막 발달에 대한 관련 데이터를 얻었습니다. 이 접근법은 신호 전달 경로 및 판막 발달에 관여하는 다른 분자의 발현을 분석 할 수 있었지만 판막 전 심내막의 공간적 측면을 분석하는 것은 불가능했습니다.

AVC 또는 OFT 외식편은 주로 3D 콜라겐 겔 상에서 형질전환 EC를 연구하는 데 사용되...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 MCIN/AEI/10.13039/501100011033에서 J. L. P. J.G.-B에 대한 보조금 PID2019-104776RB-I00 및 CB16/11/00399(CIBER CV)의 지원을 받았습니다. 마드리드 코무니다드 (2020-5ª/BMD-19729)의 프로그램 데 아트라시온 데 탤런토가 자금을 지원했습니다. TG-C. Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054)가 자금을 지원했습니다. MCIN/AEI /10.13039/501100011033 및 FEDER "A way to make Europe"(#ICTS-2018-04-CNIC-16)이 공동 자금을 지원한 CNIC 단위의 현미경 및 동적 이미징, CNIC, ICTS-ReDib에 감사드립니다. 우리는 또한 마우스 사육에 대해 A. Galicia와 L. Méndez에게 감사드립니다. 이 출판물의 비용은 유럽 지역 개발 기금의 기금으로 부분적으로 지원되었습니다. CNIC는 ISCIII, MCIN 및 Pro CNIC 재단의 지원을 받으며 MCIN/AEI /10.13039/501100011033에서 자금을 지원하는 세베로 오초아 우수 센터(보조금 CEX2020-001041-S)입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4-OH-TamoxifenSigma AldrichH-6278
16% Paraformaldheyde전자 현미경 과학157-10물에 4%로 희석
Anti-GFPAves LabsFGP-1010
anti-VECadherinBD Biosciences555289
Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11039
염소 안티 마우스 Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch115-605-174
DAPIAppliChemA4099,0005
슬라이드 Superfrost PLUSVWR631-010825 mm x 75 mm x 1.0 mm
Triton X-100Sigma AldrichX100-100ML
트윈 20A4974,0500AppliChem
Vectashield 마운팅 미디엄벡터 연구소H-1000-10

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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