신생아 대장균 균 혈증 분리물의 장 트랜스사이토시스 평가

요약

대장균은 출생 무렵에 박테리아를 섭취하는 신생아에게 패혈증을 일으킵니다. 대장균이 장내에서 혈류로 이동하는 능력과 관련된 과정은 잘 이해되지 않았습니다. 이 시험관 내 모델은 대장균 균주가 장 상피 세포를 통해 이동하는 능력을 평가합니다.

초록

신생아는 분만 시기에 장을 식민지화하는 모체 대장균 균주를 섭취합니다. 장을 가로질러 전위할 수 있는 능력을 가진 대장균 균주는 신생아의 혈류를 침범하여 생명을 위협하는 균혈증을 유발합니다. 여기에 제시된 방법론은 반투과성 삽입물에서 성장한 편광 장 상피 세포를 활용하여 시험관 내에서 분리된 신생아 대장균 균혈증의 트랜스사이토시스를 평가합니다. 이 방법은 합류하여 성장하여 단단한 접합부와 데스모좀을 형성하는 능력을 가진 확립된 T84 장 세포주를 사용합니다. 합류점에 도달한 후 성숙한 T84 단층은 전압계를 사용하여 정량화할 수 있는 경상피 저항(TEER)을 발생시킵니다. TEER 값은 장 단층에 걸쳐 박테리아를 포함한 세포 외 성분의 세포 외 투과성과 반비례 관계가 있습니다. 반면에 박테리아의 세포 횡단 통과 (transcytosis)는 반드시 TEER 측정을 변경하지는 않습니다. 이 모델에서는 감염 후 최대 6시간 동안 장 단층을 가로지르는 박테리아 통과를 정량화하고 TEER을 반복적으로 측정하여 세포 투과성을 모니터링합니다. 또한, 이 방법은 분극화된 상피를 가로지르는 박테리아 트랜스사이토시스 동안 단단한 접합부 및 기타 세포 간 접착 단백질의 구조적 변화를 연구하기 위해 면역염색과 같은 기술의 사용을 용이하게 합니다. 이 모델의 사용은 신생아 대장균이 장 상피를 가로 질러 트랜스 사이토 화하여 균혈증을 생성하는 메커니즘의 특성화에 기여합니다.

서론

대장균은 신생아에서 조기 발병 패혈증의 가장 흔한 원인입니다 ^1,2,3. 신생아 대장균 균혈증의 사망률은 40 %에 달할 수 있으며 수막염은 심각한 신경 발달 장애와 관련된 가능한 합병증입니다². 신생아가 모체 대장균 균주를 섭취하면 신생아 균혈증이 발생할 수 있습니다. 이 과정은 동물 모델 ^2,4에서 복제되었습니다. 일단 섭취되면 병원성 박테리아는 신생아 장 내강에서 장 장벽을 넘어 혈류로 들어가 패혈증을 유발합니다. 균혈증을 생성하는 신생아 침습성 대장균 균주는 장 상피 세포를 침범하는 능력이 다양합니다 ^1,5. 그러나 침범 후 장 상피를 트랜스사이토이스하는 능력은 완전히 특성화되지 않았습니다.

이 장 트랜스사이토시스 모델은 장 상피를 가로지르는 박테리아 통로를....

프로토콜

알림: 오염을 방지하기 위해 생물안전 레벨 84(BSL-2) 안전 캐비닛에서 T2 세포, 박테리아, 플레이트 및 시약의 모든 조작을 수행하십시오. 멸균 T84 세포, 감염된 T84 세포 및 대장균과 관련된 모든 작업에 별도의 영역과 인큐베이터를 사용하십시오. 여기에 설명된 방법으로 테스트한 임상 대장균 분리는 우리 기관 ^1,16의 기관 검토 위원회의 지침에 따라 획득되었습니다.

1. T84 세포로 트랜스사이토시스 삽입물 준비(실험 약 1-2주 전)

1. Dulbecco의 변형 독수리 배지 : Ham의 F-12 영양소 혼합물 (1 : 1, 최종 농도 : 각각 50 %), 5 % 태아 소 혈청 및 1 % (100 U / mL) 페니실린 / 스트렙토 마이신 이중 항생제 혼합물로 구성된 조직 배양 배지 (TCM + 항생제)에서 미국식 배양 컬렉션 (ATCC) T84 세포를 성장시킵니다. 세포를 37°C에서 5%_CO2로 배양한다.
   알림: 페니실린/스트렙토마이신(항생제가 없는 TCM)이 없는 이 배지 제형의 변형이 절차의 이후 단계(섹션 2 이후)에 ....

결과

그림 1: 시간 경과에 따른 T84 TEER. T84 셀층이 인서트에서 성숙함에 따라 단층의 전기 저항이 증가합니다. 적어도 1,000 Ω·^cm2의 TEER에서, 세포층은 세포내 박테리아 수송을 감소시키고 주로 세포경질 박테리아 수송의 측정을 허용하기에 충분히 발달된다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

섹션 1에 설명된 멸균 T8.......

토론

이 방법은 위장병 학 및 전염병²⁰에서 사용되는 기술로부터 유도된다. 장 상피 장벽의 시험관 내 모델은 내강 내용물이 선천성 면역의 관련 구성 요소와 상호 작용하는 메커니즘을 밝히기 위해 사용되었습니다 ^6,8. 침습성 신생아 대장균의 숙주-병원체 상호 작용은 또한 유전자 분석, 항생제 내성 연구 및 면역학적 기술 1,5,16,21을 통해 별도로 특성화되었습니다. 그러나 대장균 신생아 분리 물이 장을 통해 혈류로 들어가는 능력을 뒷받침하는 분자 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10,000 U/ mL 페니실린/스트렙토마이신 혼합물	Fisher Scientific	15-140-122
15mL 멸균 원추형 튜브	MidSci	C15B
2mL 마이크로 원심분리기 튜브	Avant	AVSS2000
50mL 멸균 폴리프로필렌 원추형 튜브	Falcon	352070
흡인기	Corning	4930
생물 안전 캐비닛	Labconco	30441010028343	이 중 세 가지가 방법에 사용됩니다 : 하나는 멸균 조직 작업, 다른 하나는 감염된 조직 작업, 다른 하나는 박테리아 작업입니다.
원심분리기	Sorvall	Legend RT
일회용 접종 루프	Fisherbrand	22363605
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-084
상피 볼트/옴 미터	World Precision Instruments	EVOM2
소 태아 혈청	Fisher Scientific	10437028
Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11765-047
Hemacytometer	Sigma Aldrich, Bright Line	Z359629
Incubator shaker	New Brunswick	Innova 4080
Incubators	Thermo Scientific	51030284	이 중 세 가지가 이 방법에 사용됩니다: 하나는 무균 조직 배양, 다른 하나는 감염된 조직 배양, 다른 하나는 박테리아 배양입니다.
용액 국물	Difco	244610
용원 국물 한천	IBI 과학	IB49101
니콘 이클립스 TS2R 현미경	니콘
분광 광도계	Unico	1100RS
T84 장 세포	미국 조직 배양 컬렉션	CCL248
조직 배양 인서트, 폴리에틸렌 트레프탈레이트 멤브레인 포함, 3 µ M 모공,  24웰 형식	Falcon	353096
조직 배양 플레이트, 24	Falcon	353504
Trypan 블루 스테인	Fisher Scientific	T10282

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