ATAC-seq는 과민성 돌연변이 트랜스포자제 Tn5를 사용하여 전사 인자에 의해 매개되는 염색질 접근성의 변화를 매핑하는 DNA 시퀀싱 방법입니다. ATAC-seq는 암세포의 표현형 변화의 기초가되는 분자 메커니즘의 발견을 가능하게합니다. 이 프로토콜은 암세포를 포함한 상피 세포 유형에서 ATAC-seq에 대한 최적화 절차를 간략하게 설명합니다.
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방법 논문
암 후성유전학 연구를 위한 ATAC-Seq 최적화
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
고처리량 시퀀싱(ATAC-seq)을 사용한 트랜스포자제 접근 염색질에 대한 분석은 과민성 Tn5 트랜스포아제를 사용하여 디옥시리보 핵산(DNA) 접근성을 프로브합니다. Tn5는 접근 가능한 염색질 영역 내에서 고처리량 시퀀싱을 위해 어댑터를 절단하고 연결합니다. 진핵 세포에서 게놈 DNA는 DNA, 히스톤 및 기타 단백질의 복합체인 염색질로 포장되어 전사 기계에 대한 물리적 장벽 역할을 합니다. 외적 신호에 반응하여, 전사 인자는 유전자 활성화를 위한 전사 기계에 접근할 수 있도록 염색질 리모델링 복합체를 모집합니다. 따라서, 개방된 염색질 영역을 확인하는 것은 암 진행과 같은 생물학적 사건 동안 인핸서 및 유전자 프로모터 활성을 모니터링할 때 유용하다. 이 프로토콜은 사용하기 쉽고 세포 입력 요구 사항이 낮기 때문에 ATAC-seq는 암세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 열린 염색질 영역을 정의하는 데 널리 채택되었습니다. 성공적인 데이터 수집을 위해서는 ATAC-seq 라이브러리를 준비할 때 몇 가지 파라미터를 고려해야 합니다. 그 중 세포 용해 완충액의 선택, Tn5 효소의 적정 및 세포의 시작 부피는 암세포에서 ATAC-seq 라이브러리 준비에 중요합니다. 최적화는 고품질 데이터를 생성하는 데 필수적입니다. 여기에서는 상피 세포 유형에 대한 ATAC-seq 최적화 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다.
서론
염색질 접근성은 게놈전체 규모에서 유전자 발현을 조절하기 위한 핵심 요구 사항입니다1. 염색질 접근성의 변화는 종종 암 2,3,4를 포함한 여러 질병 상태와 관련이 있습니다. 수년에 걸쳐 연구자들이 염색질 접근성 영역을 매핑하여 염색질 환경을 조사할 수 있도록 수많은 기술이 개발되었습니다. 그 중 일부에는 DNase-seq(DNase I 과민성 부위 시퀀싱)5, FAIRE-seq(조절 요소의 포름알데히드 보조 분리)6, MAPit(개별 템플릿에 대한 메틸트랜스퍼라제 접근성 프로토콜)7 및 이 논문의 초점인 ATAC-seq(전이효소 접근 가능한 염색질에 대한 분석)8이 포함됩니다. DNase-seq는 DNase의 주요 특징, 즉 히스톤 및 전사 인자5와 같은 기타 단백질이 없는 네이키드 DNA의 우선적 소화를 사용하여 접근 가능한 영역을 매핑합니다. CHIP-seq와 유사한 ....
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프로토콜
1. 실험 시작 전 준비
- 용해 완충액을 준비하십시오.
참고: 최적의 핵 분리 버퍼는 각 세포 유형에 따라 다를 수 있습니다. 트리판 블루 염색을 사용하여 각 세포 유형에 대해 원본 논문8에 사용된 저장성 완충액과 CSK 완충액12,13을 모두 테스트하는 것이 좋습니다.- 저장성 완충액(그린리프 완충액)을 제조하기 위해, 10 mM 트리스-HCl pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mMMgCl2, 및 0.1% NP-40을 혼합한다.
- CSK 완충액을 제조하기 위해, 10 mM 파이프 pH 6.8, 100 mM NaCl, 300 mM 수크로스, 3 mMMgCl2, 및 0.1% 트리톤 X-100을 혼합한다.
- 세포 배양 조건이 최적인지 확인하십시오. 광학 현미경으로 세포를 검사하여 세포 사멸 수준이 높지 않은지 확인하십시오.
- 원심 분리기를 켜서 4 ° C에 도달하도록합니다.
2. 세포 수확
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결과
성공적이고 고품질의 ATAC-seq 데이터를 얻으려면 실험 조건을 최적화하는 것이 중요합니다. ATAC-seq 라이브러리 준비는 세포 용해, 태그먼트(Tn5에 의한 단편화 및 어댑터 삽입), 게놈 DNA 정제, PCR 증폭 및 데이터 분석의 5가지 주요 단계(그림 1)로 분리할 수 있습니다. 초기 과정으로, 세포 용해 (핵 분리) 완충액은 먼저 각 세포 유형에 대해 최적화되어야합니다. 원래의 ATAC-seq 논문8 또는 CSK 완충액12,13에 기술된 저장성 완충액을 사용하여 유방암 세포를 용해시켰다. 트리판 블루 염색은 핵 분리18을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. MDA-MB-231, T47D, MCF7 및 A375 세포와 같은 인간 암 세포주에서 ATAC-seq 라이브러리 준비를 .......
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토론
ATAC-seq는 개방 및 활성 염색질 영역을 매핑하는 데 널리 사용되었습니다. 암세포 진행은 종종 유전적 변형과 후성유전학적 재프로그래밍에 의해 주도되어 염색질 접근성과 유전자 발현이 변경됩니다. 이러한 재프로그래밍의 예는 상피-중간엽 전이(EMT) 및 이의 역과정인 중간엽-상피로의 전이(MET) 동안 볼 수 있으며, 이는 종양 전이 동안 주요 세포 재프로그래밍 과정으로 알려져 있다(30). 또 다른 예는 호르몬 요법에 대한 약물 내성의 획득이 종종 내강 유방 종양에서 관찰된다는 것이다31. ATAC-seq는 염색질 수준에서 이러한 세포 표현형 변화를 모니터링하는 데 유용하며 기원 세포 및 암 아형을 예측하는 데 사용할 수 있습니다4.
ATAC-seq에 의한 염색질 리모델링을 정확하게 측정하려면 재현 가능하고 일관된 프로토콜을 수립해야 합니다. 이 원.......
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공개 사항
저자는이 논문에 설명 된 연구와 관련된 관련 또는 물질적 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
UND 유전체학 핵심 시설에 탁월한 기술 지원에 감사드립니다.
이 연구는 국립 보건원 [P20GM104360에서 M.T., P20 GM104360에서 A.D.]과 노스 다코타 대학교 의과 대학 및 건강 과학 대학 생물 의학과에서 제공 한 창업 기금에서 자금을 지원했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µ L XL TipOne 팁 | USA Scientific | 1120-3810 | 여과 및 저유지 |
| 100 &마이크로; L XL TipOne RPT 팁 | USA Scientific | 1182-1830 | 여과 및 저유지 |
| 100 &마이크로; L XL TipOne 팁 | USA Scientific | 1120-1840 | 여과 및 저유지. 경사진 등급 |
| 15 mL 원추형 원심분리기 튜브 | Corning | 352096 | |
| 20 µ L TipOne RPT 팁 | USA Scientific | 1183-1810 | 여과 및 저유지 |
| 200 &마이크로; L TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | 여과 및 저잔류 |
| 50mL 원심분리기 튜브 | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | 유전자 분석 등급 |
| 이 연구에 사용된 모든 세포주는 ATCC, | ATCC, | ||
| Allegra X-30R 원심분리기 | Beckman Coulter | 364658에서 얻었습니다. | SX2415 |
| AMPure XP 비드 | Beckman Coulter | A63881 | 비드 정제 키트 |
| CellDrop 세포 계수기 | DeNovix | CellDrop FL | 세포 계수기 |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, 무수, ≥ 99% (적정) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| 에탄올 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | 무수; Fisher Scientific - Decon Labs 살균 제품 |
| 태아 소 혈청 - TET 테스트 R | & D 시스템 | S10350 | 트리플 0.1 &마이크로; m 여과된 |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-글루코스; [+] L-글루타민; [-] 피루브산 나트륨 |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), 페놀 레드 |
| 글리세롤 | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| 글리신 | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit 형광측정기 | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR 정제 키트 | Qiagen | 28004 | DNA 정제 키트 |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥ 98%(산성계), 펠릿(무수) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR 마스터 믹스 | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA 시료 전처리 키트 | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD 및 Tn5 Transposase |
| NP - 40 (IGEPAL CA-630) | 분자생물학용 | MilliporeSigma | I8896 |
| PCR 검출 시스템 | BioRad | 1855484 | CFX384 실시간 시스템. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance 인증, 세포 배양에 적합 |
| Qubit dsDNA HS 어세이 키트 | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; 핵산 정량 분석 키트 |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| 아세트산나트륨 | 홈메이 | 드- | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-튜브 스트립 | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, 천연, 폴리프로필렌 |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | 단일 노치. 천연 폴리프로필렌 |
| 트리스 베이스 | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL 등급 |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq 듀얼 인덱스 시퀀싱 프라이머 키트 | Illumina | PE-121-1003 | 쌍단 |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, 점성 액체 |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | 멸균 여과, BioReagent, 세포 배양에 적합 |
참고문헌
- Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
- Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).<....
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재인쇄 및 허가
