등온 적정 열량계를 사용하여 DNA 압타머와 테트라사이클린의 열역학적 및 동역학적 연관성 결정

요약

본 프로토콜은 샘플 준비, 실행 표준 및 샘플을 포함하여 DNA 압타머와 테트라사이클린 간의 결합의 연관성 및 해리 역학을 분석하고 결과 데이터를 해석하기 위한 등온 적정 열량측정법(ITC)의 사용을 설명합니다.

초록

압타머와 그 표적 사이의 결합 친화도와 거동을 결정하는 것은 적용을 위해 압타머를 선택하고 사용하는 가장 중요한 단계입니다. 압타머와 저분자 사이의 급격한 차이로 인해 과학자들은 결합 특성을 특성화하는 데 많은 노력을 기울일 필요가 있습니다. 등온 적정 열량측정법(ITC)은 이러한 목적을 위한 강력한 접근 방식입니다. ITC는 분리 상수(_Kd)를 결정하는 것 이상으로 용액 단계에서 두 분자 간의 상호 작용에 대한 엔탈피 변화 및 결합 화학량론을 제공할 수 있습니다. 이 접근법은 표지가 없는 분자를 사용하여 연속 적정을 수행하고 각 적정에 의해 생성된 결합 이벤트에 따라 시간이 지남에 따라 방출되는 열을 기록하므로 공정은 거대분자와 작은 표적 간의 결합을 민감하게 측정할 수 있습니다. 본 명세서에서는 선택된 압타머와 소형 표적인 테트라사이클린의 ITC 측정의 단계별 절차를 소개합니다. 이 예는 기술의 다양성과 다른 응용 분야에 대한 잠재력을 입증합니다.

서론

압타머는 원하는 표적 ^1,2에 대한 높은 결합 친화도 및 특이성을 갖는 진화 과정을 통해 선택된 ssDNA 또는 RNA 단편으로, 고급 인식 요소 또는 화학 항체 ^3,4,5로 작용할 수 있습니다. 따라서, 표적에 대한 압타머의 결합 친화도 및 특이성은 압타머의 선택 및 적용에 결정적인 역할을 하며, 등온 적정 열량측정법(ITC)이 이러한 특성화 목적으로 널리 사용되어 왔다. 압타머의 친화도를 측정하기 위해 ITC, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 비색 적정, 마이크로 스케일 열영동(MST) 및 바이오층 간섭계(BLI)를 포함한 많은 접근법이 사용되었습니다. 그 중 ITC는 용액 단계에서 두 분자의 열역학적 및 운동 적 결합을 결정하는 최신 기술 중 하나입니다. 이 접근법은 표지가없는 분자를 사용하여 연속 적정을 수행하고 각 적정 ^6,7에 의해 생성 된 결합 이벤트에 따라 시간이 지남에 따라 방출 된 열을 기록합니다. 다른....

프로토콜

참고: 그림 2 는 DNA 앱타머와 테트라사이클린의 열역학적 및 동역학적 연관성을 결정하기 위한 ITC 실험의 주요 단계를 보여줍니다.

1. 시료 준비

참고: ITC용 샘플은 샘플 셀과 주사기의 다른 버퍼를 혼합하여 발생하는 열 방출을 방지하기 위해 압타머와 리간드 모두에 대해 동일한 버퍼에서 준비해야 합니다. 이는 일반적으로 모든 물질을 동일한 완충액으로 투석하여 달성됩니다. 버퍼는 아래와 같이 일부 수정 된 3kDa 분자량 컷오프 (MWC) 농축기의 프로토콜에서 채택 된 프로토콜을 사용하여 교환됩니다.

1. 다음 단계를 사용하여 제조업체에서 구입한 1x PBS, pH 7.4로 투석 컬럼(3kDa MWC)의 멤브레인을 활성화합니다: 1x 버퍼(PBS)로 채우고, RT에서 10분 동안 평형화하고, 5,000 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다.
2. 완충액을 제거하고 500μL의 압타머 샘플을 컬럼에 넣고 5,000 x g에서 원심분리한 다음 4x 반복하여 원래 완충액을 1x PBS로 교환합니다. 완충액이 막을 통과하면 질량이 3kDa 미만인 모든 분....

결과

ITC는 정확한 분리 상수 (K_d), 결합 화학 양론 및 2 분자 상호 작용의 열역학적 매개 변수를 제공합니다⁶. 이 예에서, Kim et al.9,11에 의해 선택된 압타머는 Kd1 = ¹³ μM^, _Kd2 = 53 nM의 결합 친화도를 갖는 테트라사이클린에 결합한다. 흥미롭게도, 이러한 결합은 평형 여과법 및 63.3 nM의 보고된_Kd를 사용하여 결정되었으며, 이는 유리한 결합 부위(부위 2)와 크게 다르지 않다. ITC의 피팅 모델과 화학량론은 압타머가 순차 결합 모델과 2:1 결합비를 통해 테트라사이클린에 결합한다는 것을 반영합니다(그림 4, 표 1).<.......

토론

여기에 제시된 방법은 TA Instruments의 지시에 따라 수정되었으며 당사 센터에서 선택된 많은 압타머 및 표적의 결합 친화도 및 열역학을 결정하기에 충분합니다. 이 절차의 중요한 단계에는 리간드와 일치하는 표적을 갖도록 버퍼를 교환하고, 적절한 매개 변수로 샘플을 실행하고, 데이터를 분석하기 위한 적절한 결합 피팅 모델을 찾는 것이 포함됩니다. 열 방출을 지속적으로 기록하려면 버퍼의 불일치, 셀과 주사기의 더러움, 샘플 내부의 기포와 같은 모든 노이즈 열을 제거해야 합니다. 완충액 교환 단계에서는 소분자를 직접 교환하는 것이 비싸기 때문에 리간드를 용해시키기 위해 투석막 또는 스핀 컬럼에 마지막 투석 완충액 또는 유동 완충액을 사용하는 것이 좋습니다.

대부분의 다른 결합 친화도 결정 방법은 압타머와 리간드 사이의 1:1 결합 비율을 가정합니다. 그러나 결합 거동과 소분자와 압타머 사이의 크기가 크게 다르기 때문에 1:1 결합 모델이 항상 정확한

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'Integrated	DNA Technologies, Inc		염기서열은 ITC를 사용하여 Kd를 식별하지 못한 Gu의 연구에서 채택되었습니다(참고 문헌 8 및 9 참조)
Affinity ITC Auto Low Volume (190 µ L) 시스템 완성– Gold Cells	TA Instruments	61000.901	등온 적정 열량계
시스템 CaCl2	Avantor (VWR)	E506-100ML	염화칼슘 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile
Centrifuge	Eppendorf	5417R	Eppendorf 5417R은 안전성, 신뢰성, 사용 편의성 면에서 타의 추종을 불허합니다. 최대 16,400RPM까지 회전하고 최대 RCF는 최대 25,000 x g까지 회전하는 브러시리스 모터로 유지 관리가 매우 쉽습니다.
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EDTA	TekNova	E0375	EDTA 500 mM, pH 7.5
NanoDrop One Microvolume UV-Vis 분광 광도계	ThermoFisher	ND-ONE-W	UV-Vis 분광 광도계
Nanosep, Nanosep MF 및 NAB 원심	Pall Laboratory	OD030C34	3 kDa 분자량 차단 농축기
PBS pH 7.4	IBI Scientific	IB70165	Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate 및 Potassium chloride를 포함하는 완충액 0.2 µ를 사용하여 여과된 초순수 등급 멸균; M 필터. 121 °에서 오토클레이브; C 20분 이상
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