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방법 논문

방사선 유발 피부 및 근육 섬유증에 대한 견고하고 재현 가능한 모델 구축

1.8K 조회수

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DOI:

10.3791/64251

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2022년 8월 31일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic Surgery, University of Pittsburgh, 2Department of Forensic Medicine and Toxicology, HBS Medical and Dental College, 3Department of Radiation Oncology, University of Pittsburgh Cancer Institute

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 생쥐의 뒷다리에서 방사선 유발 피부 섬유화를 유도하는 프로토콜을 제시하고 사지 편위 및 보행 지수 분석을 통해 만성 손상의 방사선 조사 후 측정을 수행하여 기능적 결과를 평가합니다. 이 모델은 방사선 관련 피부 섬유증 메커니즘을 설명하고 무증상 치료 연구에 유용합니다.

초록

방사선 유발 피부 섬유증(RISF)은 암 치료, 우발적 노출 또는 테러 행위를 포함한 다양한 시나리오로 인해 발생할 수 있습니다. 방사성 빔은 피부를 관통하여 피부, 근육 및 내부 장기를 포함한 경로에 있는 구조에 영향을 미칠 수 있습니다. 피부는 방사선에 가장 먼저 노출되는 구조이며 치료가 어려운 만성 섬유증으로 발전하기 쉽습니다. 현재 제한된 치료 옵션은 방사선 관련 피부 섬유증을 완화하는 데 중간 정도의 효능을 보이고 있습니다. 효과적인 대책 개발을 방해하는 핵심 요인은 실험 결과를 인간에게 적용할 수 있는 편리하고 강력한 모델이 없다는 것입니다. 여기서, 기능적 및 분자 회복을 위한 가능한 제제의 예방 및 치료 평가를 위해 강력하고 재현 가능한 쥐 뒷다리 피부 섬유증 모델이 확립되었습니다.

오른쪽 뒷다리에 40(Gray) Gy를 1회 투여하여 피부 섬유화를 유도했습니다. 피험자들은 초기 단계에서 부종과 피부염이 발생했으며, 이는 눈에 보이는 피부 수축으로 진행되었습니다. 방사선 조사된 팔다리는 다음 몇 주 동안 사지 운동 범위가 현저히 감소한 것으로 나타났습니다. 말기에 이르러 급성 부작용은 가라앉았지만 만성 섬유증은 지속되었습니다. 보행 지수는 기능 장애의 발달을 입증하는 추가 기능 분석으로 수행되었습니다. 이러한 비침습적 방법은 섬유증 진행을 추적하기 위한 신뢰할 수 있는 측정을 보여주었으며, 이는 조직학적 분석에 의해 뒷받침됩니다. 이 모델에 사용된 방사선량, 응용 프로그램 및 방사선 조사 후 분석은 방사선 유발 피부 섬유증을 연구하고 치료제의 효능을 테스트하기 위한 강력하고 재현 가능한 방법을 제공합니다.

서론

피부는 신체에서 가장 큰 기관으로, 신체를 덮고 위험으로부터 보호합니다. 그것은 표피, 진피 및 하피의 세 가지 뚜렷한 층을 가지고 있습니다. 각 층에는 고유한 기능이 있습니다: 표피는 탈수와 미생물 침입을 방지합니다. 진피는 풍부한 세포 네트워크와 인장 강도와 탄력성 1을 제공하는 세포 외 기질을 가지고 있습니다. 진피층에는 감각 수용체(sensory receptor), 모낭(hair follicles), 분비샘(gland), 림프관(lymphatic) 및 모세혈관망(capillary network)을 위한 혈관이 있습니다. 지방 조직이 풍부한 피하 또는 피하 조직은 신체의 윤곽을 형성하고 기계적 스트레스를 분산시킵니다 2,3,4.

사고, 전쟁, 테러 또는 치료 요법의 결과로 생성된 방사선은 선형적으로 진행되어 신체를 관통하여 피부가 가장 먼저 접촉하는 기관이 되도록 합니다. 산업, 의료 시설 및 군사 시설에서 방사성 물질의 사용이 증가함에 따라 이러한 사고의 위협이 심화되었다5. 임상적으로 피부에 대한 방사선 손상은 급성 방사선 증후군(ARS)의 4가지 하위 증후군 중 하나인 피부 방사선 증후군(CRS)을 특징으로 합니다. 전리 방사선에 대한 피부의 반응은 치료와 추가 손상으로부터 보호하는 데 중요한 영향을 미친다6. 화상 및 외상과 같은 부상이 방사선 부상과 결합될 경우 임상 결과를 더욱 복잡하게 만든다7. 방사선에 대한 피부 노출의 정도는 복귀 불능 임계값(point-of-return threshold)과 관련이 있으며, 다른 장기의 손상은 단일 또는 다중 장기 부전을 초래하고 궁극적으로 환자의 사망으로 이어집니다 8,9. 피부 방사선 손상은 급성기와 만성기로 구성됩니다. 급성 방사선 손상은 임상적으로 홍반, 피부 부종, 피부염, 물집, 표피 탈피, 건성 또는 습성 박리, 궤양, 모발 및 손발톱의 변화로 나타납니다. 만성기는 피부 위축, 섬유증, 만성 궤양, 모세혈관 확장증으로 나타난다10,11. 일반적으로 급성 영향은 주로 표피에서 나타나는 반면 만성 영향은 진피에서 가장 두드러집니다. 방사선 노출에 대한 급성 반응은 노출 후 12시간 이내에 유사분열 활성의 현저한 감소로 이어지며, 이어서 충혈, 세포 비대, 액화, 핵 발열 및 단편화가 뒤따릅니다 4,12.

방사선량이 40Gy를 초과하면 습윤 박리와 표피 손실이 발생하여 감염에 대한 감수성이 증가한다13. 또한 피부가 방사선에 노출되면 사이토카인 생성이 유도되어 진피층에서 염증성 면역 반응을 유발합니다. 주요 염증 매개체로는 인터류킨(interleukins, IL-1, IL-3, IL-5, IL-6, IL-8)과 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-, TNFα)이 있습니다14. 염증을 해결하지 못하면 결국 방사선 손상 부위에 섬유증이 발생할 수 있다15. 추가적인 신체적 상처나 열 부상은 근육층을 통해 확장되어 이러한 섬유화 반응을 더욱 악화시킵니다16. 형질전환 성장 인자 β(TGFβ)은 섬유증 발병의 핵심 사이토카인입니다17. 현재로서는 유망한 결과를 보여주는 치료 옵션이 거의 없으며, 대다수는 환자의 순응도에 어려움을 겪을 수 있습니다. 다양한 방사선 선량에 대한 피부의 세포 및 분자 반응을 탐구하는 추가 연구는 방사선 유발 피부 병태생리학에 대한 이해를 높이고 새로운 치료법의 개발을 향상시킬 것입니다.

방사선으로 인한 피부 및 연조직 손상 완화에 대한 전임상 모델에서 연구 결과의 임상적 번역을 용이하게 하기 위해서는 방사선 조사 후 치료 개입에 대한 관련성이 높은 실험 모델을 설계하는 것이 중요합니다. 방사선 유발 손상의 시험관 내 및 생체 내 모델 모두에 대해 설명되었으며, 여기에는 방사선 조사된 내피 세포(18,19), 섬유아세포(20) 또는 각질세포(19)의 세포 배양 모델 및 생체 내 설치류, 돼지 및 비인간 영장류 동물 모델이 포함됩니다. 설치류 모델은 방사선 손상에 대한 반응이 인간과 유사하고 유전자 조작의 유연성이 뛰어나기 때문에 방사선 연구에 널리 사용됩니다21. 방사선 선량 요구량은 박리, 섬유증 및 괴사와 같은 유사한 결과를 추구할 때 인간보다 설치류에서 더 높다16,22. 방사선에 대한 반응을 측정하기 위한 채점 기준에 대한 설명은 방사선 피부 손상에 대한 설치류 모델의 채택을 더욱 강화했습니다21,23.

전임상 환경의 현재 연구는 방사선으로 인한 피부 손상의 메커니즘을 이해하고 치료 옵션을 개발하는 데 중점을 두고 있습니다. 따라서 높은 임상적 번역성을 가진 방사선 인슐레이션을 생성하기 위해 강력하고 재현 가능한 전임상 모델을 확립하는 것이 필수적입니다. 이 연구는 최적화된 방사선량과 전달 기술을 사용하여 피부 섬유증의 쥐 모델을 설명합니다. 기능적, 조직학적, 분자적 측정을 결합한 본 모델은 섬유증 발병 메커니즘을 효과적으로 연구하고 새로운 치료 옵션을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

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프로토콜

윤리적 동물 사용은 동물 복지법에 따라 행동하는 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 동물은 AAALAC(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)의 승인 시설에 수용되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 미국 국립보건원(National Institutes of Health Guide)에 따라 처리되었습니다.

1. 마취

  1. 작은 동물 마취 시스템의 상자에 쥐를 넣습니다(그림 1). 4%의 이소플루란을 상자에 전달하고 5-10분 동안 기다린 후 이소플루란을 2-3%로 낮춥니다.
  2. 발가락 꼬집음을 통해 마취 깊이를 확인합니다. 건조를 방지하기 위해 눈 윤활제를 바르십시오. 피사체를 2% 이소플루란 흐름으로 콧방울로 이동합니다.
  3. 위의 기술을 사용하여 면도 및 사지 측정 분석을 위해 각 마우스를 마취합니다. 1.25mg/kg의 복강내 펜토바르비탈 주사량을 사용하여 방사선 조사를 위해 마우스를 마취합니다.

2. 피부 부위 준비

  1. 방사선 조사하기 2-3일 전에 쥐를 면도할 계획을 세우십시오. 가위를 사용하여 머리카락을 다듬습니다(그림 2A).
  2. 제모 크림을 바르고 1-2분 동안 기다립니다(그림 2B). 마른 거즈로 크림을 닦고 인산염 완충액 식염수(PBS)에 적신 거즈로 피부를 헹굽니다(그림 2C).

3. 조사 절차

  1. 방사선 조사 5분 전에 복강 내 주사를 투여하여 각 마우스를 마취합니다. 팔다리를 방사선 필드(25cm x 25cm)에 놓고 수술 테이프로 고정합니다(그림 3A-C).
  2. 수술용 테이프를 사용하여 신체를 제한합니다(그림 3D). 방사선의 깊은 침투를 방지/최소화하기 위해 1cm 두께의 볼루스를 놓습니다(그림 3E).
  3. 어플리케이터와 컷아웃 계수를 계산하여 마우스 피부에 40Gy를 전달합니다. 이 실험에서는 선형 가속기를 사용하여 3740 모니터 장치에 대한 6MeV 전자빔을 생성하여 방사선 조사 화상을 유도합니다. 이 설정에서, 100cm 소스-표면 거리(SSD)로 1,000MU/min 선량에서 25cm x 25cm 방사선 필드, 이는 조사 소스에서 볼루스 상단까지의 거리에서 40Gy를 전달합니다. 조사 시간은 사용되는 선형 가속기, 빔 에너지 및 자기장 크기에 따라 달라집니다. 선형 가속기에서 40Gy를 전달하는 데 필요한 모니터 단위를 계산하려면 방사선 또는 의학 물리학자와 상의해야 합니다.

4. 섬유증 발병의 육안 모니터링

  1. 휴대용 디지털 카메라를 사용하여 섬유증의 진행 상황을 문서화하십시오. 매크로 설정을 사용하여 상세한 사진을 캡처할 수 있습니다.
  2. isoflurane의 흡입에 의하여 anesethetize 쥐.
  3. 렌즈를 피부에 더 가깝게 배치하여 사진을 촬영하고 캡처를 누릅니다. 사진을 가능한 한 일관성 있게 유지하십시오. 흉골 누운 자세를 유지할 수 있는 충분한 의식이 회복될 때까지 피험자를 직접 감독한다.

5. 섬유증의 기능적 결과로서의 다리 편위 측정

  1. 방사선 조사 후 3주째부터 최대 6주 동안 매주 측정을 계획하십시오.
  2. 위에서 설명한 대로 마취를 시작하고 유지합니다. 노즈콘 앞에 필드를 준비하고 중앙에 테이프로 각도기를 고정합니다(그림 4A).
  3. 마우스를 필드로 옮기고 코를 원뿔에 부드럽게 놓습니다. 오른쪽 무릎을 각도기의 중앙에 놓습니다(그림 4B).
  4. 왼손을 사용하여 무릎을 고정하고 오른손을 사용하여 검지와 꽃가루 손가락으로 발을 배측 굴곡시킵니다(그림 4C, D).
  5. 발가락으로 표시된 값을 읽어 확장 정도를 기록하십시오. 방사선 조사되지 않은 반대쪽 다리에 동일한 절차를 수행합니다.

6. 보행 기능 지표 측정

  1. 설치류 산책로를 3D 프린팅하여 투명 바닥이 있는 15cm 높이에 매달린 40cm 산책로를 만듭니다(그림 5). 트랙 아래에 비디오 레코더를 놓고 촬영을 시작합니다. 카메라는 가능한 가장 높은 해상도와 초당 60프레임의 최소 프레임 속도로 비디오를 녹화하도록 조정됩니다.
  2. 트랙의 한쪽 끝을 열고 마우스를 내부로 옮깁니다. 동물이 트랙을 자유롭게 걸을 수 있도록 합니다. 동물이 최대한 부드럽게 걷는 모습을 최소 3회 이상 포착합니다.
  3. 다음 마우스를 녹화하기 전에 비디오 품질을 확인하십시오.
  4. 비디오 플레이어, 스크린샷 응용 프로그램, 이미지 처리 프로그램 및 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 비디오를 컴퓨터로 전송합니다. 녹화물을 보고 스크린샷 기능을 사용하여 세 가지 다른 선명한 발자국을 캡처합니다(그림 6).
  5. 발가락 벌림 측정을 위해 이미지 처리 프로그램을 엽니다. 상단 패널에서 파일을 선택하고 열기 를 클릭하여 분석할 이미지를 찾아 표시합니다.
  6. 상단 패널의 두 번째 행에서 Straight Line Tool 을 선택합니다(그림 7_1). 이 도구를 사용하여 벽 너비를 표시하고 분석 > 스케일 설정을 클릭한 다음 알려진 거리에 대한 정확한 값을 입력하여 스케일을 보정합니다(그림 7_2-5).
  7. Straight Line Tool을 사용하여 다양한 측정에 대한 발자국을 표시하고(그림 6C, D; 1: 발 길이, 2: 바깥쪽 발가락 벌림, 3: 안쪽 발가락 벌림) Analyze > Measure를 선택한 다음 길이 값을 기록합니다(그림 8).
  8. 조사된 팔다리와 조사되지 않은 팔다리 모두에 대한 분석을 수행합니다. 이전에 발표된 다음 방정식을 사용하여 기능24를 평가합니다.
    수학적 분석에서 ETS, NTS, EPL 및 NPL 비율을 보여주는 정적 공식, SFI 방정식.
    여기서 SFI = 좌골 기능 지수, E = 실험 또는 부상 발, N = 정상 또는 부상하지 않은 발, TS = 발가락 벌림, PL = 인쇄 길이.

7. 안락사

  1. 피험자를 CO2 라인 연결 상자로 옮깁니다. 챔버 내에서 30%-70% 농도에 도달하기 위해 CO2 주입을 시작합니다. 5L 챔버의 경우 가스 주입은 1.5-3.5L/min 사이여야 합니다.
  2. 동물이 호흡을 멈출 때까지 5-10분 동안 기다립니다. 두개골 기저부에서 머리를 제자리에 잡고 꼬리를 단단히 잡아당겨 경추 탈구로 안락사25.

8. 조직학 및 다운스트림 분석 17

  1. 방사선 조사된 뒷다리를 당겨 절제 준비를 합니다. 극단 피부의 후방면까지 2cm x 1cm 영역을 선택합니다.
  2. 날카로운 가위를 사용하여 피부 샘플을 조심스럽게 채취하십시오. 두 개의 분리된 조각을 얻기 위해 긴 축에서 조직을 반으로 자릅니다.
  3. 조직 조각 하나를 10% 포르말린 완충 식염수로 고정합니다. 슬라이드에서 조직학적 절편을 준비하기 위해 고정 조직을 처리합니다.
  4. 단백질과 RNA를 보존하기 위해 두 번째 조각을 드라이아이스로 채워진 상자에 옮깁니다. 그런 다음 조직 샘플을 -80°C 냉동고로 빠르게 옮기고 추가 처리까지 냉동 상태로 유지합니다.
  5. 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색 및 Masson의 트리크롬 염색에 대한 슬라이드를 염색합니다. 현미경으로 염색된 슬라이드를 시각화하고 10배 배율을 사용하여 이미지를 촬영합니다. 보행 기능 분석을 위해 위에서 설명한 대로 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 상피 두께를 측정합니다.

9. 통계

  1. 데이터를 평균 ± 표준 편차로 제시합니다. 분산 분석(ANOVA)을 사용한 후 Bonferroni의 다중 비교 검정 또는 학생 t-검정을 사용하여 결과를 평가합니다.

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결과

현재 방사선 조사 프로토콜의 확립 및 최적화는 마우스에서 일관되고 재현 가능한 섬유증 유도를 초래했습니다. 방사선 조사 당일에 마우스의 오른쪽 팔다리를 방사선 필드 내에 배치하고 고정하고 40Gy의 방사선을 투여했습니다.

피부의 기능적 손상의 발달은 방사선 조사 후 매주 이미지를 캡처하여 모니터링되었습니다. 사진은 최적화된 프로토콜이 40일째까지 95%의 신뢰도로 섬유증을 일으켰음을 보여주었습니다. 방사선 조사된 피부의 눈에 보이는 수축에 의해 밝혀진 섬유증 진행의 예가 그림 9에 나와 있습니다.

기능 장애는 방사선 유발 섬유증의 가장 두드러진 특징 중 하나입니다. 섬유증이 진행됨에 따라 세포외 기질의 과도한 리모델링은 피부가 수축되고 두꺼워지는 결과를 초래합니다. 또한 방사선 유도 반응은 인접 근육의 기능에 영향을 미칩니다. 저자는 사지 기능을 정량화하기 위해 무릎 확장 및 ...

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토론

피부 부상은 우발적 또는 의학적 치료와 관련된 방사선 노출로 인해 발생할 수 있습니다. 원자로는 인간의 실수나 체르노빌 및 후쿠시마와 같은 자연 재해로 인해 우발적인 파손 위험이 있습니다26,27. 암 치료를 위한 치료적 투여는 가장 일반적인 노출이며, 치료 부위에 방사선 관련 섬유증을 유발할 위험이 있는 분획 반복 투여 요법을 사용합니다. 이 흔한 만성 부작용은 사례의 최대 23%에서 만연할 수 있습니다16,28. 섬유증에 대한 치료적 개입은 질병의 여러 단계에서 관련된 순차적인 병리학적 메커니즘을 대상으로 해야 합니다. 비용 효율적이고 재현 가능하며 번역 가능한 소동물 모델은 추가 조사에 이상적입니다. 이 프로토콜에서는 피부 섬유증의 병리학적 특징을 보여주는...

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공개 사항

저자는 이 작업과 관련하여 경쟁하는 재정적 이해관계나 기타 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 국방부 W81XWH-19-PRMRP-DA, NIAID/NIH 보조금 5R21AI153971-02 및 PSF/MTF 보조금 603902의 연구 보조금으로 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10% 포르말린Fischer Scientific23-427098
BolusOrfit8333.SO1/R
클리퍼켄트 사이언티픽 코퍼레이션CL8787-KIT
CO2다양한
CO2 챔버E-Z 시스템 Inc.E-22000
제모 크림교회 & 드와이트 주식회사Nair
디지털 카메라WolfangGA100
Eppendrof 튜브Eppendorf22364111
눈 윤활제DechraPuralube  안과 연고
거즈Covidien682252
이미지 처리 프로그램NIH이미지 J
IsofluraneDechraUSP 흡입 마취
선형 가속기Varian Medical Systems, Inc.23EX
PBSCytivaSH30256.LS
PentobarbitalAkorn PharmaceuticalsNembutal
각도기Westcott550-1120
소동물 마취 시스템E-Z Systems Inc.EZ-SA800단일 동물 시스템
스프레드시트 소프트웨어MicrosoftExcel
수술용 가위MedlineMDS0834111
수술 테이프3M1538-1
테이프3MH-1113

참고문헌

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