Method Article

약물 전달 시스템과 체 외 세포 간의 상호 작용에 대한 실험적 정량화: 전임상 나노의학 평가를 위한 가이드

DOI:

10.3791/64259

⸱

September 28th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, The University of Melbourne at the Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, 2Department of Infectious Diseases, The University of Melbourne at the Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, 3Victorian Infectious Diseases Service, Royal Melbourne Hospital at the Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, 4Department of Infectious Diseases, Alfred Hospital and Monash University, 5Department of Chemical Engineering, The University of Melbourne, 6Department of Biomedical Engineering, The University of Melbourne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

유세포분석을 사용하여 약물 운반체-세포 상호 작용의 절대 정량화를 위한 워크플로우를 입증하여 새로운 약물 전달 시스템을 보다 합리적으로 평가할 수 있습니다. 이 워크 플로우는 모든 유형의 약물 운반자에게 적용 할 수 있습니다.

Abstract

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약물 전달 시스템 설계의 주요 구성 요소는 특정 세포 유형과의 상호 작용을 증폭하거나 약화시키는 방법에 관한 것입니다. 예를 들어, 화학 요법은 암세포에 대한 결합을 향상시키는 항체로 기능화 ( "표적화") 또는 면역 세포 인식을 회피하는 데 도움이되는 폴리에틸렌 글리콜로 기능화 될 수 있습니다 ( "스텔스"). 세포 수준에서도 약물 운반체의 결합 및 흡수를 최적화하는 것은 복잡한 생물학적 설계 문제입니다. 따라서 새로운 담체가 세포와 얼마나 강하게 상호 작용하는지와 일단 해당 세포로 전달되면 담체의화물의 기능적 효능을 분리하는 것이 중요합니다.

화학 요법의 예를 계속하기 위해 "암세포에 얼마나 잘 결합하는지"는 "암세포를 얼마나 잘 죽이는지"와는 별개의 문제입니다. 후자에 대한 정량적 체외 분석은 잘 확립되어 있으며 일반적으로 생존력 측정에 의존합니다. 그러나 세포-운반체 상호 작용에 대한 대부분의 발표 된 연구는 정 성적 또는 반 정량적입니다. 일반적으로 이러한 측정은 캐리어의 형광 표지에 의존하며 결과적으로 상대적 또는 임의의 단위로 세포와의 상호 작용을 보고합니다. 그러나이 작업은 표준화 될 수 있으며 소수의 특성화 실험으로 절대적으로 정량적으로 만들 수 있습니다. 이러한 절대 정량화는 나노입자, 마이크로입자, 바이러스, 항체-약물 접합체, 조작된 치료 세포 또는 세포외 소포와 같은 다양한 약물 전달 시스템의 합리적, 클래스 간 및 클래스 내 비교를 용이하게 하기 때문에 가치가 있습니다.

또한 정량화는 후속 메타 분석 또는 인실리코 모델링 접근 방식의 전제 조건입니다. 이 기사에서는 캐리어 크기 및 라벨링 양식의 차이를 고려한 캐리어 약물 전달 시스템에 대한 체외 정량화를 달성하는 방법에 대한 의사 결정 트리와 비디오 가이드를 제공합니다. 또한 고급 약물 전달 시스템의 정량적 평가에 대한 추가 고려 사항이 논의됩니다. 이것은 차세대 의학을위한 합리적인 평가와 설계를 향상시키는 귀중한 자원으로 사용하기위한 것입니다.

Introduction

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만나는 세포 유형에 따라 특이적이고 설계된 행동을 나타내는 약물 전달 구조체의 설계는 상당한 연구 관심을 끌었습니다. 잠재적인 약물 전달 구축물 또는 "담체"는 지질 제형, 나노성장 무기물, 중합체 어셈블리, 세포외 소포, 기능화된 박테리아 세포, 또는 변형된 바이러스를 포함한다. 이들 모두는 물리적 특성, 표면 특성 또는 항체 부착 1,2와 같은 공학적 화학적 기능화로 인해 장기, 조직 또는 세포 특이성을 나타낼 수 있습니다.

시험관내 담체 평가에서 거의 유비쿼터스 단계는 상기 약물 로딩 담체를 함유하는 현탁액으로 세포를 배양하는 것이다. 인큐베이션 후, 담체 성능은 약물 화물의 성능, 예를 들어 형질주입 효율 또는 독성의 기능적 판독을 통해 측정된다. 기능 판독값은 캐리어 효율성의 다운스트림 척도이므로 유용합니다. 그러나 더 복잡한 약물 전달 구조체의 경우 기능적 판독을 넘어 관심 세포와의 캐리어 상호 작용 정도를 개별적으로 정량화하는 것이 점점 더 중요해지고 있습니다. 여기에는 몇 가지 이유가 있습니다.

첫째, 다양한화물을 운반 할 수있는 "플랫폼"운송....

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Protocol

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1. 적절한 스트림 선택

  1. 그림 1 에 설명된 의사 결정 트리에 따라 사용된 실험 설정에 가장 적합한 워크플로(스트림)(그림 2)를 결정합니다. 이 스트림 선택에 대한 추가 의견은 토론을 참조하십시오.
  2. 세포분석기 스트림을 따르는 경우 2.1.1-2.2.7단계를 계속합니다. 대량 스트림을 따르는 경우 3.1.1.1-3.1.5.7단계를 계속 진행합니다.

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그림 1: 작업 스트림 의사 결정 트리. 사용할 스트림에 대한 결정은 주로 관심 있는 이동통신사 유형에 따라 다릅니다. 더 큰 운반체와 높은 산란 특성을 가진 담체는 세포분석기에서 개별적으로 더 쉽게 검출할 수 있으므로 세포분석기 스트림을 사용한 정....

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Results

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이전에 논의된 바와 같이, 상이한 약물 담체 유형은 세포-담체 결합의 절대 정량화를 위해 상이한 기술의 사용을 필요로 한다. 예를 들어, 633nm 디설파이드 안정화 폴리(메타크릴산)(PMASH) 코어쉘 입자는 민감한 유세포분석기를 사용하여 검출하기에 충분히 크고 밀도가 높습니다. 따라서 이러한 입자는 형광으로 표지 된 다음 측면 각도 광산란 (SALS, SSC와 유사)과 적절한 형광 채널을 사용하여 게이팅되고 계수되었습니다 (그림 3). 두 채널의 이벤트 수 차이는 1.98%로 허용 범위 내에 있었습니다.

대조적으로, 100nm 초상자성 산화철 나노입자는 너무 작아서 개별적으로 검출할 수 없으므로 Bulk Stream을 사용하여 분석했습니다. 이러한 나노 입자는 나노 입자 추적 분석을 사용하여 계수되고 특성화되었습니다 (그림 4). 136 nm의 평균 .......

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Discussion

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약물 운반체와 세포 간의 상호 작용을 특성화하는 것은 새로운 약물 전달 시스템의 개발에서 점점 더 중요해지고 있습니다. 구체적으로, 다양한 캐리어 구축물의 합리적인 평가 및 비교를 허용하기 위해, 표적 및 비표적 세포와 상호작용하는 상기 캐리어의 성능의 절대적인 정량화가 중요하다. 이 프로토콜은 약물 운반체와 함께 작업하는 모든 연구자가 세포-운반체 결합에 대한 상대적 반정량적 유세포분석 데이터를 절대 정량적 결과로 변환할 수 있도록 하는 2-스트림 방법론을 설명합니다. 윤곽이 잡힌 공정은 모든 유형의 담체(소형, 대형, 유기물, 무기물)에 적용할 수 있으며 형광 라벨이 부착된 경우 적용할 수 있습니다. 그러나 다른 캐리어는 셀당 캐리어를 계산하기 위해 다른 접근 방식을 필요로합니다. 이는 필요한 특성화 측정에 사용되는 다양한 기기의 한계 때문입니다.

따라서 이 프로토콜은 세포분석기 스트림과 벌크 스트림의 두 스트림으로 나뉩니다. 첫 번째인 Cytometer Stream은 보다 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 호주 국립 보건 및 의학 연구위원회 (NHMRC; 프로그램 보조금 번호 GNT1149990), 호주 HIV 및 간염 바이러스 연구 센터 (ACH2) 및 Réjane Louise Langlois의 재산에서 선물. FC는 NHMRC(National Health and Medical Research Council) 수석 수석 연구 펠로우십(GNT1135806)의 상을 수상했습니다. 그림 1 과 그림 2 는 BioRender.com 사용하여 만들었습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 647 C2 MaleimideInvitrogenA20347150 nm, 235 nm 또는 633 nm PMA<>subSH 캐리어를 라벨링하는 데 사용되는 pH 안정성 염료; 세포-캐리어 연관 연구에 사용할 수 있는 좋은 염료의 예
Apogee A50 MicroflowApogee유세포분석기 계수를 위한 소형 캐리어를 검출할 수 있는
CytoFLEX S 유세포분석기Beckman Coulter카운팅을 위해 작은 캐리어를 검출하고 최종 세포 장벽 실험을 위해 판독할 수 있는 민감한 유세포 분석기
FCS ExpressDe Novo 소프트웨어소프트웨어는 유세포 분석 데이터를 분석하는 데 사용됩니다(예: 게이팅을 수행하고 선택한 집단의 중앙값 형광 강도 값을 도출합니다). 대안으로는 FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PROTecan Lifesciences용액에서 캐리어의 벌크 형광 측정에 사용되는 표준 마이크로플레이트 리더 기기
LSRFortessa 세포 분석기BD Biosciences,덜 민감한 유세포 분석기, 그러나 연구자가 일반적으로 사용할 수 있는 분석기가 있습니다. 최종 세포 캐리어 실험을 판독하는 데 사용할 수 있습니다
NanoSight NS300Malvern PanalyticalInstrument, 나노 입자 추적 분석에 사용되는
기기, Prism 8GraphPad소프트웨어. 대안으로는 Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python 등이 있습니다
: Quantum MESF 키트, Alexa Fluor 647Bangs Laboratories647유세포 분석기용 절대 정량 분석 비드. 마이크로플레이트 리더에서 대량으로 측정한 형광 강도를 MESF 표준을 사용하여 유세포 분석기에서 측정한 형광 강도로 변환하는 데 사용됩니다.
Sensitive , : , , 표준 곡선을 그래프로 표시하고 계산하는 데 사용되는 , ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Conde, J., et al. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Frontiers in Chemistry. 2, 48(2014).
  2. Cheng, Q., et al.

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