방법 논문

P3HR1 세포주에서 엡스타인-바 바이러스의 분리 및 정량화

DOI:

10.3791/64279

⸱

2022년 9월 28일

 ,  , 
1Department of Experimental Pathology, Immunology and Microbiology, Faculty of Medicine, American University of Beirut, 2Center for Infectious Diseases Research (CIDR), Faculty of Medicine, American University of Beirut

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 phorbol 12-myristate 13-아세테이트로 바이러스 용해 주기를 유도할 때 인간 P3HR1 세포주에서 Epstein-Barr 바이러스 입자의 분리를 허용합니다. 이어서 바이러스 제제에서 DNA를 추출하고 실시간 PCR을 수행하여 바이러스 입자 농도를 정량화합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

공식적으로 인간 헤르페스 바이러스 4 (HHV-4)로 지정된 엡스타인-바 바이러스 (EBV)는 최초의 분리 된 인간 종양 바이러스입니다. 전 세계 성인 인구의 거의 90-95%가 EBV에 감염되어 있습니다. 최근 분자생물학 및 면역학의 발전으로 시험관 내 및 생체 내 실험 모델의 적용은 EBV 관련 종양 발생뿐만 아니라 많은 질병에서 EBV의 발병 기전에 대한 깊고 의미 있는 통찰력을 제공했습니다. 이 시각화된 실험 논문의 목적은 P3HR1 세포주의 세포에서 EBV 바이러스 입자를 분리한 후 바이러스 제제를 정량화하는 개요를 제공하는 것입니다. 원래 인간 버킷 림프종에서 분리된 P3HR1 세포는 제2형 EBV 균주인 P3HR1 바이러스를 생성할 수 있습니다. EBV 용균 주기는 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)로 처리하여 이러한 P3HR1 세포에서 유도되어 EBV 바이러스 입자를 생성할 수 있습니다.

EBV 입자의 분리를 위해 이 프로토콜을 사용하여 P3HR1 세포를 35ng/mL PMA를 포함하는 완전한 RPMI-1640 배지에서 37°C 및 5%CO2 에서 5일 동안 배양합니다. 이어서, 배양 배지를 120 x g 의 속도로 8분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화한다. 그런 다음 바이러스 함유 상청액을 수집하고 16,000 x g 의 속도로 90분 동안 회전시켜 EBV 입자를 펠릿화합니다. 그런 다음 바이러스 펠릿을 완전한 RPMI-1640 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 DNA 추출 및 정량적 실시간 PCR을 수행하여 제제에서 EBV 입자의 농도를 평가합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

엡스타인-바 바이러스(EBV)는 분리된 최초의 인간 종양 바이러스입니다1. 공식적으로 인간 헤르페스 바이러스 4 (HHV-4)2라고하는 EBV는 헤르페스 바이러스 계열의 감마 헤르페스 바이러스 아과의 일부이며 림프 암호 바이러스 속의 원형입니다. 전 세계 성인 인구의 거의 90-95%가 바이러스에 감염됩니다3. 대부분의 경우 초기 감염은 생후 3 년 이내에 발생하며 무증상이지만 청소년기에 늦게 감염이 발생하면 전염성 단핵구증4이라고하는 질병이 발생할 수 있습니다. EBV는 휴지기 B 세포를 감염시켜 바이러스가 잠복 감염 상태를 확립하고 유지하는 증식성 B 림프구가 되도록 유도할 수 있습니다5. EBV는 언제든지 재활성화될 수 있으므로 재발성 감염으로 이어질 수 있습니다6.

지난 50년 동안, 일부 바이러스와 인간 악성 종양의 발달 사이의 연관성이 점점 더 명백해졌고, 오늘날 모든 인간 암의 15% 내지 20%가 바이러스 감염과 관련이 있는 것으로 추정된다

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

알림: EBV는 잠재적으로 생물학적 위험 물질로 간주되어야 하므로 생물안전 레벨 2 이상의 격리에서 취급해야 합니다. 실험실 코트와 장갑을 착용해야합니다. 튀김에 노출 될 가능성이있는 경우 눈 보호도 고려해야합니다. 다음 절차는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행해야합니다.

1. P3HR1 세포 계수

  1. 세포 원심분리 및 재현탁
    1. 진행 중인 P3HR1 세포 배양의 100mm 배양 플레이트(또는 T-25 플라스크)에서 80% 컨플루언시로 세포 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. P3HR-1 세포의 파종 밀도는 1 x 106 세포/mL입니다. 완전한 RPMI 배양 배지(79% RPMI 배양 배지, 20% 소 태아 혈청, 1% Pen-Strep 항생제)를 37°C 및 5%CO2에서 유지하고, 3-4일마다 계대배양한다.
    2. 120 x g에서 8분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 1mL의 완전한 RPMI 배양 배지에 재현탁시키고, 잘 혼합한다(이 용액을 현탁액 A라고 함).
  2. 계수를 위한 세포 현탁액 준비
    1. 2 μL의 세포 현탁액 A를 8 μL....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 절차의 목표는 알려진 바이러스 역가를 가진 현탁액에서 EBV 입자를 분리하여 나중에 EBV 감염을 모델링하는 데 사용할 수 있도록 하는 것입니다. 따라서 절차에서 가장 높은 EBV 수율을 얻기 위해 다양한 시약의 최적 농도를 사용하는 것이 가장 중요합니다.

가장 많은 수의 EBV 입자를 생성하는 PMA 및 DMSO의 농도를 결정하기 위해 최적화 시험이 수행되었습니다(그림 2). 0.8%의 DMSO 농도와 35ng/μL의 PMA 농도가 최적이었고 높은 EBV 농도를 초래했습니다. 최적화 프로토콜에서 얻은 바이러스 입자의 농도는 917,471 바이러스 입자 / μL였습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EBV 입자의 생산은이 바이러스의 생물학 및 관련 질병을 이해하는 데 필요합니다. 여기에서는 P3HR-1 세포주에서 이러한 입자의 생산에 대해 설명했습니다. 이 세포주는 유일한 EBV 생산자 계통이 아닙니다. 실제로 EBV 입자는 B95-8 세포21,22 및 Raji 세포 주18,19에서도 분리되었습니다. EBV 용균 주기는 n-부티레이트로 이들 세포에서 유도되었다. 대안적으로, 포볼 12-미리스테이트-13-아세테이트 (PMA)로도 알려진 12-O-테트라데카노일포볼-13-아세테이트 (TPA)와 같은 포르볼 에스테르가 사용될 수 있다. 전반적으로 여기에 자세히 설명된 프로토콜은 P3HR-1 라인 대신 이러한 셀을 사용하여 사용할 수 있습니다. 그러나 B95-8 라인은 현재 멸종 위기에 처한 영장류 종

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업에 대한 자금은 Asmar Research Fund, 레바논 국립 과학 연구위원회 (L-CNRS) 및 베이루트 아메리칸 대학교의 의료 실무 계획 (MPP)의 응급실 보조금으로 지원되었습니다.

....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.2 mL 얇은 벽 PCR 튜브Thermo ScientificAB0620를 사용하기 전에 고압멸균해야 합니다
. L Microvolume 필터 팁Corning4807를 고압멸균해야 합니다
. L 피펫BrandTech704770
10 mL 일회용 혈청학 피펫Corning4488
1000 µ L 여과된 피펫 끝QSPTF-112-1000-Q
100-1000 µ L 피펫Eppendorf3123000063
100x20 mm 큐처 플레이트Sarstedt83.1802
10-100 µ L 피펫BrandTech704774
15 mL 코니컬 튜브Corning430791
200 µ L 여과된 피펫 끝QSPTF-108-200-Q
20-200 µ L 피펫Eppendorf3123000055
50 mL 코니컬 튜브Corning430828
CFX96 Real-Time C-1000 Thermal CyclerBio-Rad184-1000
DMSOAmresco0231
DNase/RNase FreeWater Zymo ResearchW1001-1
EBER PrimersMacrogenN/A맞춤형 프라이머
EBV DNA Control (Standard)VircellMBC065
Ethanol (Laboratory Reagent Grade)Fischer ChemicalE/0600DF/17
Fetal Bovine SerumSigmaF9665
Fresco 21 MicroCentrifugeThermo Scientific10651805
Glycogen SolutionQiagen158930
혈구계BOECOBOE 01
도립광 현미경ZeissAxiovert 25
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5121
Microcentrifuge TubeCostar (Corning)3621사용 전 고압멸
P3HR-1 세포주ATCCHTB-62
페니실린-스트렙토마이신 솔루션BiowestL0022
페놀VWR20599.297
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)Sigma-AldrichP8139
피펫 필러,Thermo Scientific9501
정밀 와이프,Kimtech7552
RPMI-1640, 배양 매체SigmaR7388
SL 16R 원심분리기Thermo Scientific75004030
아세트산 나트륨Riedel-de Haë n (Honeywell)25022
분광광도계DeNovixDS-11
Tris-HClSigmaT-3253
Trypan Blue SolutionSigmaT8154
워터 재킷 CO2 인큐베이터Thermo Scientific4121
은 0.2-10 µ 사용 전에 0.5-10 µ균 : , , , , , , , ,

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Epstein, M. A., Achong, B. G., Barr, Y. M. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt's lymphoma. Lancet. 1 (7335), 702-703 (1964).
  2. Sample, J., et al. Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes. <....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

Epstein Barr VirusP3HR1 Cell LineVirus IsolationVirus QuantificationViral DNA ExtractionReal Time PCREBV Genome CopyCell CulturePMA InductionHemocytometer Counting

관련 논문