고처리량 미세유체 압축 시스템을 통한 다세포 유기체의 기계자극

Summary

본 프로토콜은 최소한의 사용자 개입으로 수백 개의 초파리 멜라노가스터 배아를 정렬, 고정 및 정밀하게 압축할 수 있는 미세유체 시스템의 설계, 제조 및 특성화를 설명합니다. 이 시스템은 자극 후 분석을 위한 샘플의 고해상도 이미징 및 회수를 가능하게 하며 다른 다세포 생물학적 시스템을 수용하도록 확장할 수 있습니다.

Abstract

배아 발생 동안 조정 된 세포 이동은 유전자 발현과 활성을 조절하는 기계적 힘을 생성합니다. 이 과정을 연구하기 위해 흡인 또는 커버 슬립 압축과 같은 도구를 사용하여 전체 배아를 기계적으로 자극했습니다. 이러한 접근 방식은 부정확하고 수동 처리가 필요하며 동시에 몇 개의 배아만 처리할 수 있으므로 실험 설계를 제한합니다. 미세 유체 시스템은 처리량과 정밀도를 높이면서 이러한 실험 작업을 자동화할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 이 기사에서는 전체 초 파리 멜라노가스터(초 파리) 배아를 정밀하게 압축하기 위해 개발된 미세 유체 시스템에 대해 설명합니다. 이 시스템은 공압으로 작동되는 변형 가능한 측벽이 있는 마이크로채널을 특징으로 하며 배아 정렬, 고정화, 압축 및 자극 후 수집을 가능하게 합니다. 이러한 마이크로 채널을 7 개의 레인으로 병렬화함으로써 꾸준하거나 역동적 인 압축 패턴을 수백 개의 초파리 배아에 동시에 적용 할 수 있습니다. 유리 커버슬립에 이 시스템을 제작하면 고해상도 현미경으로 샘플을 동시에 기계적 자극과 이미징할 수 있습니다. 또한 PDMS와 같은 생체 적합성 재료를 활용하고 시스템을 통해 유체를 흐르게 하는 기능으로 인해 이 장치는 매체 의존형 샘플로 장기간 실험할 수 있습니다. 이 접근 방식은 또한 기계적으로 시료에 스트레스를 주는 수동 장착의 필요성을 제거합니다. 또한 마이크로채널에서 샘플을 신속하게 수집할 수 있는 기능은 기존의 기계적 자극 접근 방식으로는 얻을 수 없는 많은 샘플 수를 필요로 하는 -omics 분석을 포함하여 자극 후 분석을 가능하게 합니다. 이 시스템의 기하학적 구조는 다양한 생물학적 시스템으로 쉽게 확장 가능하여, 많은 분야가 높은 샘플 처리량, 기계적 자극 또는 고정화, 및 자동 정렬을 포함하여 여기에 설명된 기능적 특징으로부터 이익을 얻을 수 있도록 합니다.

Introduction

살아있는 시스템은 일생 동안 다양한 기계적 입력을 지속적으로 경험하고 반응합니다¹. 기계 변환은 발달 장애, 근육 및 뼈 손실,^{기계적 환경에 의해} 직간접적으로 영향을 받는 신호 경로를 통한 신경병리를 포함한 많은 질병과 관련이 있습니다2. 그러나 기계감응성 신호전달 경로⁴에서 기계적 자극³에 의해 조절되는 유전자와 단백질은^{크게 알려지지 않은} 상태로 남아 있으며5, 기계적 조절 메커니즘의 해명 및 병리학적 기계변환과 관련된 질병에 대한 분자 표적의 식별을 방해합니다^.6,7 . 기계 생물학 연구를 관련 생리적 과정에 투영하는 데있어 한 가지 제한 요소는 손상되지 않은 다세포 유기체 대신 기존 배양 접시가있는 개별 세포를 사용하는 것입니다. 초파리 멜라노가스터(초파리)와 같은 모델 유기체는 동물 발달에 관여하는 유전자, 신호 경로 및 단백질을 이해하는 데 크게 기여했습니다 8,9,10. 그럼에도 불구하고 기계 생물학 연구에서 초파리 및 기타 다세포 모델 유기체를 사용하는 것은 실험 도구의 문제로 인해 방해를 받았습니다. 다양한 자극을 준비, 분류, 이미징 또는 적용하기위한 기존의 기술은 대부분 수동 조작이 필요합니다. 이러한 접근 방식은 시간이 많이 걸리고 전문 지식이 필요하며 변동성을 도입하고 실험 설계 및 표본 크기를 제한합니다¹¹. 최근의 마이크로 기술 발전은 매우 높은 처리량과 고도로 제어 된 실험 매개 변수^12,13,14로 새로운 생물학적 분석을 가능하게하는 훌륭한 리소스입니다.

이 기사는 수백 개의 전체 초파리 배아에 단축 압축 형태로 기계적 자극을 정렬, 고정 및 정확하게 적용하기 위한 향상된 미세유체 장치의 개발에 대해 설명합니다¹⁵(그림 1). 미세 유체 시스템과 유리 커버 슬립의 통합은 자극 동안 샘플의 고해상도 컨포칼 이미징을 가능하게했습니다. 미세유체 장치는 또한 -omics 분석을 실행하기 위한 자극 후 배아의 빠른 수집을 가능하게 했습니다(그림 2). 이 장치의 설계 고려 사항에 대한 설명과 소프트 리소그래피 및 실험 특성화를 사용한 제조가 여기에 설명되어 있습니다. 이러한 장치의 실리콘 웨이퍼 몰드를 만들려면 높은 종횡비 (AR) 트렌치 (AR >5)가있는 넓은 영역에 두꺼운 포토 레지스트 (두께 >200μm)를 균일하게 코팅해야하기 때문에이 방법은 기존의 포토 리소그래피 금형 제작 프로토콜을 상당히 수정했습니다. 이러한 방식으로, 이 방법은 포토레지스트의 취급, 접착, 코팅, 패터닝 및 개발을 용이하게 하였다. 또한 잠재적 인 함정과 그 해결책에 대해 논의합니다. 마지막으로, 이 설계 및 제조 전략의 다양성은 초파리 난실 및 뇌 오가노이드¹⁶과 같은 다른 다세포 시스템을 사용하여 입증되었습니다.

Protocol

1. 실리콘 웨이퍼 몰드의 제조

1. 실리콘 웨이퍼( 재료 표 참조)를 먼저 아세톤으로 청소한 다음 이소프로필 알코올(IPA)로 청소합니다.
2. 탈수 베이크를 위해 실리콘 웨이퍼를 250°C 핫 플레이트에 30분 동안 놓습니다(그림 3A).
3. 증기 프라임 오븐에서 실리콘 웨이퍼를 헥사메틸디실라잔(HDMS)으로 코팅합니다(재료 표 참조)(공정 온도: 150°C, 공정 압력: 2Torr, 공정 시간: 5분, HDMS 부피: 5μL)(그림 3B).
4. SU-8 2100 포토레지스트 한 병( 재료 표 참조)을 60°C 오븐에 15분 동안 넣어 점도를 줄입니다.
   알림: 오븐에서 가열하면 포토레지스트의 점도가 감소합니다. 점도가 낮은 포토레지스트는 더 쉽게 취급할 수 있으며 웨이퍼 위에 더 정확하게 주입할 수 있습니다.
5. 실리콘 웨이퍼를 60°C 핫 플레이트에 놓고 포토레지스트가 표면의 대부분을 덮을 때까지 웨이퍼의 각 인치에 대해 가열된 포토레지스트 1mL를 붓습니다(그림 3C).
6. 포토레지스트 코팅된 실리콘 웨이퍼를 스핀 코터로 옮깁니다( 재료 표 참조).
7. 먼저 250rpm에서 30초 동안 사전 스핀을 적용한 다음 350rpm에서 100rpm/s 가속도로 30초 동안 적용합니다(그림 3D).
8. 클린 룸 면봉을 사용하여 실리콘 웨이퍼의 가장자리에서 과도한 포토 레지스트를 제거합니다.
9. 먼저 500rpm에서 100rpm/s 가속도로 15초 동안 스핀을 적용한 다음 1450rpm에서 300rpm/s 가속도로 300초 동안 스핀을 적용합니다(그림 3E).
10. 클린룸 면봉으로 가장자리 비드를 제거합니다.
11. 실리콘 웨이퍼를 50°C 핫 플레이트에 놓고 웨이퍼에 아세톤을 분사하여 결함을 제거하고 균일한 코팅을 촉진합니다(그림 3F).
12. 핫 플레이트의 온도를 95°C/min의 속도로 2°C까지 천천히 올립니다.
13. 실리콘 웨이퍼를 95°C에서 50분 동안 소프트 베이크합니다(그림 3G).
14. 핫 플레이트를 2°C/min의 속도로 실온으로 천천히 냉각합니다.
15. 실리콘 웨이퍼를 마스크 얼라이너( 재료 표 참조)에 놓고 그 위에 포토마스크를 놓습니다(포토마스크 형상은 보충 그림 1 참조).
16. 접촉식 마스크 얼라이너를 사용하여 포토마스크를 통해 실리콘 웨이퍼를 350mJ/cm2 UV 광(10초 동안 35mW/^cm2)에 노출시킵니다(그림 3H).
17. 웨이퍼를 50°C에서 5분 동안, 65°C에서 추가 5분 동안, 마지막으로 80°C에서 20분 동안 핫 플레이트에 놓아 실리콘 웨이퍼에 연속 노출 후 베이크를 적용합니다(그림 3I).
18. 실리콘 웨이퍼를 2°C/min의 속도로 실온으로 천천히 냉각합니다.
19. 실리콘 웨이퍼보다 약간 작은 직경의 자기 교반기를 비커에 놓습니다. 실리콘 웨이퍼를 거꾸로 뒤집어 비커 위에 놓습니다.
20. 비커를 다른 큰 비커 안에 넣고 더 큰 비커에 새로운 현상액 용액을 채웁니다( 재료 표 참조). 교반기를 켠 상태에서 실리콘 웨이퍼를 현상액에 30분 동안 담근 상태로 둡니다(그림 3J).
21. 실리콘 웨이퍼를 40kHz에서 1시간 동안 새로운 현상액으로 채워진 초음파 수조 초음파 처리기로 옮깁니다(그림 3K).
22. IPA 용액으로 실리콘 웨이퍼를 철저히 세척하여 최종 실리콘 웨이퍼 몰드를 얻습니다(그림 3L).

2. 미세유동 칩의 제조

1. 실리콘 웨이퍼 몰드를 근처의 작은 계량 보트에 트리클로로(1H,1H,2H,2H,2H-퍼플루오로옥틸) 실란(PFOCTS, 재료 표 참조) 10방울(~500μL)과 함께 데시케이터에 넣습니다.
2. 데시케이터를 약 200Torr의 진공 펌프에 30분 동안 연결합니다.
3. PFOCTS 코팅을 위해 데시케이터 밸브를 끄고 진공 펌프를 밤새 분리합니다.
4. PDMS 베이스와 경화제(재료 표 참조)를 10:1 비율로 혼합하여 사전 경화된 폴리디메틸실록산( PDMS) 용액을 준비합니다.
5. 혼합물을 원심분리기(실온에서 5분 동안 500 x g )에 넣어 탈기한다.
   알림: 이 원심분리를 통해 기포가 상단 표면으로 이동하여 결과적으로 단기간에 제거됩니다.
6. 탈기된 PDMS 용액을 실리콘 웨이퍼 몰드에 붓습니다.
7. 다시 탈기하여 금형 표면에 갇힌 기포를 제거한다.
8. PDMS를 60°C 오븐에서 1시간 50분 동안 경화합니다(그림 3M).
9. 메스를 사용하여 미세유체 칩 기하구조에 상응하는 경화된 PDMS 영역의 경계를 절단한다(도 3N).
10. PDMS 부품을 떼어내고 절단 매트에 거꾸로 놓습니다.
11. 면도기를 사용하여 PDMS 부품을 최종 모양으로 자릅니다(그림 3O).
12. 생검 펀치( 재료 표 참조) 또는 끝이 뭉툭한 바늘(그림 3P)을 사용하여 PDMS의 입구 및 출구 구멍을 펀칭합니다.
    1. 배아 입구 구멍의 경우 직경 4mm의 펀치를 사용하십시오.
    2. 배아 출구 구멍의 경우 직경 1.3mm의 펀치를 사용하십시오.
    3. 가스 입구 구멍에는 2mm 펀치를 사용하십시오.
13. 스카치 테이프를 사용하여 PDMS의 패턴 표면에 남아 있을 수 있는 미립자를 제거합니다.
14. 24mm x 60mm 직사각형 유리 슬라이드를 먼저 아세톤으로 청소한 다음 IPA로 청소합니다.
15. 여과 된 공기 공급원에 연결된 에어건으로 유리 표면을 건조시킵니다.
16. 유리 슬라이드를 250°C 핫 플레이트에 2시간 동안 올려 탈수 베이크를 적용합니다(그림 3Q).
17. 표면 오염을 방지하기 위해 유리 슬라이드를 비커로 덮으십시오.
18. PDMS의 패턴이 있는 면이 위로 향하도록 놓고 탈수된 유리를 플라즈마 클리너에 밀어 넣습니다( 재료 표 참조).
19. PDMS와 유리 슬라이드를 18W의 산소 플라즈마로 30초 동안 처리합니다.
20. PDMS를 패턴 표면이 유리 슬라이드를 향하도록 유리 슬라이드에 놓고 공유 결합을 통해 마이크로 채널을 밀봉합니다(그림 3R).
21. 핀셋을 사용하여 PDMS 부품을 유리 슬라이드에 부드럽게 밀어 완전히 접촉되도록 합니다.
22. 완성된 마이크로유체 칩을 실온에서 밤새 보관하여 접합이 최종 강도에 도달할 수 있도록 합니다.

3. 초파리 배아의 제조

1. Oregon-R 성인 파리가 사과 주스 한천 접시 (1.5 % 한천, 25 % 사과 주스, 2.5 % 자당)에 알을 낳고 주어진 실험을 위해 알을 낳은 후 원하는 발달 시간에 접시를 수집하도록합니다.
   참고: 본 실험을 위해, 플레이트를 140분에 수집하여 세포화 단계¹⁷에서 배아를 준비하고 분류하였다.
2. 한천에 배아 난자 세척제(0.12M NaCl, 0.04% 트리톤-X 100)를 붓고 붓으로 배아를 부드럽게 저어 한천에서 제거합니다.
3. 배아를 50 % 표백제로 90 초 동안 옮기고 가끔 저어줍니다. 조직 체를 통해 배아를 변형시키고 표백제를 물로 완전히 씻어냅니다.
4. 배아를 완전히 덮을 수 있을 만큼 충분한 배아 난자 세척이 있는 90mm 유리 페트리 접시에 배아를 옮깁니다.
5. 해부 현미경에서 트랜스 조명으로 배아를 검사하고 미세 유체 장치에 로딩하기 위해 원하는 발달 단계의 배아를 선택하십시오.
   참고: 이 응용 프로그램에서는 세포화 단계의 배아가 선택되었습니다. 적절한 발달 단계 선택을 보장하는 방법에 대한 자세한 설명은 Drosophila¹⁷의 실험실 핸드북에서 찾을 수 있습니다.

4. 미세유체 칩을 이용한 초파리 배아에 기계적 자극 가하기

1. 7개의 배아 마이크로채널을 모두 프라이밍하여 주 배아 입구 포트를 통해 0.4μm 여과된 IPA로 채웁니다.
2. IPA를 0.4μm 여과된 탈이온수(DI)로 교체합니다.
3. DI 물을 배아 난자 세척액으로 교체하십시오.
4. 유리 피펫을 사용하여 유리 페트리 접시에서 미리 선택된 약 100 개의 배아를 수집합니다.
5. 배아를 배아 입구 포트에 피펫팅합니다(그림 4A).
6. 배아 마이크로채널을 개방하기 위해 휴대용 진공 펌프를 사용하여 가스 유입구에 약 3 PSI 음압(즉, 진공)을 가한다.
7. 배아가 자동으로 정렬되고 배아 마이크로채널에 정착되도록 미세유체 칩을 아래쪽으로 기울입니다(그림 4B).
8. 배아 마이크로 채널 입구가 동시에 들어가는 여러 배아에 의해 막히면 미세 유체 칩을 위쪽으로 기울인 다음 다시 아래쪽으로 기울여 막힘을 제거합니다.
9. 필요한 처리량에 따라 최대 300개의 배아를 배아 마이크로채널에 도입합니다.
10. 배아 로딩이 완료되면 진공을 제거하여 배아를 고정시킵니다.
11. 마이크로유체 칩을 다시 수평 위치로 기울입니다(도 4C).
12. 압력 게이지가 있는 휴대용 양압원( 재료 표 참조)을 가스 유입구에 연결하여 3PSI 압축을 적용합니다(그림 4D).
13. 압력 게이지를 지속적으로 점검하여 일관된 압축 수준이 적용되었는지 확인하십시오.
14. 기계적으로 자극된 배아에 대해 라이브 이미징 실험을 수행할 경우 가스 주입구가 압력 소스에 연결된 표준 현미경 스테이지 유리 슬라이드 홀더에 미세유체 칩을 놓습니다.
15. 압축 실험이 완료되면 다운스트림 분석을 위해 배아를 수집할 수 있습니다. 이렇게하려면 먼저 가스 입구에 진공을 적용하여 배아를 자유롭게하십시오.
16. 이어서, 미세유체 칩을 위쪽으로 기울여 배아가 배아 도입 포트 쪽으로 이동하도록 한다(도 4E).
17. 유리 피펫을 사용하여 미세유체 칩으로부터 배아를 수집한다.
    참고 : 수집시 배아 발달 및 생존력에 대한 압축의 영향은 초파리를 성인으로 성장시켜 조사 할 수 있습니다. 또한 미세유체 장치의 고처리량 처리 기능을 통해 많은 수의 샘플이 필요한 다운스트림 오믹스 기반 분석에 배아를 사용할 수 있습니다(그림 2).

Results

마이크로유체 시스템은 변형가능한 PDMS 측벽에 의해 분리된 2개의 서브-구획으로 분할된다. 첫 번째 구획은 초파리 배아가 도입되고 자동으로 정렬되고 정렬되고 압축되는 액체 시스템입니다. 두 번째 구획은 압축 채널의 유효 폭을 정밀하게 제어하기 위해 막 다른 마이크로 채널을 통해 압축 채널 양쪽의 가스 압력이 제어되는 가스 시스템입니다. 미세유체 장치는 바닥에 유리 슬라이드로 밀봉되어 있어 미세유체 장치의 관련 치수에 대한 샘플(보충 그림 2)의 고해상도 라이브 이미징이 가능합니다.

초파리 배아와 같은 다세포 유기체는 원하는 배아 발달 단계에서 선택됩니다. Drosophila 배아의 경우 부화 할 때까지 배아 크기가 변하지 않기 때문에 모든 발달 단계가이 접근법과 동등하게 호환됩니다. 선택된 샘플은 유리 마이크로피펫을 사용하여 큰 입구(즉, 직경 4 mm)를 통해 마이크로유체 장치 내로...

Discussion

이 기사는 수백 개의 전체 초파리 배아에 기계적 자극을 자동으로 정렬, 고정 및 정확하게 적용하는 미세 유체 장치의 개발에 대해 설명합니다. 미세 유체 시스템과 얇은 유리 커버 슬립의 통합은 자극 중에 고해상도 컨포칼 현미경으로 배아의 이미징을 가능하게했습니다. 미세유체 장치는 또한 다운스트림 생물학적 분석을 실행하기 위한 자극 직후 배아의 수집을 가능하게 했습니다. 이 장치의 설계 고려 사항, 제조 방법 및 특성화에 대해 자세히 설명했습니다. 실리콘 웨이퍼 금형 제조 프로토콜은 높은 종횡비 트렌치로 포토레지스트의 균일한 두꺼운 코팅을 허용했습니다.

이러한 제조 접근법이 성공하려면 베이킹 단계의 온도를 낮추고 포토레지스트로 코팅된 후 실리콘 웨이퍼의 가열 및 냉각 속도를 최소화하는 것이 중요합니다. 이것이 제대로 수행되지 않으면 포토레지스트 코팅이 쉽게 박리되어 금형 형상을 변경할 수 있습니다. 일단 실리콘 웨이퍼 몰드가 성공적으로 제조되면, 가열 및 냉각 사이클...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mL 삼각 펀칭 플라스틱 비커와 60 mm 페트리 접시	Fisher	14-955-111B	퍼페레이트 에어 홀
100 mm P B < 100> 0-100 500um SSP 테스트 등급 Si 웨이퍼	대학 웨이퍼	452
생검 펀치	Ted Pella	15110
표백제			브랜드 특정
무딘 바늘 세트	CML 공급	901
접촉 마스크 정렬기	Quintel	Q4000 MA
절단 매트	Dahle	Vantage 10670	크기 : 24" x 36"
개발자	Kayaku Advance Materials	SU-8 2000
직접 쓰기 리소그래퍼	Heidelberg	MLA100
해부 현미경			투과광이 있는 모든 상업적으로 사용 가능한 해부 현미경
유리 페트리 접시	Fisher	FB0875713A
Glass slide	Warner Instruments	64-0710  (CS-24/60)
HMDS Vapor Prime Oven	Yes Engineering	YES-3TA
NaCl			Not brand specific
Oven	Labnet	I5110A
Paintbrush			Not brand specific
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Photoresist	MicroChem SU-8	2100
플라즈마 클리너	Harrick Plasma	PDC-32G
휴대용 압력 소스	hygger 가장 조용한	HGD946
압력 게이지	Cole-Parmer	EW-68950-25
스핀 코터	Laurell	WS-650-8B
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)실란(PFOCTS)	Sigma-Aldrich	448931-10G
Triton-X 100	피셔	AAA16046AP
튜빙	Saint-Gobain	02-587-1A
초음파 세척기	Cole-Parmer	UX-08895-05
진공 펌프	Cole-Parmer	EW-07164-87