이 프로토콜은 시스테인과 메티오닌 사이의 비스알킬화와 프로파길 설포늄 중심에 의해 유발되는 용이한 티올-인 반응을 통한 고리형 펩타이드의 합성을 제시합니다.
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방법 논문
온테더 설포늄 중심을 사용한 순환 펩타이드 구성
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
최근 몇 년 동안 고리형 펩타이드는 우수한 생물학적 활성으로 인해 약물 발견 분야에서 점점 더 많은 관심을 끌고 있으며 그 결과 현재 임상적으로 사용되고 있습니다. 따라서 약물 발견 분야에서의 적용을 촉진하기 위해 순환 펩타이드를 합성하기 위한 효과적인 전략을 찾는 것이 중요합니다. 이 논문은 온레진 또는 분자내(분자간) 비스알킬화를 사용하여 고리형 펩타이드의 효율적인 합성을 위한 자세한 프로토콜을 보고합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 선형 펩티드는 수지에 동시에 결합 된 시스테인 (Cys) 및 메티오닌 (Met)과의 고체상 펩티드 합성을 이용하여 합성되었다. 또한, 환형 펩티드는 조정 가능한 테더 및 온테더 설포늄 센터를 사용하여 Met와 Cys 사이의 비스알킬화를 통해 합성되었습니다. 전체 합성 경로는 세 가지 주요 공정으로 나눌 수 있습니다 : 수지에 대한 Cys의 탈보호, 링커의 커플 링, 트리 플루오로 아세트산 (TFA) 절단 용액에서 Cys와 Met 간의 고리 화. 또한, 설포늄 중심의 반응성에서 영감을 받아 프로파길 그룹을 Met에 부착하여 티올-인 첨가를 유발하고 고리형 펩타이드를 형성했습니다. 그 후, 조 펩티드를 건조 및 아세토니트릴에 용해시키고, 분리한 다음, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다. 고리형 펩타이드의 분자량은 액체크로마토그래피-질량분석법(LC-MS)으로 확인하였고, 고리형 펩타이드와 환원제의 결합의 안정성은 HPLC를 이용하여 추가로 확인하였다. 또한, 고리형 펩타이드의 화학적 이동을 1H 핵자기 공명(1HNMR) 스펙트럼으로 분석하였다. 전반적으로, 이 프로토콜은 고리형 펩타이드를 합성하기 위한 효과적인 전략을 수립하는 것을 목표로 했습니다.
서론
단백질-단백질 상호작용(PPI)1은 약물 연구 및 개발에서 중추적인 역할을 합니다. 화학적 수단에 의해 고정된 형태를 갖는 안정화된 펩티드를 구축하는 것은 PPIs2의 모방 모티프를 개발하기 위한 가장 중요한 방법 중 하나이다. 현재까지 PPI를 표적으로 하는 여러 고리형 펩타이드가 임상용으로 개발되었습니다3. 대부분의 펩타이드는 구조적 엔트로피를 감소시키고 대사 안정성, 표적 결합 친화도 및 세포 투과성 4,5를 개선하기 위해 α 나선 형태로 제한됩니다. 지난 2 년 동안 Cys 6,7, 라이신8,9, 트립토판 10, 아르기닌 11 및 Met12,13의 측쇄가 비천연 아미노산에 삽입되어 펩타이드를 순환 형태로 고정했습니다.
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프로토콜
1. 장비 준비
주의 : 모르폴린, N, N- 디메틸 포름 아미드 (DMF), 디클로로 메탄 (DCM), N, N- 디 이소 프로필 에틸 아민 (DIPEA), TFA, 모르 폴린, 피 페리 딘, 디 에틸 에테르 및 메탄올은 독성, 휘발성 및 부식성이 있습니다. 이러한 시약은 흡입, 섭취 또는 피부 접촉을 통해 인체에 해를 끼칠 수 있습니다. 모든 화학 실험에는 일회용 장갑, 실험 코트 및 보호 안경을 포함한 보호 장비를 사용하십시오.
- 그림 1과 같이 표준 수동 Fmoc 기반 고체상 펩타이드 합성(SPPS)29로 링크-아미드 4-메틸벤즈하이드릴아민(MBHA) 수지에 모든 펩타이드 기질을 구성합니다.
- 선형 펩타이드를 구성하기위한 두 가지 옵션 중 하나를 사용하십시오 : 하나, 축합제 2- (7- 아자 벤조 트리아 졸 -1- 일) -N, N, N', N'- 테트라 메틸 우로 늄 헥사 플루오로 포스페이트 (HATU) 및 DIPEA 시약을 사용하여 펩타이드를 합성합니다. 또는 2, 아미드 축합 시약으로 1- 하이드 록시 벤조 트리 아졸 (HOBT) 및 N, N'- 디 이소 프로필 카르 보디 ....
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결과
모든 선형 펩티드는 표준 수동 Fmoc 고체상 합성에 의해 링크아미드 MBHA 수지 상에서 합성하였다. 모델 사이클릭 헥사펩타이드 (Ac(cyclo-I)-WMAAAC-NH2)를 도 5A에 기재된 바와 같이 구축하였다. 특히, 새로운 온테더 키랄 중심이 Met 알킬화에 의해 생성되었으며, 고리형 펩타이드(Ia, Ib)의 두 에피머가 역상 HPLC에 의해 확인되었습니다. 또한, 에피머의 전환 및 비율은 역상 HPLC의 적분을 이용하여 결정하였다. 헥사펩타이드 Ac-WMAAAC-NH2로부터 생성된 고리형 Ac-(씨클로-I)-WMAAAC-NH2 펩티드 1-Ia 및 1-Ib는 뚜렷한 머무름 시간 및 동일한 분자량을 나타내었다(도 5B). 다음으로, 상이한 작용기에 대한 고리형 펩티드의 내성을 도 5C에 나타낸 바와 같이 .......
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토론
이 논문에 기술된 합성 접근법은 펩티드 서열에서 Cys 및 Met를 사용하여 고리형 펩티드를 합성하는 방법을 제공하며, 여기서 기본 선형 펩티드는 일반적인 고체상 펩티드 합성 기술에 의해 구축된다. Cys와 Met 사이의 사이클릭 펩타이드의 비스알킬화를 위해, 전체 합성 경로는 세 가지 주요 공정으로 나눌 수 있다: 수지 상의 Cys의 탈보호, 링커의 커플링, 및 트리플루오로아세트산 절단 용액에서의 Cys와 Met 사이의 고리화. 특히, Cys의 보호기의 제거는 후속 폐환 반응에 중요한 단계인 것으로 밝혀졌다. 따라서 trt-Cys는 탈보호되었으며 용액에 명백한 노란색이 없을 때까지 수행되었습니다. 추가 연구에 따르면 Cys와 Met 방법론 간의 비스알킬화에 의해 개발된 고리형 펩타이드는 펩타이드가 아미노산 Cys 및 Met를 포함하는 조건으로 다양한 펩타이드에서 루프 클로저로 확장될 수 있습니다. 또한, 펩티드 서열 및 링커도 실험 설계에 따라 추가로 조정될 수 있었다(도 5
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2021YFC2103900)의 재정 지원을 인정합니다. 중국 자연 과학 재단 보조금 (21778009 및 21977010); 광동성 자연 과학 재단(2022A1515010996 및 2020A1515010521): 선전 과학 기술 혁신 위원회, (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 및 JCYJ20200109140406047); 및 심천-홍콩 뇌 과학 연구소-심천 기초 연구 기관 보조금(2019SHIBS0004). 저자는 화학 과학, 왕립 화학 학회 (Royal Society of Chemistry)의 참고 문헌 30 및 유기 화학 저널 (The Journal of Organic Chemistry, American Chemical Society)의 참고 문헌 31을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1,3-bis(bromomethyl)-benzen | Energy | D0215 | |
| 1,3-Dimethylbarbituric acid | Energy | A46873 | |
| 1H NMR 및 HSQC | Bruker | AVANCE-III 400 | |
| 1-하이드록시벤조트리아졸 수화물 | 에너지 | E020543 | |
| 2-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU) | 에너지 | A1797 | |
| 2-메르캅토피리딘 | 에너지 | Y31130 | |
| 6-아미노카프로산 | 에너지 | A010678 | |
| 아세트산 무수물 | 에너지 | A01021454 | |
| Acetonitrile | Aldrich | 9758 | |
| 암모늄 카보네이 | Energy | 12980 | |
| 디클로로메탄 (DCM) | 에너지 | W330229 | |
| 디지털 난방 냉각 드라이 배 | 스 Thermo Scientific | 88880029 | |
| Diisopropylethylamine (DIPEA) | 에너지 | W320014 | |
| Dimethyl formamide (DMF) | B020051 | ||
| Dithiothreitol | Energy | A10027 | |
| Electrospray Ionization Mass | SHIMADZU2020 | LC-MS2020 | |
| Fmoc-Ala-OH | 난징 펩타이드 생명공학 주식 회사 | R30101 | |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | 난징 펩타이드 생명공학 주식 회사 | R30201 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | 난징 펩타이드 생명공학 주식 회사 | R30501 | |
| Fmoc-Gln(Trt)-OH | 난징 펩타이드 생명 공학 주식 회사 | R30601 | |
| Fmoc-Glu(OtBu)-OH | 난징 펩타이드 생명 공학 주식 회사 | R30701 | |
| Fmoc-His(Boc)-OH | 난징 펩타이드 생명공학 주식 회사 | R30902 | |
| Fmoc-Ile-OH | 난징 펩타이드 생명공학 주식 회사 | R31001 | |
| Fmoc-Lys(Boc)-OH | 난징 펩타이드 생명공학 주식 회사 | R31201 | |
| Fmoc-Met-OH | 난징 펩타이드 생명공학 주식 회사 | R31301 | |
| Fmoc-Pro-OH | 난징 펩타이드 생명공학 주식 회사 | R31501 | |
| Fmoc-Ser(tBu)-OH | 난징 펩타이드 생명공학 주식 회사 | R31601 | |
| Fmoc-Thr(tBu)-OH | 난징 펩타이드 생명공학 주식 회사 | R31701 | |
| Fmoc-Trp (Boc)-OH | 난징 펩타이드 생명 공학 주식 회사 | R31801 | |
| Fmoc-Tyr(tBu)-OH | 난징 펩타이드 생명 공학 주식 회사 | R31901 | |
| Fmoc-Val-OH | 난징 펩타이드 생명 공학 주식 회사 | R32001 | |
| 포름산 | 에너지 | W810042 | |
| 고성능 액체 크로마토그래 | SHIMADZU | LC-2030 | |
| 메탄올 | 알드리치 | 9758 | |
| 모르폴린 | 알드리치 | M109062 | |
| N,N'-디이소프로필카르보디이미드 | 에너지 | B010023 | |
| 닌히드린 시약 | 에너지 | N7285 | |
| 프로파르길 브로마이드 | 에너지 | W320293 | |
| 링크 아미드 MBHA 수지 | 난징 펩타이드 생명공학 주식 회사 | ||
| 고체상 추출(SPE) 샘플 수집 플레이트& | nbsp; Thermo Scientific | 60300-403 | |
| Tetrakis (triphenylphosphine) 팔라듐 | 에너지 | T1350 | |
| 3 방향 마개 | Bio-Rad | 7328107 | |
| Triethylamine | Energy | B010737 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | J & K | 101398 | |
| 트리이소프로필실란(TIS) | 에너지 | T1533 |
참고문헌
- Arkin, M. R., Tang, Y. Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: Progressing toward the reality. Chemistry Biology. 21 (9), 1102-1114 (2014).
- Shi, X. D., et al. Reversible....
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재인쇄 및 허가
