항암 앱타머 개발에 필요한 단계는 표적에 대한 결합을 테스트하는 것입니다. 우리는 이 결합을 연구하기 위한 유세포 분석 기반 분석을 시연하며, 특정 단백질에 대해 음성 대조군 압타머와 양성 또는 음성 암세포를 포함하는 것의 중요성을 강조합니다.
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이 논문에서
요약
초록
항암 앱타머 개발의 핵심 과제는 개발된 앱타머의 표적 단백질에 대한 선택성과 특이성을 효율적으로 결정하는 것입니다. 단일 클론 항체에 비해 몇 가지 장점으로 인해 압타머 개발은 암 연구자들 사이에서 엄청난 인기를 얻었습니다. 지수 농축 (SELEX)에 의한 리간드의 체계적인 진화는 관심 단백질에 특이적인 압타머를 개발하는 가장 일반적인 방법입니다. SELEX에 이어 빠르고 효율적인 결합 분석은 식별 과정을 가속화하여 압타머의 선택성과 특이성을 확인합니다.
이 논문은 상피 세포 접착 분자(EpCAM)에 특이적인 압타머의 단계별 유세포 분석 기반 결합 분석을 설명합니다. 막횡단 당단백질 EpCAM은 대부분의 암종에서 과발현되며 암 시작, 진행 및 전이에 역할을 합니다. 따라서, 종양으로의 표적 약물 전달을 위한 귀중한 후보이다. 막 결합된 EpCAM에 대한 앱타머의 선택성 및 특이성을 평가하기 위해서는 EpCAM 양성 및 음성 세포가 필요하다. 추가적으로, EpCAM 결합 압타머와 유사한 길이 및 2차원(2D) 구조를 갖는 비결합 EpCAM 압타머가 요구된다. 결합 분석은 상이한 완충제 (블로킹 완충액, 세척 완충액, 인큐베이션 완충액, 및 FACS 완충액) 및 배양 단계를 포함한다.
앱타머는 세포주와 함께 배양된다. 인큐베이션 및 세척 단계에 이어서, 세포를 민감성 유동 세포분석 방법을 사용하여 평가할 것이다. 결과를 분석한 결과, EpCAM 음성 세포가 아닌 EpCAM 양성 세포에 대한 EpCAM 특이적 압타머의 결합을 보여준다. EpCAM 양성 세포에서, 이것은 비결합 압타머 대조군과 비교하여 EpCAM 압타머의 우측으로의 결합에서의 밴드 이동으로서 도시된다. EpCAM 음성 세포에서, EpCAM 결합 및 비 결합 압타머의 상응하는 밴드가 겹친다. 이것은 EpCAM 압타머의 선택성과 특이성을 입증합니다. 이 프로토콜은 EpCAM 압타머에 초점을 맞추고 있지만, 프로토콜은 다른 공개된 압타머에도 적용할 수 있다.
서론
암은 여전히 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나입니다1. 최근 수십 년 동안 암 치료의 상당한 개선에도 불구하고 항암제 개발은 여전히 논쟁의 여지가 많은 주제입니다. 암 치료의 주류 인 화학 요법은 환자의 치료 순응도를 제한하는 심각한 부작용을 동반하기 때문입니다. 더욱이, 화학 요법으로 유발 된 암 내성은 의학적 개입의 유일한 선택으로서의 적용을 제한했다. 단클론 항체(mAbs)의 적용은 암 치료에 대한 향상된 반응을 도입했습니다2. mAb를 사용한 이유는 화학 요법의 효능을 개선하고 부작용을 최소화하는 것이 었습니다. 그러나 mAb의 관리도 도전이되었습니다. 이는 mAb 유도 면역반응뿐만 아니라 동물의존적이고 고가의 생산 비용과 어려운보관 조건 때문이었습니다3. 1990년대에 압 타머의 도입4 앱타머의 적용이 mAb와 관련된 문제를 해결할 수 있기 때문에 암 치료에 대한 새로운 희망을 불러일으켰습니다.
압타머는 특정 표적에 대해 특이적으로 생산되는 짧은 핵산 서열입니다. 지수 농축(SELEX)에 의한 리간드의 체계적인 진화는 압타머 생산에서 일반적인 방법입니다. S....
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프로토콜
알림: 실험을 시작하기 전에 실험실 코트, 장갑 및 고글을 포함한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 이 프로토콜에 사용되는 재료, 시약, 장비 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 분석에 필요한 완충액
- 본 실험에 필요한 완충액인 압타머 폴딩에 필요한 SELEX 완충액, 블로킹 완충액(BB), 세척 완충액(WB) 및 결합 완충액(BiB)(표 1))을 실험 당일에 신선하게 준비하여 얼음 위 또는 4°C에 보관한다.
참고: 각 압타머에는 고유한 접힘 조건이 필요합니다. 여기에는 SELEX 버퍼 및 폴딩 온도 조건이 포함됩니다. 압타머(10)를 기술하는 원본 논문으로부터의 방법들을 완전히 복제하도록 주의해야 한다. 이 실험에서 모든 완충액은 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (DPBS)에서 준비됩니다. 각 실험에 필요한 완충액 부피는 테스트되는 세포주 수, 반복 횟수 및 앱타머 농도 수에 따라 다릅니다.
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결과
신약 발견 및 개발의 중요한 측면은 약물 후보의 선택성과 특이성을 보장하는 것입니다. 이는 약물 후보가 서로 다른 세포를 구별할 수 있어야 하며 관심 세포 집단(선택성)에만 영향을 미칠 수 있어야 함을 의미합니다. 선택성은 관심있는 단백질의 발현 측면에서 다른 세포주를 사용하여 연구됩니다. 본 연구에서, MDA-MB-231 및 HEK 293T 세포주를 EpCAM 양성 및 음성 세포로서 선택하였다. 특이성은 관심 단백질이 단일 약물 후보에만 반응한다는 것을 보여주는 또 다른 결정 요인입니다. 여기서, EpCAM 비결합 압타머인 TENN을 사용하여, TEPP만이 EpCAM에 부착되는 것을 나타내었다. EpCAM 양성 세포(MDA-MB-231)에서, TEPP 및 TENN으로 처리된 세포를 나타내는 히스토그램을 오버레이하면 TEPP-처리된 세포가 TENN-처리된 세포에 비해 오른쪽으로 이동함을 알 수 있다. 이것은 관심있는 단백질 인 EpCAM에 대한 압타머 TEPP의 결합을 보여줍니다 (그림 4D.......
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토론
새로운 압타머 개발의 주요 과제는 이 프로세스의 여러 단계에 적용되는 표준 지침이 없다는 것입니다. McKeague et al.은 최근 출판물에서 데이터의 불분명 한 표현과 연구 복제 실패로 이어지는 관련 문제 중 일부를 보여주었습니다. 그들은 압타머19를 특성화할 때 고려해야 할 기본 지침을 제안했습니다. 압타머 결합 분석은 해당 분야의 연구자들이 널리 사용하는 압타머23을 스크리닝 및/또는 특성화하는 데 중요한 단계입니다. 단계별 프로토콜을 표시하기 위한 단일 지침이 없기 때문에 앱타머-단백질 결합을 연구하는 데 일반적으로 사용되는 유세포분석 방법이 첨부된 비디오 프로토콜에서 시연됩니다.
압타머와 그 표적의 상호 작용을 측정하는 몇 가지 방법이 있습니다. 유세포 분석은 이러한 방법 중 하나입니다. 다른 예는 형광 편광, 표면 플라즈몬 공명, 모세관 전기영동, 및 등온 적정 열량측정법(
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자는 정신 및 신체 건강 및 임상 번역 연구소 (IMPACT) SEED 기금, 디킨 대학의 "Alfred Deakin 박사후 연구 펠로우십"프로그램 및 "호주 정부 연구 훈련 프로그램 장학금"을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 뚜껑이 부착된 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Sigma-Aldrich | T6649 | |
| 15 mL CellStar 파란색 나사 캡, 원뿔형 하단 튜브, | Greiner Bio One | 188271 | |
| 5 mL 혈청학 피펫 | Greiner Bio One | 606180 | |
| BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer | Becton Dickinson | N/A | |
| BD FACSDiva V9.0 | BD Biosciences | N/A | |
| 소 혈청 알부민(BSA), 동결건조 분말 | Sigma-AldrichTM | A7906-50G | |
| 밝은 선 혈구계 | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Dulbecco' s DMEM(Modified Eagle Medium) 고포도당 매체 분말 | 생명 기술 | 12100046 | |
| Dulbecco' s 인산염 완충 식염수 (DPBS) | Life Technologies | 21300025 | |
| FlowJo, LLC 10.8.1 | BD Biosciences | 해당 없음 | |
| 소태아 혈청 (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| HEK293T | American Type Culture Collection | ACS-4500 | |
| Heracell 150i CO2 인큐베이터 | Thermo Fisher Scientific | 해당 없음 | |
| Heraeus Megafuge 16R 원심분리기 | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| 염화마그네슘(MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MDA-MB-231 | 미국식 배양 컬렉션 | CRM-HTB-26 | |
| Microplate, PS, 96 well, F-bottom(굴뚝 well), Black | Greiner Bio One | 655076 | |
| MiniAmp 열 순환기 | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) 정제 | Life Technologies | 18912014 | |
| 발열원 및 RNase가 없는 초순수 | Milli-Q | ||
| T75 세포 배양 플라스크 | Cellstar | 658170 | |
| TENN | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3 |
| TEPP | 통합 DNA 기술 | N/A | 5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′ |
| 운반 RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8508-5X1ML | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
참고문헌
- Cancer. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers (2022).
- Liu, J. K. H. The history of monoclonal antibody development ....
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재인쇄 및 허가
