이 프로토콜은 시험관 내 및 생체 내 (마우스내) 감염, 무균 손상 및 암 모델 모두에 대한 반응으로 카스파제 활성화(카스파제-1, 카스파제-3, 카스파제-7, 카스파제-8, 카스파제-9 및 카스파제-11)를 평가하여 파이롭토시스, 세포자멸사, 괴사 및 PANoptosis와 같은 세포 사멸 경로의 개시를 결정합니다.
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이 논문에서
요약
초록
선천성 면역은 병원균과 무균 모욕에 대응하여 중요한 첫 번째 방어선을 제공합니다. 이 반응의 주요 기계적 구성 요소는 감염되거나 손상된 세포를 제거하고 면역 반응을 전파하기 위한 선천성 면역 프로그램 세포 사멸(PCD)의 시작입니다. 그러나 과도한 PCD는 염증 및 병리와 관련이 있습니다. 따라서 PCD의 활성화 및 조절을 이해하는 것은 선천성 면역 반응을 특성화하고 질병 스펙트럼 전반에 걸쳐 새로운 치료 표적을 식별하는 데 핵심적인 측면입니다.
이 프로토콜은 세포자멸사, 파이롭토시스, 괴사증 및 PANoptosis를 포함하는 다양한 PCD 경로와 종종 연관되는 시스테인 의존성 프로테아제 계열인 카스파제를 모니터링하여 선천성 면역 PCD 활성화를 특성화하는 방법을 제공합니다. 초기 보고서에서는 카스파제-2, 카스파제-8, 카스파제-9 및 카스파제-10을 개시제 카스파제로, 카스파제-3, 카스파제-6 및 카스파제-7을 세포자멸사에서 이펙터 카스파제로 특성화한 반면, 이후 연구에서는 염증성 카스파제, 카스파제-1, 카스파제-4, 카스파제-5 및 카스파제-11이 파이롭토시스를 유발합니다. 이전에 정의된 PCD 경로 전반에 걸쳐 카스파제와 기타 선천성 면역 및 세포 사멸 분자 사이에 광범위한 누화가 있는 것으로 알려져 있으며, 선천성 면역 및 PCD에 대한 기계론적 이해에서 핵심 지식 격차를 식별하고 PANoptosis의 특성화로 이어집니다. PANoptosis는 다른 세포 사멸 경로에서 카스파제를 포함한 구성 요소를 통합하는 PANoptosome 복합체에 의해 조절되는 독특한 선천성 면역 염증 PCD 경로입니다.
여기서, 다양한 자극에 반응하여 카스파제의 활성화를 평가하기 위한 방법이 제공된다. 이러한 방법은 활성화된 카스파제가 최적의 항체 및 블로팅 조건을 사용하여 웨스턴 블로팅으로 시각화할 수 있는 단백질 분해 절단을 거치기 때문에 시험관 내 및 생체 내 모두에서 PCD 경로의 특성화를 허용합니다. 동일한 세포 집단에서 여러 카스파제의 활성화를 평가할 수 있는 프로토콜 및 웨스턴 블로팅 워크플로우가 확립되어 PCD 프로세스의 포괄적인 특성화를 제공합니다. 이 방법은 발달, 항상성, 감염, 염증 및 암의 연구 영역 전반에 걸쳐 적용하여 건강 및 질병의 세포 과정 전반에 걸쳐 PCD 경로를 평가할 수 있습니다.
서론
선천성 면역 체계는 감염 중 및 조직 손상 및 항상성 변화와 같은 무균 자극에 대한 반응으로 첫 번째 방어선 역할을 합니다. 세포 표면과 세포질의 선천성 면역 센서는 병원체 또는 손상 관련 분자 패턴(각각 PAMP 또는 DAMP)에 반응하여 염증 신호 전달 경로 및 세포 반응을 유발합니다. 선천성 면역 반응의 핵심 과정 중 하나는 감염되거나 손상된 세포를 제거하고 추가 선천성 및 적응성 면역 반응을 유도하기 위한 세포 사멸을 유도하는 것입니다. 프로그램된 세포 사멸(PCD)은 종 전반에 걸쳐 고도로 보존된 과정으로, 타고난 면역 메커니즘으로서의 진화적 중요성을 강조합니다.
모든 세포 유형에서 활성화될 수 있는 몇 가지 선천성 면역 PCD 경로가 있습니다. 카스파제는 고도로 보존된 세포내 시스테인 의존성 프로테아제의 핵심 계열로, 전통적으로 비염증성 세포자멸사 경로뿐만 아니라 파이롭토시스, 괴사증 및 PANoptosis와 같은 염증성 PCD 경로를 포함한 많은 PCD 경로에서 중요합니다 1,2,3,4,5
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프로토콜
동물 사용 및 절차는 동물 사용 및 관리에 관한 세인트 주드 아동 연구 병원 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 솔루션 준비
- L929 컨디셔닝 미디어를 준비합니다.
- 플레이트 1 ×10 6 개의 L929 세포 ( 재료의 표 참조)를 50 mL의 L929 배양 배지를 함유하는 182cm2 조직 배양 플라스크 (배지의 제조에 대해서는 표 1 참조)에 넣었다.
- 37°C의 가습된 인큐베이터에서 5%CO2로 세포를 성장시킨다.
- 7일 후, 상층액을 수집하고, 0.45 μm 필터를 이용하여 여과한다. 분취량 50mL를 준비합니다(냉동 분취량은 -80°C에서 최대 1년 동안 보관).
- 골수유래 대식세포(BMDM) 배양액 500mL를 준비한다(표 1).
- 500mL의 BMDM 자극 매체를 준비합니다(표 1).
- 감염을 위해 500mL의 배지를 준비합니다(표 1).
- 100....
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결과
PANoptosis는 수많은 박테리아, 바이러스 및 곰팡이 감염 및 기타 염증 자극뿐만 아니라 암세포에서도관찰되었습니다 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62
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토론
카스파제 절단 및 활성화를 모니터링하면 선천성 면역 반응의 일부로서 선천성 면역 PCD 활성화에 대한 가장 포괄적인 사진 중 하나를 얻을 수 있습니다. 여기에 기술된 프로토콜은 IAV, HSV1 및 F. novicida 감염 및 멸균 트리거 LPS + ATP에 대한 반응으로 카스파제 활성화를 모니터링하는 전략을 보여주지만, 다수의 다른 자극이 PCD를 유도할 수 있고, 여러 간행물 44,48,49,50,51,52,53,54,56에 제시된 바와 같이, 이 방법에서 사용될 수 있고
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공개 사항
T.-D.K.는 화이자의 컨설턴트입니다.
감사의 글
의견과 제안을 해주신 Kanneganti 연구실 구성원들에게 감사드리며, 과학 편집 지원을 해주신 J. Gullett 박사님께도 감사드립니다. 우리 연구실의 작업은 국립 보건원 (NIH) 보조금 AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 및 CA253095 (T.-D.K.) 및 미국 레바논 시리아 연합 자선 단체 (T.-D.K.). 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.45 &무; m 필터 | Millipore | SCHVU05RE | |
| 10 mL 주사기 | BD Biosciences | 309604 | |
| 12% 폴리아크릴아미드 젤 10 웰 | Bio-Rad | 4561043 | |
| 12웰 플레이트 | 코닝 | 07-200-82 | |
| 18G 바늘 | BD Biosciences | 305195 | |
| 25G 바늘 | BD Biosciences | 305122 | |
| 50 mL 튜브 | 피셔 사이언티픽 | 50-809-218 | |
| 70 μ M 세포 스트레이너 | Corning | 431751 | |
| 150 mm 조직 배양 접시 | Corning | 430597 | |
| 182-cm2 조직 배양 플라스크 | Genesee Scientific | 25-211 | |
| 액세서리 흰색 트랜스 트레이 | Cytiva | 29-0834-18 | |
| Anti– 카스파제-1 항체 | AdipoGen | AG-20B-0042-C100 | |
| 항– caspase-11 항체 | Novus Biologicals | NB120-10454 | |
| 항– 카스파제-3 항체 | 세포 신호 기술 | 9662 | |
| 항– caspase-7 항체 | 세포 신호 기술 | 9492 | |
| 항– caspase-8 항체 | 세포 신호 기술 | 4927 | |
| 항– caspase-9 항체 | 세포 신호 기술 | 9504 | |
| 항– cleaved caspase-3 항체 | 세포 신호 기술 | 9661 | |
| 항– cleaved caspase-7 항체 | 세포 신호 기술 | 9491 | |
| 항– cleaved caspase-8 항체 | 세포 신호 기술 | 8592 | |
| 안티-마우스 HRP-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 315-035-047 | |
| 항토끼 HRP-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-047 | |
| 항쥐 HRP-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 112-035-003 | |
| 항– β-Actin 항체 (C4) HRP | Santa Cruz | sc-47778 HRP | |
| ATP | InvivoGen | tlrl-atpl | |
| BBL Trypticase Soy Broth | BD Biosciences | 211768 | |
| Bead | bath Chemglass Life Sciences | CLS-4598-009 | |
| Biophotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| BME | Sigma | M6250 | |
| 브로모페놀 블루 | Sigma | BO126 | |
| 세포 스크레이퍼 | CellTreat Scientific 제품 | 229315 | |
| 화학발광 이미저(Amersham 600) | 싸이티바 | 29083461 | |
| CO2 챔버 | VetEquip | 901703 | |
| 큐벳 | Fisher Scientific | 14-955-129 | |
| 해부 가위 | Thermo Fisher Scientific | 221S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995-073 | |
| DTT | Sigma | 43815 | |
| Eelectrophoresis 장치 | Bio-Rad | 1658004 | |
| 에탄올 | Pharmco | 111000200 | |
| 태아 소 혈청 | Biowest | S1620 | |
| 필터 페이 | Bio-Rad | 1703965 | |
| 펜치 | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Francisella novicida (U112 스트레인) | BEI 리소스 | NR-13 | |
| 젤 방출기 | Bio-Rad | 1653320 | |
| Gentamycin | Gibco | 15750060 | |
| Glycerol | Sigma | G7893 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| HCl | Sigma | H9892 | |
| Heat block | Fisher Scientific | 23-043-160 | |
| 단순 헤르페스 바이러스 1 (HF 균주) | ATCC | VR-260 | |
| 고혈당 DMEM | 시그마 | D6171 | |
| 인간 안티– 카스파제-1 항체 | R& D 시스템 | MAB6215 | |
| 인간 anti– caspase-8 항체 | Enzo | ALX-804-242 | |
| 가습 인큐베이터 | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| 이미지 분석 소프트웨어 | ImageJ | v1.53a | |
| IMDM | Thermo Fisher Scientific | 12440-053 | |
| 인플루엔자 A 바이러스 (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) | Hoffmann et al.에 따라 건설되었습니다. | ||
| L929 세포 | ATCC | CCL-1 | 세포주: L929 조건 매체 |
| L-시스테인 생성을 | Thermo Fisher Scientific | BP376-100 | |
| Luminata Forte, Western HRP 기질 | Millipore | WBLUF0500 | 표준 감도 HRP 기질 |
| MDCK 셀 | IAV 바이러스 역가 측정을 위한 | ATCC | CCL-34 |
| 메탄올 | 322415 | ||
| 마이크로 원심분리기 | Thermo Fisher Scientific | 75002401 | |
| 비필수 아미노산 | Gibco | 11140050 | |
| 무지방 분유 | Kroger | ||
| NP-40 솔루션 | Sigma | 492016 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| 페니실린과 스트렙토마이신 | Sigma | P4333 | |
| 페트리 디쉬 | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| PhosSTOP | Roche | PHOSS-RO | |
| 전원 | Bio-Rad | 164-5052 | |
| 프로테아제 억제제 정제 | Sigma | S8820 | |
| PVDF 멤브레인 | Millipore | IPVH00010 | |
| 락킹 쉐이커 | Labnet | S2035-E | |
| SDS | 시그마 | L3771 | |
| 염화나트륨 | Sigma | S9888 | |
| 소듐 데옥시콜레이트 | Sigma | 30970 | |
| 소듐 하이드록사이드 | Sigma | 72068 | |
| 소듐 피루베이트 | Gibco | 11360-070 | |
| 사각 페트리 접시 | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| 스트리핑 버퍼 | Thermo Fisher Scientific | 21059 | |
| 슈퍼 신호 펨토 HRP 기질 | Thermo Fisher Scientific | 34580 | 고감도 HRP 기질 |
| 탁상용 원심분리기 | Thermo Fisher Scientific | 75004524 | |
| 트랜스-블롯 반건조 시스템 | Bio-Rad | 170-3940 | |
| 트리스 | 시그마 | TRIS-RO | |
| 트윈 20 | Sigma | P1379 | |
| InvivoGen | tlrl-3pelps | 추출한 초순수 지질다당류(LPS) | |
| HSV1 바이러스 역가를 결정하기 위한 | ATCC | CCL-81 |
참고문헌
- Alnemri, E. S., et al. Human ICE/CED-3 protease nomenclature. Cell. 87 (2), 171(1996).
- Man, S. M., Kanneganti, T. D. Converging roles of caspases in inflammasome activation, cell death and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 16 (1), 7-21....
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