방법 논문

생물 의학 응용 분야를 위한 Fluorescence Lifetime Macro Imager

DOI:

10.3791/64321

⸱

2023년 4월 7일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biochemistry and Cell Biology, University College Cork, 2Cancer Research@UCC, University College Cork, 3Centre for Microscopy, Characterisation and Analysis (CMCA), The University of Western Australia, 4Physics Department, Brookhaven National Laboratory

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 논문은 긴 붕괴 방출 샘플의 거시적 광발광 수명 이미징을 위한 새롭고 빠른 광학 이미저의 사용에 대해 설명합니다. 통합, 이미지 획득 및 분석 절차는 이미징을 위한 센서 재료의 준비 및 특성화와 생물학적 샘플 연구에서 이미저의 적용과 함께 설명됩니다.

초록

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이 논문은 고체 상태의O2 민감성 코팅에서 용해성O2 민감성 프로브로 염색된 살아있는 동물 조직 샘플에 이르기까지 다양한 인광 샘플에서 분자 산소(O 2) 농도를 매핑하도록 설계된 새로운 광발광 수명 이미저를 제시합니다. 특히, 625nm 발광다이오드(LED)로 여기성이 있고 760nm에서 방출되는 나노입자 기반 근적외선 프로브 NanO2-IR을 사용하였다. 이미징 시스템은 Timepix3 카메라(Tpx3Cam)와 이미지 강화 장치도 있는 광학 기계식 어댑터를 기반으로 합니다. O2 인광 수명 이미징 현미경(PLIM)은 일반적으로 다양한 연구에 필요하지만 현재 플랫폼은 정확도, 일반적인 유연성 및 유용성에 한계가 있습니다.

여기에 제시된 시스템은 통합 광학 센서 및 판독 칩 모듈인 Tpx3Cam을 기반으로 하는 빠르고 고감도 이미저입니다. 표면 염색된 장 조직 샘플 또는 대장의 내강내 염색된 단편으로부터 고강도 인광 신호 및 안정적인 수명 값을 생성하는 것으로 나타났으며 약 20초 이내에 조직O2 수준의 상세한 매핑을 허용합니다. 무의식 동물에서 이식 된 종양에서 저산소증의 영상화에 대한 초기 실험도 제시된다. 또한 여기를 위한 390nm LED와 방출을 위한 대역통과 650nm 필터를 사용하여 Pt-포르피린 염료를 기반으로 하는 O2 민감성 물질과 함께 사용하도록 이미저를 재구성하는 방법에 대해서도 설명합니다. 전반적으로, PLIM 이미저는 사용된 프로브에 대한 수명 값의 정확한 정량적 측정과O2 농도의 각각의 2차원 맵을 생성하는 것으로 밝혀졌습니다. 또한 생체 외 조직 모델 및 살아있는 동물의 대사 이미징에도 유용합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O 2 는 생명체에 대한 주요 환경 매개 변수 중 하나이며, O 2 의 분포와 그 역학에 대한 지식은 많은 생물학적 연구 1,2,3에서 중요합니다. 인광 프로브 4,5,6,7,8 및 PLIM 9,10,11,12,13에 의한 조직 산소화 평가는 생물학 및 의학 연구 3,9,14,15,16에서 인기를 얻고 있습니다. 17,18,19. 이는 PLIM이 형광 또는 인광 강도 측정과 달리 프로브 농도, 광표백, 여기 강도, 광학 정렬, 산란 및 자가형광과 같은 외부 요인의 영향을 받지 않기 때문입니다.

그러나 현재O2 PLIM 플랫폼은 감도, 이미지 획득 속도, 정확도 및 일반적인 사용성에 의해 제한됩니다. 래스터 스캐닝 절차와 결합된 시간 상관 단일 광자 계수(TCSPC)는 PLIM 및 형광 수명 이미징 현미경(FLIM) 장치(20,21,22)에서 자주 사용됩니다. 그러나, PLIM은 긴 픽셀 체류 시간(밀리초 범위에서)을 요구하기 때문에, 이미지 획득 시간은 FLIM 애플리케이션(20,22,23)에 요구되는 것보다 훨씬 더 긴다. 게이트 CCD/CMOS 카메라와 같은 다른 기술은 단일 광자 감도가 부족하고 낮은 프레임 속도(20,24,25,26)를 갖습니다. 또한, 기존의 PLIM 시스템은 대부분 현미경 형식으로 사용되는 반면, 거시적 시스템은 덜 일반적이다27.

TCSPC에 기초한 PLIM 매크로 이미저(28 )는 이러한 많은 한계들을 극복하기 위해 설정되었다. 이미 저의 설계는 다음과 같은 새로운 광기계식 어댑터 인 Cricket을 사용하여 크게 촉진되었습니다 : i) 후면의 카메라 모듈과 전면의 대물 렌즈를 쉽게 결합 할 수있는 2 개의 C- 마운트 어댑터; ii) 이미지 강화 장치용 내부 하우징 및 크리켓 바깥쪽에 있는 후자용 전원 소켓; iii) 표준 25mm 방출 필터를 증압기 앞에 수용할 수 있는 전면 C-마운트 어댑터 뒤의 내부 공간; 및 iv) 렌즈와 카메라 사이의 광학 정렬/초점을 허용하여 카메라 칩 상에 선명한 이미지를 생성할 수 있도록 하는 링 레귤레이터가 있는 내장형 광 시준 광학 장치.

조립된 이미저에서 카메라 모듈은 Cricket 어댑터의 뒷면에 연결되며, 여기에는 광음극, 마이크로 채널 플레이트(MCP), 증폭기 및 고속 신틸레이터인 P47 형광체로 구성된 이미지 강화 장치도 있습니다. 크리켓 내부에는 760nm ± 50nm 방출 필터가 장착되어 있으며 대물 렌즈인 NMV-50M11''이 전면 C-마운트 어댑터에 부착되어 있습니다. 마지막으로 렌즈와 카메라는 링 레귤레이터와 광학적으로 정렬됩니다.

증광기의 역할은 들어오는 광자를 감지하여 카메라 칩에서 빠른 빛의 폭발로 변환하여 등록하고 방출 감쇠 및 수명 이미지를 생성하는 데 사용하는 것입니다. 카메라 모듈은 고급 TCSPC 기반 광학 센서 어레이(256픽셀 x 256픽셀)와 차세대 판독 칩 29,30,31,32,33으로 구성되어 1.6ns의 시간 분해능과 80Mpixel/s 판독 속도로 이미징 칩의 각 픽셀에서 광자 버스트의 도착 시간(TOA) 및 임계값 초과 시간(TOT)을 동시에 기록할 수 있습니다.

이 구성에서 증압기가 있는 카메라는 단일 광자 감도를 갖습니다. 이는 데이터 구동형이며, 스피드 픽셀 검출기 판독(SPIDR) 시스템(34)에 기초한다. 이미 저의 공간 해상도는 이전에 평면 인광 O2 센서와 해상도 플레이트 마스크로 특성화되었습니다. 기기 응답 기능(IRF)은 다른 모든 측정에 사용된 것과 동일한 설정에서 평면 형광 센서의 이미징으로 측정되었습니다. 약 2.6ns의 염료 수명은 PLIM 모드에서 IRF 측정에 사용하기에 충분히 짧았습니다. 이미저는 각각 39.4μm 및 30.6ns(절반 최대에서 전체 너비)의 공간 및 시간 해상도로 최대 18mm x 18mm 크기의 물체를 이미지화할 수 있습니다(28).

다음 프로토콜은 이전에 특성화된 근적외선O2 프로브인 NanO2-IR35로 염색된 생물학적 샘플에서O2 농도를 매핑하기 위한 매크로 이미저의 조립 및 후속 사용을 설명합니다. 프로브는 백금(II) 벤조포르피린(PtBP) 염료를 기반으로 하는 밝고 광안정성이 있는 세포 투과성 O2 감지 프로브입니다. 625 nm에서 여기성이고, 760 nm에서 방출하며, 생리학적 범위(0%-21% 또는 0-210 μM의 O2)에서O2에 대한 강력한 광학 반응을 제공합니다. 이미저는 또한 Pt(II)-포르피린 염료를 기반으로 다양한 센서 재료를 특성화하는 것으로 입증되었습니다. 전반적으로 이미저는 일반적인 사진 카메라와 유사하게 작고 유연합니다. 현재 설정에서 이미저는 다양한 광시야 PLIM 애플리케이션에 적합합니다. LED를 빠른 레이저 소스로 대체하면 이미저의 성능이 더욱 향상되고 잠재적으로 나노초 FLIM 애플리케이션을 가능하게 할 수 있습니다.

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프로토콜

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동물을 이용한 모든 절차는 유럽 공동체 위원회 지침(2010/63/EU)에 따라 건강 제품 규제 당국(HPRA, 아일랜드)에서 발행한 승인에 따라 수행되었으며 University College Cork의 동물 실험 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 시료 전처리

  1. 생체 외에서 살아있는 조직 샘플의 프로브로 염색
    1. 생체 외 적용의 경우 4주령 암컷 Balb/c 마우스에서 갓 분리된 조직 샘플을 사용하십시오.
    2. 실험 당일, 참수로 마우스를 안락사시키고 약 10mm 크기의 결장 (대장)의 파편을 신속하게 해부합니다. 이들을 즉시 PBS 완충액으로 세척하고, 10 mM Hepes 완충액(pH 7.2)이 보충된 DMEM 배지에 넣고, 37°C에서36 배양한다.
    3. 장의 장액 측면의 표면 염색을 위해 살아있는 조직 샘플을 미니 접시에 옮기고 조직 샘플을 덮기 위해 1mg/mL NanO2-IR 프로브가 포함된 완전한 DMEM 2mL를 적용하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
      참고: 사후 조직의 세포는 배양 중에 수년 동안 살아 있는 상태로 유지됩니다. NaNO2-IR은 경미한 세포독성을 나타내므로 조직 분리 후 4시간 이내에 모든 실험이 완료되었습니다.
    4. 심부 조직 내 생체 외 염색의 경우 장 조각을 건조한 페트리 접시로 옮기고 여과지로 과도한 DMEM을 제거합니다.
    5. 1mg/mL NanO2-IR 35가 포함된 DMEM 1μL을 Hamilton 주사기로 내강 내로 주입하고 샘플을15 분 또는 최대 4시간 동안 배양합니다.
      참고: NaNO2-IR은 경미한 장기 세포독성 효과를 나타냅니다. 따라서 모든 실험은 조직 분리 후 4시간 이내에 완료되어야 합니다.
  2. 살아있는 동물에서 염색 된 종양 조직의 제조
    1. 생체 내 적용의 경우 0.05mg/mL의 NaNO2-IR 프로브가 포함된 무혈청 배지에서 CT26 세포를 18시간 동안 사전 염색합니다.
    2. 마우스를 취하여 오른쪽 옆구리의 주사 부위를 면도하고 NanO2-IR로 미리 염색 된 1 × 10 5 개의 세포와 1 ×10 5 개의 세포를 혼합하여 주사기 200 μL를 주사기로 주입합니다.
    3. 마우스에서 종양이 자라도록 하고, 캘리퍼스로 종양 크기를 모니터링하고 동물 체중을 주기적으로 모니터링한다37. 이식된 종양을 가진 동물은 종양 성장 7일째에 영상화 준비가 됩니다.
      참고: 종양 부피는 식 (1)을 사용하여 계산되었습니다.
      V = (L × W 2)/2 (1)
      여기서 L은 종양의 직경이고 Wi는 직경 L에 수직인 직경입니다.
    4. 영상 촬영 직전에 자궁 경부 탈구로 동물을 희생하십시오.

2. PLIM 이미징 설정

  1. 크리켓 어댑터를 가지고 뒷면 C-마운트 어댑터를 제거하여 내부의 강화기 하우징에 접근합니다. MCP-125 이미지 강화 장치를 이 칸에 삽입하고 C-마운트 어댑터를 다시 끼웁니다.
  2. 크리켓의 전면 C-마운트 어댑터를 제거하고 760nm ± 50nm 방출 필터를 삽입한 다음 C-마운트를 다시 넣어 고정합니다.
  3. C-마운트 어댑터를 통해 Tpx3Cam 카메라 모듈을 크리켓 모듈 뒷면에 연결합니다.
  4. C-마운트 어댑터를 통해 크리켓 모듈의 전면에 렌즈를 연결합니다.
  5. 광학 블랙 박스 위에 전체 카메라 어셈블리를 장착하고 s가 아래를 향하도록 합니다.tage 샘플이 이미지화됩니다(그림 1).
  6. 블랙박스 내부의 브레드보드에 연결된 포스트에 624nm 고휘도 LED를 장착합니다.
  7. LED를 전원 공급 장치 및 펄스 발생기에 연결합니다. LED를 켜고 초점을 맞춰 이미징된 샘플의 효과적이고 균일한 여기를 보장합니다.
  8. 카메라를 다른 펄스 발생기에 연결하고, 카메라와 LED38로 전송된 펄스를 동기화한다.
  9. 크리켓 장치의 특수 케이블과 소켓을 사용하여 증압기를 표준 전원 공급 장치에 연결하고 게인을 2.7V로 설정합니다.
  10. 렌즈와 크리켓 어댑터의 초점 기능을 사용하여 샘플 스테이지에 카메라 광학 장치의 초점을 맞춰 콘트라스트와 밝기가 좋은 샘플의 선명한 이미지를 생성합니다.
  11. Pt-포르피린 염료와 함께 이미저를 사용하려면 크리켓 모듈에서 625nm LED를 여기용 390nm LED로 교체하고 760nm ± 50nm 필터를 650nm ± 50nm 필터로 교체합니다.

3. 이미지 획득

  1. 카메라 렌즈 앞에 샘플을 놓습니다.
    알림: x-y-z 조정 가능한 s를 사용하십시오.tage s를 조정하기 위한 샘플 홀더로amp좋은 초점을 위한 위치.
  2. 방의 모든 조명을 끕니다.
  3. 초점 및 샘플 정렬과 같은 작동 매개변수를 조정하기 위해 Sophy 소프트웨어를 켭니다.
    알림: Sophy 소프트웨어는 이미징 매개변수를 설정하고 데이터를 기록하기 위해 카메라와 함께 제공됩니다. 카메라 코드를 확인하여 소프트웨어가 카메라에 연결되어 있는지 확인하십시오. 그러나 데이터 수집을 위해 다른 프로그램을 사용했습니다.
  4. 모듈(Modules)에서 무한 프레임(infinite frames)을 선택하고 픽셀 작동 모드(pixel operation mode)를 임계값 초과 시간(time over threshold)으로 설정합니다.
  5. 모듈에서 미리 보기로 이동하고 활성 모듈을 선택합니다. 그러면 Medpix/Timpix 프레임 창이 열립니다.
  6. 이 창에서 색상 스케일을 변경하고 이미지를 원하는 방향으로 회전 합니다.
  7. 증압기를 켜고 녹음을 시작합니다.
    알림: Sophy 소프트웨어의 기록 화면을 사용하여 s의 정렬 및 초점을 시각적으로 확인합니다.amp녹음을 위한 LED 여기 매개변수를 최적화합니다.
  8. 녹음을 중지하고 Sophy 소프트웨어를 닫습니다.
  9. 터미널로 이동하여 맞춤형으로 설계된 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터를 바이너리 형식으로 수집하고 후처리(https://github.com/svihra/TimePix3)합니다.
    1. 터미널에서 다음 명령을 실행하여 데이터를 기록합니다.
      CD 문서/SPIDR/트렁크/릴리스/
       LS (엘에스
      ./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {파일 이름} - t {획득 시간}
      참고: "ls"를 입력하면 현재 디렉터리에 있는 파일 목록을 확인합니다. Tpx3daq가 표시되는지 확인합니다.
    2. 모든 프레임이 기록될 때까지 기다리십시오.
    3. 데이터를 처리하려면 터미널에서 다음 명령을 실행합니다 .
      cd 문서/DataProcessing/Timepix3/Timepix3/
      뿌리
      . L dataprocess.cpp++
      .x DRGUI입니다. C
    4. RRGui 창이 열릴 때까지 기다립니다. 왼쪽의 모든 변수와 오른쪽의 모든 데이터, 단일 파일 및 중심을 선택합니다.
    5. 처리할 파일을 선택하고 데이터 감속기를 실행합니다.
      참고: 처리된 모든 파일은 원시 파일과 동일한 폴더에 나타납니다.

4. 데이터 분석

  1. 데이터를 .ics 이미지 파일(https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam)에 기록하는 C 언어로 작성된 전용 프로그램으로 후처리된 데이터를 분석합니다.
  2. 무료로 제공되는 Time Resolved Imaging 소프트웨어를 사용하여 .ics 이미지 파일을 엽니다( 재료 표 참조). 인광 감쇠를 맞추기 위해 2-지수 함수를 사용합니다.
  3. 사용 가능한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 피팅된 .ics 이미지 파일을 엽니다( 재료 표 참조).
  4. 룩업 테이블을 사용하여 인광 수명 이미지를 생성하고 유사 색상 스케일(예: 수명이 짧은 경우 파란색, 긴 수명을 나타내는 빨간색)로 인코딩합니다. 측정 기능을 사용하여 전체 이미지 또는 특정 관심 영역(ROI)에 대한 평균 수명 값을 계산합니다.
  5. 프로브(36)의O2 교정의 피팅으로부터 얻어진 방정식을 이용하여 수명 값을 산소 농도로 변환한다.
    참고: 이 작업에는 방정식 (2)가 사용되었습니다.
    O 2 [μM] = −86.16 + 770.35 × e−0.049 × LT (2)

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

생체 외 이미징 적용의 경우, 장 조직의 단편은 조직의 장액 쪽에 NanO2-IR 프로브의 국소 적용에 의해 염색되었습니다. 더 깊은 염색을 위해 1μL의 프로브를 내강에 주입했습니다. 후자의 경우, 0.2-0.25mm 두께의 장벽이 프로브를 카메라로부터 보호했습니다. 두 가지 염색 공정이 도 2A에 예시되어 있다.

결과 강도 및 PLIM 이미지는 그림 2B-G에 나와 있습니다. 색상은 평생 값의 차이와 조직의 장막 및 점막 측면의 산소 공급 차이를 명확하게 반영합니다. 그림 2C 및 그림 2D는 국소적으로(그림 2C) 및 내강내로(그림 2D) 염색된 유사한 조직...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

위의 프로토콜은 새 이미저의 조립 및 마이크로초 FLIM/PLIM 모드에서의 작동에 대한 자세한 설명을 제공합니다. TCSPC 기반의 차세대 Tpx3Cam 카메라는 광기계식 어댑터 Cricket과 이미지 강화 장치, 방출 필터 및 매크로 렌즈를 통해 결합되어 작동하기 쉬운 안정적이고 컴팩트하며 유연한 광학 모듈을 생성합니다. 이미저는 인광 물질의 특성화 및 살아있는 조직 O2 이미징을 포함하는 다양한 샘플 및 분석 작업에서 잘 수행되는 것으로 나타났습니다. 근적외선 Pt(II)-벤조포르피린 기반 세포 투과성 가용성 프로브 NanO2-IR 및 적색 방출 Pt(II)-포르피린 기반 고체 상태 센서를 이미징 실험에 사용했습니다. 이 센서는 큰 스톡스 이동, 긴 방출 수명, 높은 감도, 빠른 응답 및 우수한 광화학적 안정성으로 인해O2 의 담금질 인광 감지에 성공적으로 사용되었습니다.

이러한 상이한O2-감응성 프로브 및 고체-상...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Science Foundation Ireland, 보조금 SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 및 18/SP/3522, Breakthrough Cancer Research(Precision Oncology Ireland)의 이 작업에 대한 재정 지원에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
627nm LEDParts Express: 센서의 여기 파장에 따라 다른 LED로 교체할 수 있습니다. Pt-porphyrin 염료에 390nm LED를 사용했습니다.
760 & plusmn; 50 nm emission filterEdmund Optics84-788센서의 방출 파장에 따라 다른 필터로 교체할 수 있습니다. 중고 650 ± Pt-포르피린 염료용 50nm 대역통과 필터.
Balb/c 마우스Envigo, 영국Balb/c
블랙 박스ThorlabsXE25C9/M
크리켓 어댑터PhotonisCricket-2
CT26 cells ATCCCT26입니다. WThttps://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEMSigma-AldrichD0697다른 매체도 ImageJ
SoftwareImageJFree Image Analysis Software를 사용할 수 있습니다. 다음에서 다운로드할 수 있습니다: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
MCP-125 이미지 강화기 P47 인광 스크린PhotonisPP0360EF
Mini dishSarstedt83.3900.30035 mm 직경 
마일라 플라스틱 필름, 75 마이크론 RS Ireland785-0795Othe 플라스틱 기판도 사용할 수 있습니다
NanO2-IR집에서 만든n/a프로브는 발표된 방법 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. 인광 산소 민감성 프로브를 사용한 뇌 대사 활동의 생체 내 이미징. J Neurosci 방법. 2013 년 6 월 15 일; 216(2):146-51. 도이: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 년 4 월 25 일. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' 또는 우리 연구실에서 제공합니다. 
NMV-50M11" 50mm 렌즈NavitarC-마운트 어댑터와 호환되는 다른 렌즈를 사용할 수 있습니다
광학 브레드보드ThorlabsMB1836
Petri DishesSarstedt82.1472.00192mm 직경
전원 공급 장치Tenma72-10495
펄스 발생기TenmaTGP110
SophyAmsterdam Scientific Instrumentsn/zTpx3Cam
Tpx3CamAmsterdam Scientific InstrumentsTPXCAM
Tri2 SoftwareUniversity of Oxford n/aFree Time Resolved Imaging 소프트웨어와 함께 ASI에서 제공하는 n/z 다음에서 다운로드할 수 있습니다: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml
XYZ Translation StageThorlabsLT3
, .

참고문헌

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  15. Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging. Applied Physics Letters. 108, 091111(2016).
  16. Babilas, P., et al. In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors. Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).
  17. Babilas, P., et al. Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors. Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).
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