이 논문은 긴 붕괴 방출 샘플의 거시적 광발광 수명 이미징을 위한 새롭고 빠른 광학 이미저의 사용에 대해 설명합니다. 통합, 이미지 획득 및 분석 절차는 이미징을 위한 센서 재료의 준비 및 특성화와 생물학적 샘플 연구에서 이미저의 적용과 함께 설명됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 논문은 고체 상태의O2 민감성 코팅에서 용해성O2 민감성 프로브로 염색된 살아있는 동물 조직 샘플에 이르기까지 다양한 인광 샘플에서 분자 산소(O 2) 농도를 매핑하도록 설계된 새로운 광발광 수명 이미저를 제시합니다. 특히, 625nm 발광다이오드(LED)로 여기성이 있고 760nm에서 방출되는 나노입자 기반 근적외선 프로브 NanO2-IR을 사용하였다. 이미징 시스템은 Timepix3 카메라(Tpx3Cam)와 이미지 강화 장치도 있는 광학 기계식 어댑터를 기반으로 합니다. O2 인광 수명 이미징 현미경(PLIM)은 일반적으로 다양한 연구에 필요하지만 현재 플랫폼은 정확도, 일반적인 유연성 및 유용성에 한계가 있습니다.
여기에 제시된 시스템은 통합 광학 센서 및 판독 칩 모듈인 Tpx3Cam을 기반으로 하는 빠르고 고감도 이미저입니다. 표면 염색된 장 조직 샘플 또는 대장의 내강내 염색된 단편으로부터 고강도 인광 신호 및 안정적인 수명 값을 생성하는 것으로 나타났으며 약 20초 이내에 조직O2 수준의 상세한 매핑을 허용합니다. 무의식 동물에서 이식 된 종양에서 저산소증의 영상화에 대한 초기 실험도 제시된다. 또한 여기를 위한 390nm LED와 방출을 위한 대역통과 650nm 필터를 사용하여 Pt-포르피린 염료를 기반으로 하는 O2 민감성 물질과 함께 사용하도록 이미저를 재구성하는 방법에 대해서도 설명합니다. 전반적으로, PLIM 이미저는 사용된 프로브에 대한 수명 값의 정확한 정량적 측정과O2 농도의 각각의 2차원 맵을 생성하는 것으로 밝혀졌습니다. 또한 생체 외 조직 모델 및 살아있는 동물의 대사 이미징에도 유용합니다.
서론
O 2 는 생명체에 대한 주요 환경 매개 변수 중 하나이며, O 2 의 분포와 그 역학에 대한 지식은 많은 생물학적 연구 1,2,3에서 중요합니다. 인광 프로브 4,5,6,7,8 및 PLIM 9,10,11,12,13에 의한 조직 산소화 평가는 생물학 및 의학 연구 3,9,14,15,16에서 인기를 얻고 있습니다
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프로토콜
동물을 이용한 모든 절차는 유럽 공동체 위원회 지침(2010/63/EU)에 따라 건강 제품 규제 당국(HPRA, 아일랜드)에서 발행한 승인에 따라 수행되었으며 University College Cork의 동물 실험 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 시료 전처리
- 생체 외에서 살아있는 조직 샘플의 프로브로 염색
- 생체 외 적용의 경우 4주령 암컷 Balb/c 마우스에서 갓 분리된 조직 샘플을 사용하십시오.
- 실험 당일, 참수로 마우스를 안락사시키고 약 10mm 크기의 결장 (대장)의 파편을 신속하게 해부합니다. 이들을 즉시 PBS 완충액으로 세척하고, 10 mM Hepes 완충액(pH 7.2)이 보충된 DMEM 배지에 넣고, 37°C에서36 배양한다.
- 장의 장액 측면의 표면 염색을 위해 살아있는 조직 샘플을 미니 접시에 옮기고 조직 샘플을 덮기 위해 1mg/mL NanO2-IR 프로브가 포함된 완전한 DMEM 2mL를 적용하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
참고: 사후 조직의 세포는 배양 중에 수년 동안 살아 있는 상태로 유지됩니다. NaNO2-IR은 경미한 ....
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결과
생체 외 이미징 적용의 경우, 장 조직의 단편은 조직의 장액 쪽에 NanO2-IR 프로브의 국소 적용에 의해 염색되었습니다. 더 깊은 염색을 위해 1μL의 프로브를 내강에 주입했습니다. 후자의 경우, 0.2-0.25mm 두께의 장벽이 프로브를 카메라로부터 보호했습니다. 두 가지 염색 공정이 도 2A에 예시되어 있다.
결과 강도 및 PLIM 이미지는 그림 2B-G에 나와 있습니다. 색상은 평생 값의 차이와 조직의 장막 및 점막 측면의 산소 공급 차이를 명확하게 반영합니다. 그림 2C 및 그림 2D는 국소적으로(그림 2C) 및 내강내로(그림 2D) 염색된 유사한 조직.......
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토론
위의 프로토콜은 새 이미저의 조립 및 마이크로초 FLIM/PLIM 모드에서의 작동에 대한 자세한 설명을 제공합니다. TCSPC 기반의 차세대 Tpx3Cam 카메라는 광기계식 어댑터 Cricket과 이미지 강화 장치, 방출 필터 및 매크로 렌즈를 통해 결합되어 작동하기 쉬운 안정적이고 컴팩트하며 유연한 광학 모듈을 생성합니다. 이미저는 인광 물질의 특성화 및 살아있는 조직 O2 이미징을 포함하는 다양한 샘플 및 분석 작업에서 잘 수행되는 것으로 나타났습니다. 근적외선 Pt(II)-벤조포르피린 기반 세포 투과성 가용성 프로브 NanO2-IR 및 적색 방출 Pt(II)-포르피린 기반 고체 상태 센서를 이미징 실험에 사용했습니다. 이 센서는 큰 스톡스 이동, 긴 방출 수명, 높은 감도, 빠른 응답 및 우수한 광화학적 안정성으로 인해O2 의 담금질 인광 감지에 성공적으로 사용되었습니다.
이러한 상이한O2-감응성 프로브 및 고체-상.......
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공개 사항
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
Science Foundation Ireland, 보조금 SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 및 18/SP/3522, Breakthrough Cancer Research(Precision Oncology Ireland)의 이 작업에 대한 재정 지원에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 627nm LED | Parts Express | : 센서의 여기 파장에 따라 다른 LED로 교체할 수 있습니다. Pt-porphyrin 염료에 390nm LED를 사용했습니다. | |
| 760 & plusmn; 50 nm emission filter | Edmund Optics | 84-788 | 센서의 방출 파장에 따라 다른 필터로 교체할 수 있습니다. 중고 650 ± Pt-포르피린 염료용 50nm 대역통과 필터. |
| Balb/c 마우스 | Envigo, 영국 | Balb/c | |
| 블랙 박스 | Thorlabs | XE25C9/M | |
| 크리켓 어댑터 | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 cells | ATCC | CT26입니다. WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | 다른 매체도 ImageJ |
| Software | ImageJ | Free Image Analysis Software를 사용할 수 있습니다. 다음에서 다운로드할 수 있습니다: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| MCP-125 이미지 강화기 P47 인광 스크린 | Photonis | PP0360EF | |
| Mini dish | Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm 직경 |
| 마일라 플라스틱 필름, 75 마이크론 | RS Ireland | 785-0795 | Othe 플라스틱 기판도 사용할 수 있습니다 |
| NanO2-IR | 집에서 만든 | n/a | 프로브는 발표된 방법 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. 인광 산소 민감성 프로브를 사용한 뇌 대사 활동의 생체 내 이미징. J Neurosci 방법. 2013 년 6 월 15 일; 216(2):146-51. 도이: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 년 4 월 25 일. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' 또는 우리 연구실에서 제공합니다. |
| NMV-50M11" 50mm 렌즈 | Navitar | C-마운트 어댑터와 호환되는 다른 렌즈를 사용할 수 있습니다 | |
| 광학 브레드보드 | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Dishes | Sarstedt | 82.1472.001 | 92mm 직경 |
| 전원 공급 장치 | Tenma | 72-10495 | |
| 펄스 발생기 | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 Software | University of Oxford n | /a | Free Time Resolved Imaging 소프트웨어와 함께 ASI에서 제공하는 n/z 다음에서 다운로드할 수 있습니다: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
참고문헌
- Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
- Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C.
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재인쇄 및 허가
