방법 논문

알레르기 성 접촉 피부염의 뮤린 모델로서의 접촉 과민증

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DOI:

10.3791/64329

⸱

2022년 9월 26일

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 2Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

이 논문에서

정오 공지

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요약

접촉 과민증 (CHS)은 알레르기 성 접촉 피부염 (ACD)의 뮤린 실험 모델입니다. CHS는 가슴과 복부의 면도 된 피부를 페인팅하여 반응성 합텐으로 감작을 기반으로하며, 희석 된 합텐으로 후속 귀 피부 챌린지를 통해 다양한 방법으로 평가되는 붓기 반응을 일으 킵니다.

초록

접촉 과민증 (CHS)은 마우스에서 연구 할 수있는 알레르기 성 접촉 피부염 (ACD)의 실험 모델입니다. 이 연구는 다양한 테스트로 측정하고 정량화 할 수있는 마우스의 CHS 반응을 연구하는 데 도움이되는 객관적인 실험실 방법을 제시하는 것을 목표로합니다. CHS를 유도하기 위해, "0"일째에, 마우스는 아세톤-에탄올 혼합물 중의 합텐 2,4,6-트리니트로클로로벤젠(TNCB)으로 복 도장에 의해 이전에 면도된 반점에 감작시킨 반면, 음성 대조군 마우스는 비히클 단독-아세톤-에탄올 혼합물로 가짜 감작되었다. "4"일째에, 기준선 귀 두께를 CHS(챌린지)의 도출 전에 시험군 및 대조군 둘 다에서 희석된 TNCB로 양쪽 귀를 페인팅함으로써 마이크로미터로 측정하였다. 24시간 후, 귀 팽윤을 마이크로미터로 측정하였다. CHS는 염증이 있는 조직에서 팽윤을 일으키는 T 세포 매개 면역 반응의 예이며, 동일한 합텐으로 피부 챌린지 후 24시간 후에 최고조에 달한다. 귀 부종의 증가는 증강 된 귀 무게, 골수퍼옥시다제 (MPO) 활성, 귀 추출물의 전염증성 사이토카인 농도, 조직 학적 검사에서 부종 진피의 두꺼움 증가 및 귀 혈관 투과성과 관련이 있습니다. 또한 대조군 마우스와 비교했을 때 시험군의 혈청에서 TNP 특이적 IgG1 항체의 농도가 증가하였다. 추가적으로, CHS는 이전에 TNCB로 감작된 공여자로부터 수득된 CHS-이펙터 세포와 함께 성공적으로 전달될 수 있다. CHS-이펙터 세포를 순진한 수용자 마우스에 정맥내 투여하였고, 이는 후속적으로 동일한 희석된 합텐으로 도전되었다. 귀 부종은 24시간 후에 마이크로미터로 측정하였다.

서론

알러지성 접촉성 피부염(ACD)은 합텐(haptens)이라고 불리는 저분자량 화학물질에 노출되어 발생하는 IV형 과민반응으로 인한 선진국에서 흔히 나타나는 피부 염증성 질환이다. 인간에서 접촉 감작을 일으키는 물질에는 화장품에 존재하는 중금속 이온 (크롬, 니켈, 철, 코발트), 테레빈 유, 향료, 염료 및 방부제 (예 : 파라페닐렌디아민), 일부 약물 (예 : 네오 마이신, 벤조카인), β-락탐 항생제 (즉, 페니실린), 식물에 의해 생성 된 화학 물질 (펜타 데카카테콜, 옻 아이비에 존재하는 물질) 및 사진 산업에서 사용되는 하이드로 퀴논 1,2 . ACD 병인학은 산업에서만 100,000 개 이상의 화학 물질이 사용되고 매년 2,000 개의 새로운 화학 물질이 합성되므로 매우 높습니다. 현재까지 접촉 합텐 / 알레르겐 일 수있는 3,700 개 이상의 분자가 확인되었습니다3. 접촉 과민 반응 (CHS)은 마우스, 기니아 피그 및 래트에서 연구 할 수있는 ACD의 실험 모델이며 유기 용매 4,5,6에 용해 된 반응성 화학 합텐의 국소 피부 적용에 의해 유도 될 수 있습니다. 이 연구는 다양한 테스트로 측정하고 정량화 할 수있는 마우스의 CHS 반응을 연구하는 데 도움이되는 객관적인 실험실 방법을 설명하는 것을 목표로합니다.

CHS는 감작(유도) 및 이펙터(챌린지) 단계로 구성됩니다. 동물 모델에서 합텐은 먼저 신체의 단백질에 공유적으로 결합하여 신 항원을 만듭니다. 감작 단계 동안, 활성화된 각질세포는 전염증성 사이토카인-종양 괴사 인자 α(TNF-α) 및 인터루킨 1β(IL-1β)7을 생성함으로써 피부 수지상 세포(sDCs)의 이동 및 성숙을 촉진한다. 표피 랑게르한스 세포 (LCs)는 CHS 유도 및 이펙터 단계8 동안 항원을 존재한다. 감작 동안 합텐에 노출된 LCs는 조절 및 이펙터 세포 둘 다의 유도를 촉진한다(9). 여러 연구로부터의 증가하는 증거는 CHS 반응이 CD4+ MHC 클래스 II 제한 Th1 세포 중 어느 하나에 의해 매개될 수 있고, 특징적인 염증 침윤물을 채용하기 위해 인터페론 γ(IFN-γ)을 국부적으로 방출할 수 있고, IFN-γ을 방출할 수 있지만 대부분 각질세포에 대한 세포독성 손상을 매개할 수 있는 CD8+ MHC 클래스 I-제한 Tc1 림프구, 그리고 현재 또한 인터루킨 17(IL-17)-생산 Th17 세포(10), 11.

다양한 종 12,13,14 및 합텐을 채용하는 몇몇 상이한 CHS 모델이 개발되었다 (상이한 합텐, 용매 및 적용 시간의 상세한 비교는 표 1에 요약된다). 자주 사용되는 실험실 종 인 마우스는 CHS를 연구 할 때 몇 가지 이점을 제공합니다. 다른 종에 비해 마우스들 사이에서 더 많은 균주, 녹아웃 (KO) 및 트랜스제닉 동물이 있으며, 이는 이들을 매우 매력적인 동물로 만든다15. 또한, CHS 모델은 많은 동물을 필요로하며, 마우스는 여기에서 더 경제적입니다. 동물 모델은 모든 측면에서 ACD를 모방하지 않으며; 특히, 그들은 인간에게 흔하지 않은 딱딱함과 절망을 보여줍니다16,17. 만성 질환의 특징은 주로 기술된 모델이 장기간 동안 합텐의 적용을 가정하지 않기 때문에 재현하기가 어렵다. 그러나, ACD의 많은 중요한 측면들이 재현된다는 것이 여기에서 확인되었다. 또한 인간과 마찬가지로 이러한 특징은 국소 알레르기 반응과 관련이 있음이 밝혀졌습니다. 이 프로토콜에 설명 된 합텐, 용매 및 그 적용의 선택은 결과가 수많은 시험관 내 테스트에 의해 확인되었으며 현재 버전이 확립 될 때까지 수년 동안 실험실에서 테스트되고 수정되었다는 사실에 의해 결정되었습니다. 뮤린 모델은 ACD의 발달에 관여하는 세포 서브셋 또는 사이토카인의 분석을 허용하며 새로운 치료법의 전임상 평가에 필수적이다.

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프로토콜

이 기사에 제시된 모든 실험은 크라쿠프의 동물 실험에 관한 제 1 차 지역 윤리위원회의 지침에 따라 수행되었습니다. 설명 된 모든 절차는 특히 케타민 / 자일라진을 마취제로 사용하고, 귀의 양쪽을 사용하여 물질 / 합텐을 적용하고, 귀를 자르고, 안구 제거로 혈액을 수집하는 것과 관련하여 현지 권장 사항에 따라 수행되었습니다. BALB/c (일배체형 H-2d), CBA/J (H-2k) 및 C57BL/6 (H-2b) 6-12주령의 수컷 및 암컷 마우스를 본 연구에 사용하였다 ( 물질의 표 참조). 통계적 중요성을 위해, 마우스의 각 그룹이 10-12 마리의 동물로 구성된 것이 가장 좋습니다.

1. 동물 준비

  1. 모든 절차 전후에 70 % 에탄올 용액으로 수술대를 청소하십시오. 멸균 조건이 필요한 마우스를 사용하는 경우 생물 안전 캐비닛에서 모든 작업을 수행하십시오.

2. 식별을 위해 마우스 표시

  1. 면도날로 피부를 면도하여 마우스에 라벨을 붙입니다 : # 0 - 표시가없는, # 2 - 오른쪽 앞발, # 3 - 오른쪽, # 4 - 오른쪽 뒷발, # 5 - 꼬리 밑, # 6 - 왼쪽 뒷발, # 7 - 왼쪽, # 8 - 왼쪽 앞발에.
    참고 : 유도 된 반응으로 인해 마우스는 귀 펀칭이나 태깅으로 고전적으로 표시 할 수 없습니다. 마우스를 라벨링하는 동안 마취시키지 않았다.

3. CHS의 유도

참고: 이 절차는 그림 1에 나와 있습니다.

  1. 아래 단계에 따라 감작(유도)을 수행한다.
    1. "0"일째에 회색 비누를 물로 바르고 면도날로 면도하여 가슴과 복부 (정사각형 2cm x 2cm)에 마우스를 면도하십시오.
      참고 : 합텐을 바르기 전에 피부가 자극받지 않도록 6 시간 동안 기다리십시오.
    2. 5% 합텐을 준비하십시오: 2,4,6-트리니트로클로로벤젠(TNCB, 표 참조) 을 아세톤-에탄올 혼합물(비율 1:3) 또는 비히클 단독(아세톤-에탄올)에 넣는다. 유리 바이알에 사용하기 직전에 용액을 준비하고 알루미늄 호일로 바이알을 덮어 빛으로부터 보호하십시오.
    3. 같은 날에, 이전에 면도된 지점에 5% 합텐의 150 μL를 적용하여 마우스를 감작시킨다. 대조군 마우스의 그룹에서, 비히클 단독을 적용하여 비특이적 염증 반응을 평가한다. 동물을 새장에 다시 넣기 전에 30 초 동안 기다렸다가 합텐을 말리십시오.
      주의: 장갑을 사용하십시오. TNCB는 대부분의 사람들에게 심각한 알레르기 반응을 일으 킵니다.
  2. 유도 (도전) 및 귀 붓기 측정을 수행하십시오.
    1. "4"일째에, 아세톤-에탄올 혼합물에서 TNCB를 0.4% 합텐:준비한다(비율 1:1). 유리 바이알에 사용하기 직전에 용액을 준비하고 알루미늄 호일로 바이알을 덮어 빛으로부터 보호하십시오.
    2. 깊은 마취를 위해 케타민 (90-120 mg / kg)과 자일라진 (5-10 mg / kg) ( 재료 표 참조)의 혼합물을 복강 내 (i.p.) 주사로 마우스를 마취하십시오. 마우스가 발가락 꼬집음으로 적어도 5 분 동안 완전히 마취되었는지 확인하십시오.
    3. 귀 두께(0시간 측정, 기준선)를 마이크로미터( 자료표 참조)로 실험군을 알지 못하는 관찰자에 의해 측정하였다.
    4. 10 μL의 0.4 % 합텐을 양쪽 그룹 (시험 및 대조군)의 귀 양쪽에 바르십시오. 동물을 새장에 다시 넣기 전에 30 초 동안 기다렸다가 합텐이 마르게하십시오.
    5. 합텐 적용 후 24시간 후인 "5"일째에, 24시간 측정에 대해 3.2.2-3.2.3단계를 반복한다.
    6. 합텐을 사용한 챌린지 전후의 귀 두께의 차이를 계산하여 CHS 반응을 평가한다: 24시간 귀 두께(μm) - 0시간 귀 두께(μm). 각 귀를 별도의 측정으로 계산하십시오. 다음으로, 귀 팽윤을 마이크로미터(μm)로 표현± 표준오차(SEM)의 평균(SEM)이다(표 2, 도 3).

4. 귀 생검

  1. 귀 두께의 24 시간 측정 직후 (마우스가 여전히 깊은 마취 상태에있을 때), 가위로 가능한 한 두개골에 가까운 귀를 잘라냅니다. 생검 펀치를 사용하여 직경 6 mm 펀치를 만들어 귀의 원위 측으로부터 생검을 수집 하십시오 (재료 표 참조).
    1. 귀 무게를 측정하고(단계 4.2) 동일한 귀 생검에 대해 다음 시험 중 하나를 추가로 수행한다: 골수퍼옥시다제 (MPO) 검정 (단계 4.3) 또는 귀 추출물 중의 사이토카인 농도의 시험관내 측정 (예를 들어, IFN-γ, IL-17A, TNF-α [단계 4.4]).
      참고 : 혈액 수집 전에 귀를 자르십시오. 이 절차 후, 마우스는 안락사되어야합니다 (예를 들어, 자궁 경부 탈구에 의해).
  2. 분석 저울에서 각 귀 생검의 무게를 측정하고 밀리그램 (mg)으로 표현하십시오 (그림 4).
  3. 아래 단계에 따라 MPO 분석을 수행합니다.
    1. 50 mmol 인산화 완충액 KH2PO4/Na2HPO4에 0.5% 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드를용해시키고 pH를 6.0으로 조정하여 균질화 완충액을 준비한다(상온, RT에서 사용).
    2. 500 μL의 준비된 완충액이 있는 2 mL 마이크로원심분리 튜브에서 생검을 10분 동안 균질화하고, 직경 5 mm 스테인레스 스틸 비드(두 개의 비드/바이알 추가)를 갖는 호모게나이저를 사용하여 10분 동안 균질화한다( 물자 표 참조). 다음에, 샘플을 4°C에서 15분 동안 냉각시키고, 추가의 10분 동안 균질화시킨다.
      참고: 마이크로 원심분리 튜브는 둥근 바닥을 가지므로 비드가 쉽게 움직일 수 있습니다.
    3. 균질액을 -20°C에서 30분 동안 동결시킨다. 해동 및 와류 (샘플이 해동되었는지 확인하십시오). 이 절차를 3x 반복합니다.
    4. 균질액을 4°C에서 30분 동안 3,000 x g 에서 원심분리한다. 피펫으로 상층액을 수확하십시오. MPO 활성을 단백질 1 mg 당 단위 (U)로 표현하십시오.
      참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 샘플은 -20°C에서 3개월 동안 안정하다.
    5. MPO 활성을 측정하기 위해, 20 μL의 상청액과 200 μL의 MPO 기질 (KH2PO4/Na2HPO4완충액의 50 mmol 중 오르토-디아니신 디하이드로클로라이드 0.167 mg/mL와 5 x 10-4%H202)을 혼합하여 효소 반응을 수행하고 96-웰 평판 플레이트에 첨가한다. 플레이트를 RT에서 20분 동안 인큐베이션한다.
    6. 200 μL의 MPO 기질에서 0.008 U에서 0.5 U까지의 농도에서 20 μL의 MPO 표준을 사용하여 표준 곡선을 제조하였다. MPO 기질 단독으로, 블랭크 샘플을 준비한다.
      주의: 오르토-디아니신 디하이드로클로라이드로 작업하는 동안 마스크를 사용하십시오.
      참고 : 플레이트는 단백질 또는 DNA가 결합하지 않도록 결합 능력이 낮은 폴리프로필렌으로 만들어야합니다.
    7. λ = 460 nm의 파장에서 광학 밀도 (OD)를 측정한다. 효소 반응은 10분 동안 안정하다. 표준 곡선에서 테스트된 샘플에서 MPO 활성을 판독합니다.
    8. 단백질 농도를 측정하기 위해, 상청액 20 μL를 사용하고, 단백질 결정을 위한 비친코닌산 키트로 시험을 수행하고( 표 물질 참조), λ = 562 nm에서 OD를 측정하였다(도 5).
  4. 귀 추출물에서 사이토카인의 시험관내 측정을 수행한다.
    1. 500 μL의 조직 단백질 추출 시약 (T-PER)이있는 2 mL 마이크로 원심분리 튜브에서 RT에서 귀 생검을 10 분 동안 5mm 직경의 스테인레스 스틸 비드가있는 균질 기(두 개의 비드 / 바이알 추가)를 사용하여 균질화하십시오. 다음에, 샘플을 4°C에서 15분 동안 냉각시키고, 추가의 10분 동안 균질화시킨다.
      참고: 마이크로 원심분리 튜브는 둥근 바닥을 가지므로 비드가 쉽게 움직일 수 있습니다.
    2. 균질액을 4°C에서 30분 동안 3,000 x g 에서 원심분리한다.
      참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 샘플은 -80°C에서 6개월 동안 안정하다.
    3. 제조자의 지시에 따라 상업적으로 이용가능한 ELISA 세트(예를 들어, IFN-γ)( 물질의 표 참조)를 사용하여 사이토카인 수준을 평가한다(도 6).

5. 귀 조직의 조직학

  1. 귀 두께의 24 시간 측정 직후, 마우스가 여전히 깊게 마취되었을 때, 가위로 가능한 한 두개골에 가까운 귀를 잘라냅니다 (단계 4.1).
    참고 :이 절차 후, 마우스는 안락사되어야합니다 (예 : 자궁 경부 탈구에 의해).
  2. 아래 단계에 따라 조직 블록의 파라핀 포매를 수행하십시오.
    1. 제거 직후 귀를 10 % 포르말린 ~ 10mL에 넣고 24 시간 동안 놓습니다.
    2. 귀를 조직 처리 카세트에 넣으십시오. 카세트를 탈수 사이클(RT에서 각각 알코올 70%, 90%, 100%, 30분), 클리어링 사이클(자일렌 3x, RT에서 각각 30분) 및 왁스 침윤 사이클(파라핀 3x, 56°C에서 각각 30분)을 위해 자동화된 프로세서( 자료 표 참조)에 넣는다.
    3. 자동 프로세서에서 카세트를 분리하고 필요할 때까지 워밍 플레이트를 잡으십시오. 왁스 몰드를 따뜻한 왁스 (디스펜서에서)로 채 웁니다.
    4. 따뜻한 포셉으로 카세트에서 섹션을 제거하고 몰드에 넣으십시오. 다음으로, 카세트베이스를 몰드 상단에 놓은 다음 더 많은 왁스로 채 웁니다. 차가운 접시에 차가운 물에 30 분 동안 놓아 파라핀이 응고되어 시편을 포함하는 블록을 형성하십시오.
    5. 회전식 마이크로톰( 재료 표 참조)을 사용하여 절편을 ~5 μm 두께로 절단한다. 따뜻한 욕조에 섹션을 띄워 평평하게하십시오. 섹션을 유리 현미경 슬라이드에 집어 넣습니다. RT에서 건조시켜 섹션이 슬라이드에 부착되도록 하십시오.
      참고: 염색 중 조직 절편의 손실을 방지하기 위해 접착 물질이나 단백질 코팅을 적용할 필요가 없는 슬라이드를 사용하십시오.
  3. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 수행한다.
    1. 자일렌 (네 가지 접시), 100 % 에탄올 (절대 알코올) (네 가지 접시), 90 % 에탄올, 80 % 에탄올, 70 % 에탄올, 50 % 에탄올, PBS (세 가지 요리), 헤마톡실린 용액, 에오신 용액으로 17 가지 염색 접시를 준비하십시오. 아래 단계에 따라 슬라이드를 한 접시에서 다음 접시로 옮기고 RT에서 모두 수행하십시오.
      참고 : 각 접시의 절차는 약 10x 반복 될 수 있습니다 (예 : 20 슬라이드 접시를 사용하는 경우 유체를 변경하지 않고 200 개의 얼룩을 만들 수 있음).
    2. 절편을 인큐베이터에서 30분 동안 65°C에서 인큐베이션함으로써 분리시킨다. 슬라이드를 자일렌에 30분 동안 담그십시오. 새로운 자일렌에서 1x를 30 분 동안 반복하십시오.
    3. 슬라이드를 100% 에탄올에 5분 동안 담그십시오. 새로운 100% 에탄올에서 1x를 5분 동안 반복한다. 슬라이드를 에탄올 행, 90%, 80%, 70%, 및 50%에 담그고, 각각의 희석액에 2분 동안 침지시킨다.
    4. 슬라이드를 5분 동안 포스페이트 완충 식염수(PBS)에 침지시킨다. 조직 주위와 슬라이드 뒷면에서 과도한 액체를 닦아냅니다.
    5. 헤마톡실린 용액 ( 재료 표 참조)에서 섹션을 7-8 분 동안 얼룩지게하십시오. 단면이 손상되지 않도록 뒷면에서 30 초 동안 흐르는 물에 씻으십시오. 5.3.4단계를 반복합니다.
    6. 30 초 동안 eosin 용액 ( 재료 표 참조)으로 섹션을 얼룩지게하십시오. 단계 5.3.5에서 언급된 바와 같이 세척한 다음, 단계 5.3.4를 반복한다.
    7. 슬라이드를 100% 에탄올(절대 알코올)에 2분 동안 담그십시오. 2 분 동안 새로운 100 % 에탄올에서 1x를 반복하십시오.
    8. 슬라이드를 자일렌에 5분 동안 담그십시오. 5 분 동안 새로운 자일렌에서 1x를 반복하십시오.
    9. 섹션을 RT에서 15분 동안 공기 건조시킵니다. 커버슬립에 장착 매체 한 방울( 재료 표 참조)을 넣은 다음 섹션 상단에 놓습니다.
  4. 광학 현미경으로 단면을 20x 또는 40x 배율로 검사하고 이미지를 캡처합니다(그림 7).

6. 혈관 투과성 시험

참고 : 귀 두께 측정을 번갈아 가며 혈관 투과성 검사를 수행 할 수 있습니다.

  1. "0"일째에 마우스를 감작시키고(단계 3.1.1-3.1.3), 이어서, "4"일째에, 마우스를 마취시키고(단계 3.2.2), 귀에 합텐을 직접 도포하고(단계 3.2.4), 0시간 귀 측정을 생략한다.
  2. 도전 후 23h에서, 마우스를 마취시킨다(단계 3.2.2).
  3. 둘베코 인산완충식염수(DPBS)에 1% 에반스 블루 염료( 물질 표 참조)의 8.3μL/g 체중을 정맥내(i.v.) 주사한다.
  4. 마우스를 다시 마취-심부 마취(단계 3.2.2)-1 h 후 에반스 블루 주사한다.
  5. 귀 생검을 수집합니다 (단계 4.1).
    참고 :이 절차 후, 마우스는 안락사되어야합니다 (예 : 자궁 경부 탈구에 의해).
  6. 조직으로부터 염료를 추출하고, 귀 펀치를 포름아미드 1 mL를 함유하는 튜브에 넣고, 5%CO2 의 분위기 중에서 37°C에서 18시간 동안 인큐베이션한다.
  7. 생검을 RT에서 3분 동안 3,000 x g 에서 원심분리한다.
  8. 포름아미드를 함유하는 블랭크에 대하여 96-웰 평판 바닥 플레이트에서 λ=565 nm의 파장에서 OD를 측정한다. 색상은 24 시간 동안 안정적입니다. 표준 곡선에서 테스트 샘플의 농도를 판독합니다(0.2-30 μg의 염료/mL 포름아미드 범위의 에반스 블루의 농도 사용).
    참고 : 플레이트는 단백질 또는 DNA가 결합하지 않도록 결합 능력이 낮은 폴리프로필렌으로 만들어야합니다.

7. 혈청 수집 및 항-TNP 면역글로불린(IgG1) 항체 측정

  1. 귀 생검을 수집한 후(단계 4.1), 마우스가 여전히 깊은 마취 상태일 때, 핀셋으로 안구를 제거하고, 마우스에 완만한 압력을 가하고, 역궤도 부비동으로부터 혈액을 튜브 내로 수집한다(혈청을 얻기 위한 겔이 있는 바이알, 표 참조). 혈액을 수집하는 또 다른 방법은 주사기로 심장을 뚫고 혈액을 수집하는 것일 수 있습니다.
    참고 : 혈액은 귀를 제거한 후에 수집해야합니다. 동일한 출혈 방법은 혈액 매개 변수18의 잠재적 차이로 인해 전체 연구에서 사용되어야합니다. 이 절차 후, 마우스는 안락사되어야 한다 (예를 들어, 자궁경부 탈구에 의해).
  2. 최소 6x를 반전시키고 혈액이 응고될 때까지 30분 정도 기다린 다음 RT에서 10분 동안 1,300-2,000 x g 에서 원심분리한다.
    참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 샘플은 6개월 동안 -20°C에서 안정하다.
  3. 96웰 플랫 바닥 플레이트를 10μg/mL의 협동으로 DPBS에 용해된 2,4,6-트리니트로페닐(TNP-BSA)과 컨쥬게이션된 50μL의 소 혈청 알부민으로 코팅한다. 다음으로, 두 번째 플레이트를 10 μg/mL의 농도로 DPBS (배경)에 용해된 소 혈청 알부민 (BSA) 단독으로 코팅한다. 4°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
    참고 : 마우스 혈청에는 BSA에 대한 항체 (Abs)가 포함되어 있으므로 두 플레이트 모두에서 샘플을 테스트해야하며 다음으로 계산을 수행해야합니다 (OD TNP-BSA - OD BSA).
  4. 플레이트를 0.05% 트윈 20을 함유하는 DPBS 300 μL로 세척한다. 3x를 반복하십시오.
  5. 분석 희석제 (AD) 준비 : 1 % BSA를 함유하는 DPBS. RT에서 1시간 동안 AD로 웰을 차단하고 다시 세척한다(단계 7.4).
  6. 내부 표준물질 (iSTD)을 준비한다: 마우스를 TNCB로 감작시키고(단계 3.1.1-3.1.3), 감작 10일 후, 모든 공여자로부터 혈청을 수집하고 폴링한다(단계 7.1 및 단계 7.2).
  7. 표준 곡선을 만들기 위해 AD로 희석된 iSTD의 등급화된 농도 50 μL를 플레이트에 첨가한다 ( 표 3에 기재됨). 50 μL의 혈청 샘플을 플레이트에 첨가한다. 두 플레이트 모두에서 각 샘플과 표준 곡선을 테스트하십시오 (TNP-BSA 및 BSA 코팅). RT. 플레이트를 세척하여 RT. 2시간 동안 인큐베이션한다(단계 7.4).
  8. AD로 1:250으로 희석된 50 μL의 비오티닐화 항-마우스 IgG1 모노클로날 항체 (mAb, 표 표 참조)를 첨가하고, RT. 세척에서 1시간 동안 인큐베이션한다 (단계 7.4).
  9. AD로 1:2000으로 희석된 양고추냉이 퍼옥시다제 스트렙타비딘 (HRD 스트렙타비딘, 물질표 참조) 50 μL를 첨가하고, 어둠 속에서 RT에서 30분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 세척한다(단계 7.4).
  10. 50 μL의 TMB 기질 ( 물질 표 참조)을 첨가하고, 어둠 속에서 RT에서 30분 동안 인큐베이션한다.
  11. 25 μL의 1MH2SO4를 첨가하여 효소 반응을 정지시키고; 반응은 30분 동안 안정하다.
  12. λ = 450nm의 파장과 570nm의 배경에서 OD를 측정합니다 (배경은 450nm 측정마다 빼야합니다). 결과를 제시할 때 샘플 및 표준 곡선에 대한 TNP-BSA에서 BSA 측정값을 뺍니다. 이어서, 표준 곡선에 따라 항체의 단위 (U)를 계산한다 (도 9).

8. CHS 이펙터 세포의 채택 전달

참고: 이 절차는 그림 2에 나와 있습니다.

  1. 기증자 (1 기증자 : 1 수혜자의 비율) : "0"일에 TNCB로 마우스를 감작시킵니다 (단계 3.1.1-3.1.3).
  2. "4"일째에, 마우스-심부 마취를 마취한다(단계 3.2.2).
  3. 겨드랑이 및 사타구니 림프절 (ALN)과 비장 (SPL)을 포셉으로 분리하십시오. ALN을 한 바이알에 모으고 다른 바이알에는 SPL을 함께 모으십시오.
    참고 : 각 겨드랑이의 가슴 근육 뒤에는 겨드랑이 림프절이 하나 있습니다. 엉덩이 부위의 한 사타구니 림프절은 세 개의 혈관 옆에 있습니다. 비장은 창자와 위 뒤의 몸의 왼쪽에 있습니다19. 생물 안전 캐비닛에서 멸균 도구를 사용하여 멸균 상태를 유지하십시오. 이 절차 후, 마우스는 안락사되어야합니다 (예를 들어, 자궁 경부 탈구에 의해).
  4. 두 현미경 슬라이드의 서리가 내린 끝 사이의 매쉬 조직. 세포 현탁액을 기공 크기가 70 μm인 세포 스트레이너를 통해 통과 시킨다(물자 표 참조).
  5. 세포를 1% 소 태아 혈청(FBS)으로 보충된 DPBS로 세척하십시오. 4°C에서 10분 동안 300 x g 에서 원심분리한다. 상청액을 데칸트하고, 나머지 세포 펠릿을 DPBS 1-5.0 mL에 재현탁시킨다.
  6. 혈구측정기20 을 사용하여 살아있는 세포를 트리판 블루와 함께 계수하고, 10 μL의 세포 현탁액을 트리판 블루의 90-990 μL (세포 수에 따라 다름)와 혼합한다. 세포 번호 (10x-100x)를 계산할 때 희석을 고려하십시오.
  7. ALNs 및 SPL (비율 1:1)의 혼합물을 제조하였다: 8.0 x 106 내지 7.0 x 107/마우스 200 μL의 DPBS에서.
  8. 수용자 (naïve syngeneic mice): 나이브 수용자 마우스를 마취하고(단계 3.2.2) CHS-이펙터 세포의 혼합물과 함께 i.v.를 주입한다(단계 8.7). 마우스의 대조군에는 어떤 세포도 주입하지 마십시오.
  9. 챌린지 전(0시간) 및 후(24h)의 귀 두께를 측정합니다(단계 3.2.1-3.2.6).
  10. 추가적으로, 단리된 CHS-이펙터 세포에 대한 시험을 수행한다 (예를 들어, 세포 표현형 또는 유세포 분석기에 의한 CHS-이펙터 세포에 의한 생산된 사이토카인의 측정). 세포 배양은 또한 확립될 수 있고, 항원의 존재 하에 증식하는 CHS-이펙터 세포의 능력 또는 배양 상청액에서 분비된 사이토카인의 양은21,22 (데이터 제시되지 않음)로 평가될 수 있다.
    참고 : 추가 검사를 수행하려면 그에 따라 더 많은 세포 기증자가 필요합니다.

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결과

CHS 유도를 위해, 동물을 150 μL의 5% TNCB 또는 비히클 단독의 가짜 감작으로 피부 페인팅(복부)을 통해 감작시켰다. "4"일째에, 양쪽 귀의 귀 부종 반응은 이전에 TNCB로 감작된 마우스(시험 그룹) 및 대조군 마우스(가짜 감작)에서 0.4% TNCB의 10 μL와 접촉페인팅(challenge)에 의해 유도되었다. 제시된 데이터는 TNCB로 감작되고 도전 4일 후에 샴페인팅된 마우스가 유사하게 도전된 샴-감작된 것들과 비교하여 유의하게 증가된 귀 부종을 발달시켰다는 것을 묘사한다(도 3, 표 2, 시험 대 대조군). 귀 부종 결과는 추가 연구에서 완전히 검증되었으며, 귀 무게 증가에 동의한 마이크로미터로 결정된 귀 부종의 증가(그림 4), MPO 활성(그림 5), 귀 추출물의 IFN-γ 농도(그림 6), 조직...

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토론

CHS는 합텐을 통해 유도되며, 이는 피부의 자체 단백질 항원에 결합하여 신 항원을 생성합니다. CHS는 순환 항원 특이적 CHS-이펙터 T 세포의 국소 혈관외 모집에 의해 매개되며, 이는 도전된 조직에서 팽윤을 초래하고, 동일한 합텐6에 이차 피부의 노출 후 24 h를 피크로 한다. 조직의 팽윤은 주로 백혈구 및 백혈구 의존성 피브린 침착(24)의 침윤에 의해 야기된다. 이러한 변화는 마이크로미터로 감지할 수 있으며, 얕텐 감작 및 도전 마우스와 가짜 감작 및 도전 마우스의 귀 붓기를 측정할 수 있습니다.

CHS는 또한 귀 무게의 비교에 의해 결정될 수 있다. 그런 다음, 귀 중량 결정에 사용되는 귀 펀치가 추가 테스트에 사용될 수 있습니다. 염증이있는 귀에 침윤 된 세포는 사이토 카인 생성 T 림프구와 MPO 양성 호중구로 구성됩니다. 귀 조직 균질액에서, 다양한 파라미터, ...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 서브벤션 SUBZ에 의해 뒷받침되었다. 폴란드 브로츠와프에있는 의과 대학의 A020.22.060 및 과학 고등 교육부 N N401 545940에서 MS 및 IP2012 0443 72에 대한 보조금으로 MMS에.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
70% 에탄올Merck KGaA, 다름슈타트, 독일65350-M표면 소독용
96-웰 플랫 바닥 플레이트, 폴리프로필렌Greiner Bio-One GmbH, 크렘스뮌스터, 오스트리아MPO및 Evans 파란색 측정 655101 - 플레이트는 결합 용량이 낮은 폴리프로필렌으로 만들어져야 하므로 단백질이나 DNA가
아세톤(ACS 시약, ≥ 99.5%)Merck KGaA, 다름슈타트, 독일179124
알루미늄 호일Merck KGaA, 다름슈타트, 독일Z185140
분석 저울Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, GermanyPRACTUM224-1S, 29105177
AutomatedTissue Processor MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, IndiaMTP-E-212파라핀
BD Vacutainer SST II Advance (혈청 채취를 위한 젤이 있는 튜브)Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USABD
단백질 측정을 위한 Bicinchoninic acid kitMerck KGaA, Darmstadt, GermanyBCA1-1KT
비오틴 쥐 안티 마우스 IgG1Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA553441
BSA (소 혈청 알부민)Merck KGaA, 다름슈타트, 독일A9418단백질 분석 및 분석, 2 mg / mL
세포 여과기, 공극 크기 70 μ mBIOLOGIX, 중국15-107050 mL 튜브에 적합
CoverslipVWR, Radnor, Pennsylvania, United States631-158324 mm, 그러나 다른 크기의
일회용 피펫 사용 가능 용량 : 5 mL, 10 mL, 25 mLMerck KGaA, Darmstadt, GermanyZ740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco & prime; s 인산염 완충 식염수)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA14190144칼슘 없음, 마그네슘 없음, 포유류 세포 배양
DPX Mountant for histologyMerck KGaA, Darmstadt, Germany6522H-E용 마운팅 미디어, 다른 용도로도 사용할 수 있습니다. 예를 들어, Canada balsam
Dumont 5 tweezers - straightAnimalab, Poznan, Poland11251-10FST마우스 시술을 위한 수술 기구(멸균되어야 함)
Dumont 7 핀셋 - 구부러짐Animalab, 포즈난, 폴란드11272-50FST마우스 시술용 수술 기구(멸균해야 함)
Eosin Y solution, alcoholicMerck KGaA, 다름슈타트, 독일HT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mLEppenforf, 독일3,01,20,086폴리프로필렌
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mLEppenforf, 독일3,01,20,094폴리프로필렌, 둥근 바닥(균질화 비드가 쉽게 움직일 수 있음)
에탄올 100%(절대 알코홀)Merck KGaA, 다름슈타트, 독일1.07017
에탄올 96%Merck KGaA, 다름슈타트, 독일1.59010
Evans blueMerck KGaA, 다름슈타트, 독일E2129
FBS(소 태아 혈청)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA
포르말린 용액, 중성 완충, 10%Merck KGaA, 다름슈타트, 독일HT501128
포름아미드 99.5% (GC)Merck KGaA, 다름슈타트, 독일F7503
냉동고 -20 ° CBosch, 독일GSN54AW30
냉장고 +4 ° C / 냉동고 -20 ° CBosch, 독일KGV36V10포유류 세포 배양, 인증, 브라질, 10 x 50 mL
Glass microskope slides, SuperFrost PlusVWR, Radnor, Pennsylvania, United States631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449염색 중 조직 단면 손실을 방지하기 위해 접착 재료나 단백질 코팅을 적용할 필요가 없는 슬라이드.
그래프 패드 프리즘GraphPad Software Inc.v. 9.4.0
회색 비누Pollena Ostrzeszó w, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., 폴란드Bialy jelen 비누 바회색 비누 바 천연 저자 극성. 일반적으로 사용 가능한 제품
H2SO4(황산) 1 mol/l (1 M)Merck KGaA, 다름슈타트, 독일1.60313
Harris hematoxylin 용액Merck KGaA, 다름슈타트, 독일HHS16
혈구계VWR, Avantor, US A612-5719수동 계수 챔버를 권장하며 더 정확
합니다.Hexadecyltrimethylammonium bromideMerck KGaA, 다름슈타트, 독일H5882
균질화 기QIAGEN Hilden, GermanyTissue Lyser LT, SN 23.1001/052342mL 원심 분리기 튜브 용 스테인리스 스틸 비드 (직경 5mm)가있는 균질화 기
양 고추 냉이 과산화 효소 스트렙타비딘 (HRP 스트렙타비딘)Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USASA-5004-1
과산화수소 용액 (H202)Merck KGaA, 다름슈타트, 독일H1009
인큐베이터 Heracell 150iThermo Electron LED Gmbh, 독일4107106837 oC 5 % CO2 및 65 0C 조직학
케타민 100 mg/mL, 주입용 솔루션Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Polandcat.# 사용할 수
KH2PO4 (인산이수소칼륨) 99.995% 무수 기준Merck KGaA, 다름슈타트, 독일1.05108
실험실용 원심분리기Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, 독일B00013899속도 300 x g, 냉각 4 0C
실험실 원심 분리기Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, 독일75002425속도 3,000 x g, 4 0C
Mask (FFP2)VWR, Radnor, Pennsylvania, United States111-0917의 오르토 다이아니신 이염산염
마우스 육종 단위 작업, Krakow, PolandCBA/J, C57BL/6
마이크로미터Mitutoyo, Tokyo, Japan193-111digit 외부 마이크로미터, 래칫 스톱, 0-25mm 범위, 0.001mm 눈금, +/- 0.002mm 정확도, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
microplate, 96 well, microlon, 높은 결합력(ELISA 테스트용)Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria655061비색 분석에서 신뢰할 수 있고 재현성 있는 결과를 위한 maxi-sorp 결합 표면
물렌즈 현미경Leica Microsystems CMS GmbH, 독일DM1000, 294011-082007논문에 제시된 조직학은 ThermoFisher Scientific EVOS M5000 이미징 시스템에서 다음과 같은 목적으로 수행되었습니다: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD 및 FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard)MerckKGaA, Darmstadt, GermanyM6908
Na2HPO4 x 7 H2O (인산이염기성 소듐 이염기성 헵타하이드레이트)Merck KGaA, 독일 다름슈타트S9390
올리브 오일Merck KGaA, 독일 다름슈타트75343순수, 천연
OptEIA 마우스 IFN-&감마; ELISA SetBecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA555138
Ortho-dianisine dihydrochlorideMerck KGaA, 다름슈타트, 독일D3252
파라핀 왁스Merck KGaA, 다름슈타트, 독일76242비드, 왁스 고체
PBS (인산염 완충 식염수)ThermoFisher Scientific,  미국 매사추세츠주 월섬20012027pH 7.2, 포유류 세포 배양
pH 측정기Elmetron, 폴란드CP-401
피펫, 팁 포함 가변 용량Merck KGaA, 독일 다름슈타트EP3123000900-1EA3팩, 옵션 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, epT.I.P.S 포함
면도날VWR, Radnor, Pennsylvania, United StatesPERS94-0462스크레이퍼 및 커터 블레이드, 단일 모서리, 알루미늄 척추, 상자당 100개의 블레이드, 개별 포장
된 로터리 마이크로톰MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UKHIS-202A
가위 - 스트레이트, 샤프/샤프Animalab, 포즈난, 폴란드14060-10FST마우스 시술용 수술 기구(멸균해야 함)
스크류 캡 (오픈 탑)Merck KGaA, 다름슈타트, 독일27056블랙 폴리프로필렌 홀 캡, 22  20-400 스레드
분광 광도계BioTek Instruments, 미국 201446범용 마이크로플레이트 분광 광도계: λ 범위: 200 - 999 nm, 흡광도 측정 범위: 0.000 - 4.000 Abs
염색 접시 랙이 있는 슬라이드 20Merck KGaA, 다름슈타트, 독일S6141예: 커버, 슬라이드 랙 및 손잡이가 있는 20개의 슬라이드 염색 접시
멸균 일회용 생검 펀치 6mmIntegra LifeSciences, Princeton, NJ, USA33-36
외과용 가위Animalab, 포즈난, 폴란드52138-46생쥐 시술용 수술 기구(멸균해야 함)
조직 처리 카세트Merck KGaA, 다름슈타트, 독일Z672122뚜껑이 있는 조직 처리/임베딩 카세트
TMB 기질 시약 세트Becton Dickinson(BD Biosciences), 프랭클린 레이크스, NJ, 미국555214
TNCB (2,4,6-트리니트로클로로벤젠)Tokyo Chemical Industry CO., LTD, 일본C0307
TNP-BSA (2,4,6-트리니트로페닐과 접합된 소 혈청 알부민)Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USAT-5050
T-PER (tissue protein extration reagent)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA78510
튜브 15 mL sterileMerck KGaA, Darmstadt, GermanyCLS430055 (Corning)폴리프로필렌, 원뿔형 바닥
튜브 50 mL, sterileMerck KGaA, Darmstadt, GermanyCLS430290 (Corning)폴리프로필렌, 원뿔형 바닥
Tween 20Merck KGaA, Darmstadt, GermanyP1379
바이알, 나사 상단, 투명 유리(바이알만 해당) 22 mLMerck KGaA, Darmstadt, Germany27173hapten의 준비를 위해 증발하지 않도록 나사로 조임
수조AJL Electronic, PolandLW102
왁스(파라핀) 디스펜서VWR, Radnor, Pennsylvania, United States114-8737
주사용 자일라진(자일라판 20mg/mL) 용액Vetoquinol Biowet Sp. z oo., Gorzow Wielkopolski, Polandcat.# 사용할 수
크실렌(조직학적 등급)Merck KGaA, 다름슈타트, 독일534056
366882 A3160802없음 Jagiellonian University Medical College 의과 대학 의학부 의생명 과학 의장 직종 부서 대가 있는 mL 바이알 개 없음

참고문헌

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  35. Bouloc, A., Cavani, A., Katz, S. I. Contact hypersensitivity in MHC class II-deficient mice depends on CD8 T lymphocytes primed by immunostimulating Langerhans cells. The Journal of Investigative Dermatology. 111 (1), 44-49 (1998).
  36. Martin, S., et al. Peptide immunization indicates that CD8+ T cells are the dominant effector cells in trinitrophenyl-specific contact hypersensitivity. The Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 260-266 (2000).
  37. Vennegaard, M. T., et al. Epicutaneous exposure to nickel induces nickel allergy in mice via a MyD88-dependent and interleukin-1-dependent pathway. Contact Dermatitis. 71 (4), 224-232 (2014).

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정오


Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 1/19/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

to:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

Figure 1 of the Representative Results has been updated from:

Mouse ear thickness measurement experiment diagram; TNCB-induced dermatitis comparison.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mice sensitization process; diagram of control/test groups, TNCB application, ear thickness measurement.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2 of the Representative Results has been updated from:

CHS induction in mice using TNCB, diagram showing sensitization, i.v. cell transfer, ear measurement.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mouse sensitization and TNCB application diagram; CHS study setup with control and test groups.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

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