접촉 과민증 (CHS)은 알레르기 성 접촉 피부염 (ACD)의 뮤린 실험 모델입니다. CHS는 가슴과 복부의 면도 된 피부를 페인팅하여 반응성 합텐으로 감작을 기반으로하며, 희석 된 합텐으로 후속 귀 피부 챌린지를 통해 다양한 방법으로 평가되는 붓기 반응을 일으 킵니다.
이 논문에서
정오 공지
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요약
초록
접촉 과민증 (CHS)은 마우스에서 연구 할 수있는 알레르기 성 접촉 피부염 (ACD)의 실험 모델입니다. 이 연구는 다양한 테스트로 측정하고 정량화 할 수있는 마우스의 CHS 반응을 연구하는 데 도움이되는 객관적인 실험실 방법을 제시하는 것을 목표로합니다. CHS를 유도하기 위해, "0"일째에, 마우스는 아세톤-에탄올 혼합물 중의 합텐 2,4,6-트리니트로클로로벤젠(TNCB)으로 복 도장에 의해 이전에 면도된 반점에 감작시킨 반면, 음성 대조군 마우스는 비히클 단독-아세톤-에탄올 혼합물로 가짜 감작되었다. "4"일째에, 기준선 귀 두께를 CHS(챌린지)의 도출 전에 시험군 및 대조군 둘 다에서 희석된 TNCB로 양쪽 귀를 페인팅함으로써 마이크로미터로 측정하였다. 24시간 후, 귀 팽윤을 마이크로미터로 측정하였다. CHS는 염증이 있는 조직에서 팽윤을 일으키는 T 세포 매개 면역 반응의 예이며, 동일한 합텐으로 피부 챌린지 후 24시간 후에 최고조에 달한다. 귀 부종의 증가는 증강 된 귀 무게, 골수퍼옥시다제 (MPO) 활성, 귀 추출물의 전염증성 사이토카인 농도, 조직 학적 검사에서 부종 진피의 두꺼움 증가 및 귀 혈관 투과성과 관련이 있습니다. 또한 대조군 마우스와 비교했을 때 시험군의 혈청에서 TNP 특이적 IgG1 항체의 농도가 증가하였다. 추가적으로, CHS는 이전에 TNCB로 감작된 공여자로부터 수득된 CHS-이펙터 세포와 함께 성공적으로 전달될 수 있다. CHS-이펙터 세포를 순진한 수용자 마우스에 정맥내 투여하였고, 이는 후속적으로 동일한 희석된 합텐으로 도전되었다. 귀 부종은 24시간 후에 마이크로미터로 측정하였다.
서론
알러지성 접촉성 피부염(ACD)은 합텐(haptens)이라고 불리는 저분자량 화학물질에 노출되어 발생하는 IV형 과민반응으로 인한 선진국에서 흔히 나타나는 피부 염증성 질환이다. 인간에서 접촉 감작을 일으키는 물질에는 화장품에 존재하는 중금속 이온 (크롬, 니켈, 철, 코발트), 테레빈 유, 향료, 염료 및 방부제 (예 : 파라페닐렌디아민), 일부 약물 (예 : 네오 마이신, 벤조카인), β-락탐 항생제 (즉, 페니실린), 식물에 의해 생성 된 화학 물질 (펜타 데카카테콜, 옻 아이비에 존재하는 물질) 및 사진 산업에서 사용되는 하이드로 퀴논 1,2 . ACD 병인학은 산업에서만 100,000 개 이상의 화학 물질이 사용되고 매년 2,000 개의 새로운 화학 물질이 합성되므로 매우 높습니다. 현재까지 접촉 합텐 / 알레르겐 일 수있는 3,700 개 이상의 분자가 확인되었습니다3. 접촉 과민 반응 (CHS)은 마우스, 기니아 피그 및 래트에서 연구 할 수있는 ACD의 실험 모델이며 유기 용매 4,5,6
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프로토콜
이 기사에 제시된 모든 실험은 크라쿠프의 동물 실험에 관한 제 1 차 지역 윤리위원회의 지침에 따라 수행되었습니다. 설명 된 모든 절차는 특히 케타민 / 자일라진을 마취제로 사용하고, 귀의 양쪽을 사용하여 물질 / 합텐을 적용하고, 귀를 자르고, 안구 제거로 혈액을 수집하는 것과 관련하여 현지 권장 사항에 따라 수행되었습니다. BALB/c (일배체형 H-2d), CBA/J (H-2k) 및 C57BL/6 (H-2b) 6-12주령의 수컷 및 암컷 마우스를 본 연구에 사용하였다 ( 물질의 표 참조). 통계적 중요성을 위해, 마우스의 각 그룹이 10-12 마리의 동물로 구성된 것이 가장 좋습니다.
1. 동물 준비
- 모든 절차 전후에 70 % 에탄올 용액으로 수술대를 청소하십시오. 멸균 조건이 필요한 마우스를 사용하는 경우 생물 안전 캐비닛에서 모든 작업을 수행하십시오.
2. 식별을 위해 마우스 표시
- 면도날로 피부를 면도하여 마우스에 라벨을 붙입니다 : # 0 - 표시가없는, # 2 - 오른쪽 앞발, # 3 -....
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결과
CHS 유도를 위해, 동물을 150 μL의 5% TNCB 또는 비히클 단독의 가짜 감작으로 피부 페인팅(복부)을 통해 감작시켰다. "4"일째에, 양쪽 귀의 귀 부종 반응은 이전에 TNCB로 감작된 마우스(시험 그룹) 및 대조군 마우스(가짜 감작)에서 0.4% TNCB의 10 μL와 접촉페인팅(challenge)에 의해 유도되었다. 제시된 데이터는 TNCB로 감작되고 도전 4일 후에 샴페인팅된 마우스가 유사하게 도전된 샴-감작된 것들과 비교하여 유의하게 증가된 귀 부종을 발달시켰다는 것을 묘사한다(도 3, 표 2, 시험 대 대조군). 귀 부종 결과는 추가 연구에서 완전히 검증되었으며, 귀 무게 증가에 동의한 마이크로미터로 결정된 귀 부종의 증가(그림 4), MPO 활성(그림 5), 귀 추출물의 IFN-γ 농도(그림 6), 조직.......
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토론
CHS는 합텐을 통해 유도되며, 이는 피부의 자체 단백질 항원에 결합하여 신 항원을 생성합니다. CHS는 순환 항원 특이적 CHS-이펙터 T 세포의 국소 혈관외 모집에 의해 매개되며, 이는 도전된 조직에서 팽윤을 초래하고, 동일한 합텐6에 이차 피부의 노출 후 24 h를 피크로 한다. 조직의 팽윤은 주로 백혈구 및 백혈구 의존성 피브린 침착(24)의 침윤에 의해 야기된다. 이러한 변화는 마이크로미터로 감지할 수 있으며, 얕텐 감작 및 도전 마우스와 가짜 감작 및 도전 마우스의 귀 붓기를 측정할 수 있습니다.
CHS는 또한 귀 무게의 비교에 의해 결정될 수 있다. 그런 다음, 귀 중량 결정에 사용되는 귀 펀치가 추가 테스트에 사용될 수 있습니다. 염증이있는 귀에 침윤 된 세포는 사이토 카인 생성 T 림프구와 MPO 양성 호중구로 구성됩니다. 귀 조직 균질액에서, 다양한 파라미터, .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 서브벤션 SUBZ에 의해 뒷받침되었다. 폴란드 브로츠와프에있는 의과 대학의 A020.22.060 및 과학 고등 교육부 N N401 545940에서 MS 및 IP2012 0443 72에 대한 보조금으로 MMS에.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 70% 에탄올 | Merck KGaA, 다름슈타트, 독일 | 65350-M | 표면 소독용 |
| 96-웰 플랫 바닥 플레이트, 폴리프로필렌 | Greiner Bio-One GmbH, 크렘스뮌스터, 오스트리아 | MPO | 및 Evans 파란색 측정 655101 - 플레이트는 결합 용량이 낮은 폴리프로필렌으로 만들어져야 하므로 단백질이나 DNA가 |
| 아세톤(ACS 시약, ≥ 99.5%) | Merck KGaA, 다름슈타트, 독일 | 179124 | |
| 알루미늄 호일 | Merck KGaA, 다름슈타트, 독일 | Z185140 | |
| 분석 저울 | Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany | PRACTUM224-1S, 29105177 | |
| Automated | Tissue Processor MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India | MTP-E-212 | 파라핀 |
| BD Vacutainer SST II Advance (혈청 채취를 위한 젤이 있는 튜브) | Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA | BD | |
| 단백질 측정을 위한 Bicinchoninic acid kit | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | BCA1-1KT | |
| 비오틴 쥐 안티 마우스 IgG1 | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 553441 | |
| BSA (소 혈청 알부민) | Merck KGaA, 다름슈타트, 독일 | A9418 | 단백질 분석 및 분석, 2 mg / mL |
| 세포 여과기, 공극 크기 70 μ m | BIOLOGIX, 중국 | 15-1070 | 50 mL 튜브에 적합 |
| Coverslip | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 631-1583 | 24 mm, 그러나 다른 크기의 |
| 일회용 피펫 사용 가능 용량 : 5 mL, 10 mL, 25 mL | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | Z740301, Z740302, Z740303 | |
| DPBS (Dulbecco & prime; s 인산염 완충 식염수) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14190144 | 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 포유류 세포 배양 |
| DPX Mountant for histology | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 6522 | H-E용 마운팅 미디어, 다른 용도로도 사용할 수 있습니다. 예를 들어, Canada balsam |
| Dumont 5 tweezers - straight | Animalab, Poznan, Poland | 11251-10FST | 마우스 시술을 위한 수술 기구(멸균되어야 함) |
| Dumont 7 핀셋 - 구부러짐 | Animalab, 포즈난, 폴란드 | 11272-50FST | 마우스 시술용 수술 기구(멸균해야 함) |
| Eosin Y solution, alcoholic | Merck KGaA, 다름슈타트, 독일 | HT110116 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppenforf, 독일 | 3,01,20,086 | 폴리프로필렌 |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL | Eppenforf, 독일 | 3,01,20,094 | 폴리프로필렌, 둥근 바닥(균질화 비드가 쉽게 움직일 수 있음) |
| 에탄올 100%(절대 알코홀) | Merck KGaA, 다름슈타트, 독일 | 1.07017 | |
| 에탄올 96% | Merck KGaA, 다름슈타트, 독일 | 1.59010 | |
| Evans blue | Merck KGaA, 다름슈타트, 독일 | E2129 | |
| FBS(소 태아 혈청) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | ||
| 포르말린 용액, 중성 완충, 10% | Merck KGaA, 다름슈타트, 독일 | HT501128 | |
| 포름아미드 99.5% (GC) | Merck KGaA, 다름슈타트, 독일 | F7503 | |
| 냉동고 -20 ° C | Bosch, 독일 | GSN54AW30 | |
| 냉장고 +4 ° C / 냉동고 -20 ° C | Bosch, 독일 | KGV36V10 | 포유류 세포 배양, 인증, 브라질, 10 x 50 mL |
| Glass microskope slides, SuperFrost Plus | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449 | 염색 중 조직 단면 손실을 방지하기 위해 접착 재료나 단백질 코팅을 적용할 필요가 없는 슬라이드. |
| 그래프 패드 프리즘 | GraphPad Software Inc. | v. 9.4.0 | |
| 회색 비누 | Pollena Ostrzeszó w, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., 폴란드 | Bialy jelen 비누 바 | 회색 비누 바 천연 저자 극성. 일반적으로 사용 가능한 제품 |
| H2SO4(황산) 1 mol/l (1 M) | Merck KGaA, 다름슈타트, 독일 | 1.60313 | |
| Harris hematoxylin 용액 | Merck KGaA, 다름슈타트, 독일 | HHS16 | |
| 혈구계 | VWR, Avantor, US A | 612-5719 | 수동 계수 챔버를 권장하며 더 정확 |
| 합니다.Hexadecyltrimethylammonium bromide | Merck KGaA, 다름슈타트, 독일 | H5882 | |
| 균질화 기 | QIAGEN Hilden, Germany | Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234 | 2mL 원심 분리기 튜브 용 스테인리스 스틸 비드 (직경 5mm)가있는 균질화 기 |
| 양 고추 냉이 과산화 효소 스트렙타비딘 (HRP 스트렙타비딘) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA | SA-5004-1 | |
| 과산화수소 용액 (H202) | Merck KGaA, 다름슈타트, 독일 | H1009 | |
| 인큐베이터 Heracell 150i | Thermo Electron LED Gmbh, 독일 | 41071068 | 37 oC 5 % CO2 및 65 0C 조직학 |
| 케타민 100 mg/mL, 주입용 솔루션 | Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland | cat.# 사용할 수 | |
| KH2PO4 (인산이수소칼륨) 99.995% 무수 기준 | Merck KGaA, 다름슈타트, 독일 | 1.05108 | |
| 실험실용 원심분리기 | Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, 독일 | B00013899 | 속도 300 x g, 냉각 4 0C |
| 실험실 원심 분리기 | Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, 독일 | 75002425 | 속도 3,000 x g, 4 0C |
| Mask (FFP2) | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 111-0917 | 의 오르토 다이아니신 이염산염 |
| 마우스 육 | 종 단위 작업, Krakow, Poland | CBA/J, C57BL/6 | |
| 마이크로미터 | Mitutoyo, Tokyo, Japan | 193-111 | digit 외부 마이크로미터, 래칫 스톱, 0-25mm 범위, 0.001mm 눈금, +/- 0.002mm 정확도, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml |
| microplate, 96 well, microlon, 높은 결합력(ELISA 테스트용) | Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria | 655061 | 비색 분석에서 신뢰할 수 있고 재현성 있는 결과를 위한 maxi-sorp 결합 표면 |
| 물렌즈 현미경 | Leica Microsystems CMS GmbH, 독일 | DM1000, 294011-082007 | 논문에 제시된 조직학은 ThermoFisher Scientific EVOS M5000 이미징 시스템에서 다음과 같은 목적으로 수행되었습니다: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD 및 FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD |
| Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard)Merck | KGaA, Darmstadt, Germany | M6908 | |
| Na2HPO4 x 7 H2O (인산이염기성 소듐 이염기성 헵타하이드레이트) | Merck KGaA, 독일 다름슈타트 | S9390 | |
| 올리브 오일 | Merck KGaA, 독일 다름슈타트 | 75343 | 순수, 천연 |
| OptEIA 마우스 IFN-&감마; ELISA Set | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 555138 | |
| Ortho-dianisine dihydrochloride | Merck KGaA, 다름슈타트, 독일 | D3252 | |
| 파라핀 왁스 | Merck KGaA, 다름슈타트, 독일 | 76242 | 비드, 왁스 고체 |
| PBS (인산염 완충 식염수) | ThermoFisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬 | 20012027 | pH 7.2, 포유류 세포 배양 |
| pH 측정기 | Elmetron, 폴란드 | CP-401 | |
| 피펫, 팁 포함 가변 용량 | Merck KGaA, 독일 다름슈타트 | EP3123000900-1EA | 3팩, 옵션 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, epT.I.P.S 포함 |
| 면도날 | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | PERS94-0462 | 스크레이퍼 및 커터 블레이드, 단일 모서리, 알루미늄 척추, 상자당 100개의 블레이드, 개별 포장 |
| 된 로터리 마이크로톰 | MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK | HIS-202A | |
| 가위 - 스트레이트, 샤프/샤프 | Animalab, 포즈난, 폴란드 | 14060-10FST | 마우스 시술용 수술 기구(멸균해야 함) |
| 스크류 캡 (오픈 탑) | Merck KGaA, 다름슈타트, 독일 | 27056 | 블랙 폴리프로필렌 홀 캡, 22 20-400 스레드 |
| 분광 광도계 | BioTek Instruments, 미국 201446 | 범용 마이크로플레이트 분광 광도계: λ 범위: 200 - 999 nm, 흡광도 측정 범위: 0.000 - 4.000 Abs | |
| 염색 접시 랙이 있는 슬라이드 20 | Merck KGaA, 다름슈타트, 독일 | S6141 | 예: 커버, 슬라이드 랙 및 손잡이가 있는 20개의 슬라이드 염색 접시 |
| 멸균 일회용 생검 펀치 6mm | Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA | 33-36 | |
| 외과용 가위 | Animalab, 포즈난, 폴란드 | 52138-46 | 생쥐 시술용 수술 기구(멸균해야 함) |
| 조직 처리 카세트 | Merck KGaA, 다름슈타트, 독일 | Z672122 | 뚜껑이 있는 조직 처리/임베딩 카세트 |
| TMB 기질 시약 세트 | Becton Dickinson(BD Biosciences), 프랭클린 레이크스, NJ, 미국 | 555214 | |
| TNCB (2,4,6-트리니트로클로로벤젠) | Tokyo Chemical Industry CO., LTD, 일본 | C0307 | |
| TNP-BSA (2,4,6-트리니트로페닐과 접합된 소 혈청 알부민) | Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA | T-5050 | |
| T-PER (tissue protein extration reagent) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 78510 | |
| 튜브 15 mL sterile | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | CLS430055 (Corning) | 폴리프로필렌, 원뿔형 바닥 |
| 튜브 50 mL, sterile | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | CLS430290 (Corning) | 폴리프로필렌, 원뿔형 바닥 |
| Tween 20 | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | P1379 | |
| 바이알, 나사 상단, 투명 유리(바이알만 해당) 22 mL | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 27173 | hapten의 준비를 위해 증발하지 않도록 나사로 조임 |
| 수조 | AJL Electronic, Poland | LW102 | |
| 왁스(파라핀) 디스펜서 | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 114-8737 | |
| 주사용 자일라진(자일라판 20mg/mL) 용액 | Vetoquinol Biowet Sp. z oo., Gorzow Wielkopolski, Poland | cat.# 사용할 수 | |
| 크실렌(조직학적 등급) | Merck KGaA, 다름슈타트, 독일 | 534056 |
참고문헌
- Nosbaum, A., Vocanson, M., Rozieres, A., Hennino, A., Nicolas, J. F. Allergic and irritant contact dermatitis. European Journal of Dermatology. 19 (4), 325-332 (2009).
- Hertl, M., et al. Predominance of epiderma....
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재인쇄 및 허가
이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청
허가 요청정오
Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 1/19/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.
Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:
On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.
to:
On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.
Figure 1 of the Representative Results has been updated from:
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.
Figure 2 of the Representative Results has been updated from:
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.