방법 논문

3단계 G-Quadruplex 등온 지수 증폭 반응에 의해 촉진되는 Aptamer 기반 표적 검출

DOI:

10.3791/64342

⸱

2022년 10월 6일

 ,  , 
1Aptagen LLC

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

현재 프로토콜은 표적을 검출하기 위해 빠른 3단계 압타머 기반 지수 증폭 분석의 사용을 보여줍니다. 샘플 준비, 신호 증폭 및 색상 현상은 카페인보다 테오필린의 존재를 인식하기 위해 이 시스템을 구현하기 위해 다룹니다.

초록

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압타머는 높은 친화력과 특이성으로 결합하는 표적 인식 분자입니다. 이러한 특성은 신호 생성 능력을 가진 다른 분자를 제어하는 데 활용할 수 있습니다. 본원에 기술된 시스템의 경우, 변형된 귀상어 리보자임의 앱타머 도메인, 줄기 II를 통한 표적 인식은 초기에 구조화되지 않은 구축물을 안정화시킴으로써 자가-절단 리보자임을 활성화시킨다. 시스 절단 RNA는 줄기 III와 줄기 I의 접합부에서 작용하여 두 개의 절단 산물을 생성합니다. 더 긴 절단 생성물은 두 개의 유사한 촉매 활성 G-쿼드러플렉스의 등온 지수 증폭 반응(EXPAR)을 프라이밍합니다. 이러한 결과 증폭 산물은 과산화효소 환원을 촉매하며, 이는 육안으로 감지할 수 있는 출력으로 비색 기질의 환원과 결합됩니다. 본 연구에 설명된 3파트 시스템은 0.5분 이내에 15μM의 낮은 테오필린의 존재를 나타내는 시각적으로 검출 가능한 신호를 생성하여 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)과 같은 검출 방식을 개선합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

압타머는 전형적으로 원하는 표적에 대한 높은 결합 친화도 및 특이성을 갖는 진화적 과정을 통해 선택된 단일 가닥 DNA 또는 RNA이다1. 결합 능력에 더하여, 앱타머는 신호-출력 기능(2,3)으로 모티프에 연결되고 제어될 수 있으며, 상기 신호를 증폭하고 시스템의 감도를 향상시킬 수 있다. G-쿼드러플렉스 등온 지수 증폭 반응(GQ-EXPAR) 시스템은시각적 출력(4)을 생성하기 위해 연속적인 구성 요소가 단일 반응 용기에 추가될 때 시각적 신호를 발생시키는 세 부분으로 구성된 시스템(그림 1)입니다. 이 시스템은 관심 표적을 빠르고 구체적으로 검출할 수 있도록 간소화된 워크플로우를 사용하여 주어진 샘플에서 특정 표적(여기서는 테오필린)을 15분 이내에 검출할 수 있습니다. 이 방법은 목표 농도의 특정 정량화가 짧은 시간 내에 반응의 높은 특이성보다 낮은 관심사인 샘플에 대해 고려되어야 합니다.

자기 절단을 겪는 구조 전환 RNA 분자(리보자임)인 알로스테릭 리보스위치(allosteric riboswitch)가 초기 신호를 생성합니다. 이 구조는 귀상어 리보자임을 기반으로 하며, 절단 활성의 조절자로서 Stem II에 도입된 앱타머 도메인이 있습니다. 그것의 자기 분열 기능은 그것의 압타머 도메인이 그것의 표적에 결합할 때 안정화될 때 활성화된다5. 그렇지 않으면 스위치가 기본 상태에서 비활성 상태가 됩니다.

후속 지수 증폭 반응(EXPAR)은 첫 번째 단계에서 자가 절단된 RNA 가닥의 방출을 사용하여 등온 증폭 반응6을 프라이밍합니다. EXPR의 증폭 산물은 시스템의 마지막 단계의 기초로 작용하는 과산화효소 활성7을 갖는다. 일부 기질이 과산화물 분해와 함께 산화되면 다양한 기기에서 측정할 수 있는 형광 출력이 생성됩니다. 다른 일반적인 기질은 시각적 검출을 위한 착색된 생성물을 생산하기 위해 대체될 수 있다. EXPAR 및 이의 증폭 산물의 과산화효소 활성은 2단계 신호-증강제로서 작용하여, 종래의 전략에 비해 더 높은 수준에 대한 민감도를 증가시킨다 7,8.

테오필린 대 카페인의 검출은 단일 메틸기만 다르기 때문에 이 검출 플랫폼의 특이성의 예로 사용됩니다(그림 2). 이 시스템 시연은 최소 500nM 테오필린의 시각적 검출을 위한 비색 출력을 생성합니다.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

반응 성분의 특정 부피 및 농도를 포함하는 튜브 준비에 대해서는 보충 표 1 (반응 설정표)을 참조하십시오. 여기에 설명된 프로토콜은 재료 표에 설명된 대로 사전 조립된 검출 플랫폼 키트를 사용합니다. 달리 명시되지 않는 한 모든 구성 요소는 얼음 위에 보관해야 합니다.

1. 리보자임의 제조

참고: 1차 검출 성분은 테오필린을 인식하는 알로스테릭(압타머 조절) 리보자임입니다( 보충 표 2 참조).

  1. PCR 튜브에 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 5U(0.5μL, 재료 표 참조)를 수집하여 리보자임 절단 산물을 활성화하는 데 사용합니다.
    알림: 이 구성 요소가 먼저 추가되어 사용자가 효소의 올바른 분배를 볼 수 있습니다.
  2. 미리 준비된 5x 리보자임 완충액( 재료 표 참조) 1μL을 각 샘플 튜브(PCR 튜브)에 추가합니다.
  3. 특이성을 시각적으로 입증하기 위해 1.5μL의 2mM 테오필린(표적) 또는 2mM 카페인(대조군)( 재료 표 참조)을 각 샘플 튜브에 테스트 샘플로 추가합니다.
    참고: 표준 곡선을 설정하려면 3.125mM 분석물에서 시작하여 0.001mM까지 5배 희석을 테스트하는 것이 좋습니다.
  4. 각 샘플 튜브를 5-10회 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.
  5. 표적에 특이적인 앱타머 도메인을 포함하는 600nM RNA 2μL( 재료 표 참조)를 각 샘플 튜브에 추가하여 5μL의 테스트 용액에 240nM의 최종 농도를 만든 다음 피펫팅으로 빠르게 혼합하고 콜드 블록에 올려 배경 신호를 최소화합니다.
    참고: 리보자임이 리보자임 완충액과 결합될 때 자가 절단 반응이 즉시 시작되고 상당한 배경을 생성할 수 있으므로 초기에 리보자임 없이 모든 반응을 준비하는 것이 중요합니다.
  6. 모든 반응 튜브가 준비되면 타이머를 사용하여 각 샘플(5μL)을 실온(23°C)에서 정확히 3분 동안 배양합니다. 배양 후 즉시 샘플 튜브를 얼음(4°C)으로 되돌립니다.

2. GQ-익스프레스

  1. 3.5 μL의 nickase-polymerase 효소 혼합물( 재료 표 참조)을 각 샘플 튜브에 넣고 잘 섞습니다.
    참고: 필요한 효소 농도는 인식 서열, 효소 유형 및 반응 온도에 따라 달라지며, 이들의 조합은 경험적으로 결정되었습니다.
  2. 주형, 뉴클레오티드 및 반응 완충액( 재료 표 참조)을 포함하는 EXPAR 반응 혼합물 31.5μL을 각 샘플 튜브와 피펫에 추가하여 혼합합니다.
    참고: 성분 농도는 중합효소 생성물의 효소 및 서열에 따라 최적화됩니다.
  3. 모든 샘플이 준비되면 타이머를 사용하여 정확히 5분 동안 55°C에서 준비된 각 샘플(40μL)을 배양합니다. 가능하면 가열 된 뚜껑이 필요하지 않지만 thermocycler에서 배양하십시오.
  4. 배양 단계 후 즉시 샘플 튜브를 얼음(4°C)으로 되돌립니다.

3. 발색

  1. 각 샘플 튜브에 2 μL의 헤민 용액 (25 uM, 재료 표 참조)을 넣고 잘 섞는다.
  2. 시중에서 판매되는 TMB 용액 58μL( 재료 표 참조)를 각 샘플 튜브에 넣고 잘 섞습니다.
  3. 발색 반응물(100μL)을 실온에서 최소 3분 및 최대 30분 동안 배양합니다.
    참고: (선택 사항) 20μL의 2M 황산을 추가하여 발색을 중지할 수 있습니다.
  4. 샘플을 눈으로 정성적으로 판독하거나 황산을 사용하여 발색 반응이 중단된 경우 450nm에서 흡광도 플레이트 리더를 사용하여 결과를 정량화합니다.

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결과

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그림 1 에 묘사된 검출 플랫폼은 앱타머 표적 인식을 단기간에 시료 전처리(표적 대 비표적, 그림 2) 간의 시각적으로 뚜렷한 차이로 변환합니다. Soukup et al.5 에 의해 확인된 알로스테릭 리보자임은 대조군 및 음성 샘플에 대한 표적에 대한 반응으로 덜 잡음이 적은 서열을 생성하기 위한 출발점 역할을 했습니다. 최적화된 구조는 30분 만에 500nM 테오필린(그림 3)만 인식할 수 있었는데, 표적에 노출된 시료 전처리는 3단계에서 파란색을 생성하는 반면, 표적이 포함되지 않은 시료는 무색으로 남습니다. 필요한 경우, 이러한 결과는 먼저 3.4 단계에 설명된 대로 발색 반응을 중지한 다음, 존재하는 표적의 초기 농도를 측정하기 위해 450nm에서 생성된 생성물의 흡광도를 판독함으로써 정량화될 수 있다. 이 공정의 전형적...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시된 방법은 알로스테릭 리보자임에서 초기에 무질서한 2차 구조와 시스 절단 귀상어 리보자임을 활성화하기 위해 앱타머 도메인에 대한 표적의 결합을 통해 부여된 추가 안정성 사이의 전이를 이용합니다. 리보자임의 안정성은 표적 결합이 활성 구조를 복원하도록 허용하면서 표적의 부재 하에서 촉매 활성을 최소화하도록 조정되었다. 또한 EXPAR 및 발색을 촉진하는 데 필요한 여러 효소의 완충액의 균형을 맞추기 위해 주의를 기울여야 합니다. 마지막으로, 이것이 3단계 시스템이라는 점을 고려할 때, 반응 성분의 농도와 함께 배양 시간과 온도의 조합은 노이즈를 최소화하면서 신호를 최대화하는 것이 작은 도전이 아니라는 것을 의미했습니다.

리보자임의 제조 동안(단계 1), 앱타머 도메인에 대한 표적 결합은 자가-절단 리보자임의 구조를 안정화시킨다. 그럼에도 불구하고, 리보자임은 일단 리보자임 완충액에 도입되면, 표적이 없는 경우에도 절단할 수 있을 것이다. 따라서 배경 신호를 최소화하려면 ...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aptagen, LLC는 압타머 기반 검출 시스템을 직접 경험하고자 하는 사용자를 위해 GQ-EXPAR 데모 키트를 제조 및 판매합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 Aptagen LLC의 연구 개발 자금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 디하이드로클로라이드(TMB) 용액 H2O2, "MaxSignal TMB 마이크로웰 기판 솔루션"PerkinElmerFOOD-1806-1000색상 개발 시약. 빛과 대기에 대한 노출을 최소화합니다. 이전 BIOO Scientific 카탈로그 번호 1806.
Apta-beacon 데모 키트에 튜브 3-2로 공급되었습니다.
5'- TCC, CTC, CCT, CCC, TCC, CAG, TCC, AGA, CTC, TTC, CCT, CCC, CCC, CCA, GA-비오틴-3'Integrated DNA Technologies (IDT)G-quadruplex에 의해 프라이밍된 G-quadruplex를 생성하기 위해 EXPAR용 맞춤형으로 최적화된 QtQ47 DNA 템플릿. 이것은 EXPAR의 "지수" 부분에 사용되어 3단계 발색에 사용되는 DNAzyme의 양을 빠르게 증가시킵니다. 템플릿에는 EXPAR.
Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2의 일부 동안 Bst 2.0 DNA 중합효소에 의한 의도하지 않은 확장을 방지하기 위한 3'-비오틴이 포함되어 있습니다.
5'-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3'Integrated DNA Technologies (IDT)Soukup et al.
Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632.
provided in Apta-beacon Demonstration Kit as tube 1-3에서 수정됨.
5'-TCC, CTC, CCT, CCC, TCC, CAG, TCC, AGA, CTC, TAC, GGC, TTT, CAC, CGT, TTC, AAC, G-비오틴-3'Integrated DNA Technologies (IDT)P3 분할 산물로 프라이밍된 G-쿼드러플렉스를 생성하기 위한 EXPAR용 맞춤형 최적화 P3tQ49 DNA 템플릿. 이는 2단계에서 절단 생성물을 3단계 발색에 사용되는 DNAzyme으로 변환하는 데 사용됩니다. 템플릿에는 EXPAR.
Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2의 일부 동안 Bst 2.0 DNA 중합효소에 의한 의도하지 않은 확장을 방지하기 위한 3'-비오틴이 포함되어 있습니다.
5x Ribozyme BufferAptagen, LLCN / A5x 구성 : 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2< / sub>, 25 mM DTT. 1단계에서 사용
튜브 1-4로 Apta-beacon 데모 키트에 제공됩니다.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) 데모 키트Aptagen, LLCGQ-EXPAR-TMB데모 키트는 단일 메틸기에서만 차이가 나는 어려운 저분자 표적, 테오필린 대 카페인을 검출하여 비색 분석의 특이성을 보여줍니다. 
Bst 2.0 DNA 중합효소New England BiolabsM0537S스트랜드 변위 활성이 있는 등온 증폭 중합효소. 9.375 U/uL.
에서 제조된 Nickase-Polymererase Mix의 일부 Apta-beacon 데모 키트 튜브 튜브 2-1의 일부.
Buffer 3.1New England BiolabsB6003SVIAL2 uL의 10X 등온 증폭 완충액 및 27.5 uL의 뉴클레아제가 없는 물과 결합하여 EXPAR Mix에서 1.11X EXPAR Buffer를 생성합니다. 이 제품은 초기 시스템 개발의 일부였던 이전에 사용된 B7203SVIAL(비재조합 BSA를 제외한 동일한 구성)을 대체합니다.
Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2의 일부.
인Sigma-AldrichC0750-100GAptamer 카운터 타겟(대조군), 뉴클레아제가 없는 물로 준비됨.
Apta-beacon 데모 키트에 튜브 1-1로 제공됨.
dNTPNew England BiolabsN0447SEXPAR 반응 혼합물의 일부입니다.
Apta-beacon 데모 키트 튜브 2-2의 일부입니다.
EXPAR 반응 혼합물Aptagen, LLCN/A0.44 mM dNTPs, 0.38 & 남 P3tQ49, 0.38 μ M QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μ g/ml BSA, 0.0635 % 트윈 20.
Apta 비콘 데모 키트 튜브 2-2의 일부.
HeminSigma-AldrichH9039DMF에서 최종 농도 25uM.
로 재현탁 Apta-beacon 데모 키트에 튜브 3-1로 공급됩니다.
등온 증폭 버퍼New England BiolabsB0537SVIAL10x 버퍼 3.1 및 27.5 µ의 2 uL와 결합; EXPAR Mix.
Apta-beacon 데모 키트 튜브 2-2의 일부에서 1.11x EXPAR 버퍼를 생성하기 위한 nuclease-free 물의 L.
MgCl2Amresco (VWR)E525-500ML귀상어 리보자임 보조 인자, 자가 분열에 필요.
Apta 비콘 데모 키트 튜브 1-3의 일부.
MJ PTC-100 열순환기MJ 리서치, Inc.PTC-100Thermocycler. 모든 열순환기 또는 핫 블록을 사용할 수 있습니다.
N, N-디메틸포름아미드(DMF)시그마-알드리치227056-100ML냉동고에서 헤민을 재현탁하고 유통 기한을 최대화하는 데 사용됩니다.
Apta-beacon 데모 키트 튜브 3-1의 일부.
Nickase-polymerase MixAptagen, LLCN/ANt.BstNBI (9.375 단위/μ L) 및 Bst 2.0 DNA 중합효소(0.5 단위/μ L).
튜브 2-1로 Apta 비콘 데모 키트에 제공됩니다.
Nt.BstNBINew England BiolabsR0607S지속적인 등온 증폭을 허용하는 니킹 효소. 0.5 U/uL.
에서 제조된 Nickase-Polymerase Mix의 일부 Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1의 일부.
T4 Kinase BufferNew England BiolabsB0201SVIAL고리형 인산염을 제거하는 데 필요한 효소용 완충액입니다.
Apta-beacon 데모 키트의 일부 튜브 1-4.
T4 폴리뉴클레오티드 키나아제New England BiolabsM0201S후 고리형 인산염을 제거하여 절단 생성물이 등온 증폭 반응을 프라임할 수 있도록 합니다.
PCR 튜브로 Apta-beacon 데모 키트에 제공됩니다.
Tecan GENios FLTecanGenios-FL TWT플레이트 리더는 3단계 결과에서 흡광도 신호를 측정합니다.
테오필린시그마-알드리치T1633-50GAptamer 타겟, 뉴클레아제가 없는 물로 준비됨.
튜브 1-2로 Apta-beacon 데모 키트에 제공됨.
Tris-HClAmerican BioanalyticalAB14043-01000Aptamer binding buffer.
Apta-beacon 데모 키트 튜브 1-4의 일부.
카페는 배양 온도를 제어하는 절단

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  2. Tang, J., Breaker, R. R. Rational design of allosteric ribozymes. Chemical Biology. 4 (6), 453-459 (1997).
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  4. Liao, A. M., et al. A simple colorimetric system for detecting target antigens by a three-stage signal transformation-amplification strategy. Biochemistry. 57 (34), 5117-5126 (2018).
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  6. Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
  7. Cheng, X., Liu, X., Bing, T., Cao, Z., Shangguan, D. General peroxidase activity of G-quadruplex-hemin complexes and its application in ligand screening. Biochemistry. 48 (33), 7817-7823 (2009).
  8. Nie, J., et al. Reporter-triggered isothermal exponential amplification strategy in ultrasensitive homogeneous label-free electrochemical nucleic acid biosensing. Chemical Communications. 50 (47), 6211-6213 (2014).
  9. Tabuchi, T., Yokobayashi, Y. Cell-free riboswitches. RSC Chemical Biology. 2 (5), 1430-1440 (2021).
  10. Ao, Y., et al. Integration of an expression platform in the SELEX cycle to select DNA aptamer binding to a disease biomarker. ACS Omega. 7 (12), 10804-10811 (2022).

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