인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심장 스페로이드의 생성, 고처리량 스크리닝 및 바이오뱅킹

인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)의 발견은 세포 수준에서 인간 발달과 질병을 연구할 수 있는 전례 없는 기회를 제공했습니다. 지난 10년 동안 발달 수업을 사용하여 hiPSC를 심근 세포(CM)로 효율적으로 분화하기 위한 다양한 프로토콜이 수립되었습니다1,2,3,4. hiPSC 유래 심근 세포 (hiPSC-CMs)는 유전 적으로 유전 가능한 심혈관 질환 (CVD)을 모델링하고, 신약에 대한 심장 안전성을 테스트하고, 심장 재생 전략을 수립하기위한 자원으로 사용될 수 있습니다 5,6,7,8. hiPSC의 유도된 심장 분화에도 불구하고, 성숙한 hiPSC-CM은 일반적으로 증식하지 않고 일차 인간 세포는 대량으로 사용할 수 없기 때문에 불명확한 CM 수는 심장 분야에서 여전히 도전 과제로 남아 있습니다.

최근에, 우리는 낮은 세포 밀도 배양과 수반되는 Wnt 신호 전달 활성화가 hiPSC-CM ^9,10의 대규모 증식 반응(최대 ²⁵⁰배)을 초래한다고 설명했습니다. 배양 플라스크 형식의 직렬 패시징을 통해 hiPSC-CM의 대규모 확장을 위한 이 비용 효율적인 전략은 많은 수의 기능성 hiPSC-CM의 표준화 및 품질 관리를 용이하게 합니다. 또한, 다양한 기증자로부터 대량의 hiPSC-CM에 대한 수요를 따라잡기 위해 hiPSC-CM의 바이오뱅킹에 대해 설명했습니다¹⁰. 그러나 이러한 표준 배양 접시에 파종된 심근 세포 단층은 심장에 존재하는 복잡한 3D 구조를 대표하지 않습니다. 더욱이, hiPSC-CM의 미성숙은 여전히 장애물로 남아 있어 생체 내 심혈관 환경의 생물학적 및 생리학적 표현형을 모방하는 데 부족합니다.

hiPSC-CM이 자기 조직화 11,12, 세포외 기질(ECM) 리모델링 13, 향상된 성숙 14,15,16 및 동기화된 수축^17,18,19과 같은 더 가까운 생리적 행동을 보여주는 새로운 3D 시험관 내 모델이 개발되었습니다 . 3D 모델은 약물 발견, 약물 심장 독성 테스트, 질병 모델링, 재생 요법 및 첫 번째 임상 시험 20,21,22,23,24에도 활용되었습니다. 가장 많이 사용되는 모델 중 하나는 피브린 기반 조작 심장 조직(EHT)으로, 조직과 같은 배열과 심장 수축성을 나타냅니다^13,17,25. 이전에 우리는 확장된 hiPSC-CM에서 생성된 EHT가 확장되지 않은 hiPSC-CM에서 생성된 EHT와 유사한 수축성을 나타내어 확장⁹ 후에도 손상되지 않은 세포 기능을 입증했음을 보여주었습니다. 그럼에도 불구하고 hiPSC-CM에서 EHT 생성이 잘 확립되어 있음에도 불구하고 HT 평가 플랫폼 구축과 관련하여 추가 개발이 예상됩니다. 여기에서 96웰 형식의 많은 수의 자가 응집 심장 스페로이드(CS)를 빠르게 생성하면 고처리량 스크리닝(HTS) 목적을 위한 3D 조건을 개선할 수 있습니다.

전반적으로 3D 세포 배양으로서 CS의 장점은 높은 재현성과 확장성입니다. 특히, 로봇 시료 처리와 결합된 CS는 CS 배양, 약물 처리 및 고함량 분석(high-content analysis)을 표준화하고 자동화할 수 있다⁽²⁰). 여기에서는 광학 칼슘 획득 및 분석 시스템을 사용하여^Ca2+ 과도 측정을 수행하여 심장 기능을 효율적으로 냉동 보존하고 스크리닝할 수 있는 고순도 및 고품질 CS를 생성하기 위한 최적화된 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 수백에서 수천 개의 스페로이드^17,18에 대해 고처리량 스크리닝을 수행할 수 있는 간단하면서도 강력한 도구를 제공한다.

참고: 이 연구에 사용된 hiPSC-CM은 이전에 설명된 hiPSC 배양 및 CM 분화 프로토콜^26,27에 따라 생성되었습니다. 선택적으로, hiPSC-CM은 CS 프로토콜(섹션 4)을 시작하기 전에 최근에 게시된 대로 확장 및 냉동 보존될 수 있습니다(섹션 4)¹⁰.

1. 세포 배양 배지, 용액 및 분취량의 제조

1. 기초 배지 준비
   1. 페니실린-스트렙토마이신과 배지(RPMI 1640)를 실온(RT)으로 평형화하고 완전히 해동되었는지 확인합니다. 배지 500mL와 펜/연쇄상 구균 5mL를 섞습니다. 최대 8주 동안 4°C에서 보관하십시오. 사용하기 전에 37°C로 평형을 유지하십시오.
2. RPMI + B27 준비
   1. B27 보충제와 기본 배지를 RT로 평형을 이루십시오. 보충제를 완전히 해동하십시오. 기본 배지 490mL와 50x B27 보충제 10mL를 혼합합니다. 최대 2주 동안 4°C에서 보관하십시오. 사용하기 전에 37°C로 평형을 유지하십시오.
3. hiPSC-CM 재도금 매체 준비
   1. Rho-연관, 코일 코일 함유 단백질 키나아제(ROCK) 억제제(2μM 최종 농도) 및 10% 녹아웃 혈청 대체물(KSR)을 RPMI + B27 배지에 추가합니다. 필요에 따라 ROCK 억제제를 RM 배지에 직접 추가합니다. 보충된 배양 배지는 보관하지 마십시오.
4. CM 해동 매체 준비
   1. 1:100 농도의 세포 생존 보충제(예: 레비타셀) 및 20% KSR을 RPMI + B27 배지에 첨가하고 사용하기 전에 37°C로 평형을 이룹니다.
5. 성숙 보충제 준비
   1. 앞서 기술한 성숙 배지 포뮬러²⁸ 은 다음과 같이 구성된다: 3 mM 포도당, 10 mM L-락테이트, 5 mg/mL 비타민 B12, 0.82 mM 비오틴, 5 mM 크레아틴 일수화물, 2 mM 타우린, 2 mM L-카르니틴, 0.5 mM 아스코르브산, 1x NEAA, 0.5% (w/v) 알부맥스, 1x B27, 및 1% KOSR. 성숙 보충제 1병(500mL)을 준비하려면 포도당이 없는 DMEM 병에서 65mL를 제거하고 포도당 2.7g, L-젖산염 5.6g, 비타민 B12 0.025mg, 비오틴 1mg, 크레아틴 일수화물 3.73g, 타우린 1.25g, L-카르니틴 1.975g, 아스코르브산 0.7125g, NEAA 50mL, 알부맥스 12.5g, 페니실린-스트렙토마이신 5mL.
   2. 0.22μm 공극 PES(Polyethersulfone) 멤브레인이 있는 멸균 일회용 필터 장치를 통해 필터링합니다.
   3. 45mL(500mL의 성숙 배지 준비) 또는 4.5mL(50mL의 성숙 배지 준비)로 분취합니다. 20°C에서 최대 6개월 동안 보관하세요.
6. 성숙 배지 준비
   1. RT에서 B27 보충제, 녹아웃 SR, 페니실린-스트렙토마이신, 성숙 보충제²⁸ 및 DMEM 무포도당 배지를 평형화합니다. 435mL의 DMEM 무포도당 배지를 10mL의 50x B27 보충제, 5mL의 페니실린-스트렙토마이신, 5mL의 녹아웃 SR 및 45mL의 성숙 보충제와 혼합합니다. 최대 2주 동안 4°C에서 보관하십시오. 사용하기 전에 37 °C에서 평형을 유지하십시오.
7. 형광 밝은 배지 준비
   1. 페니실린-스트렙토마이신과 DMEM 플루오로브라이트 배지를 RT에서 평형화합니다. 보충제가 완전히 해동되었는지 확인하십시오. 500mL의 DMEM 플루오르브라이트 배지와 5mL의 페니실린-스트렙토마이신을 혼합합니다. 최대 1개월 동안 4°C에서 보관하십시오. 사용하기 전에 37 °C에서 평형을 유지하십시오.
8. 비이온성 세제 용액 준비
   1. 20% w/v 비이온성 세제 분말(예: F-127)을 PBS와 혼합합니다. 0.22 μm 필터를 사용하여 여과하고 4°C에서 최대 6개월 동안 보관합니다. 사용하기 전에 RT에서 평형을 유지하십시오.
9. 칼슘 염료 배지 준비
   1. 비이온성 세제 용액(최종 농도 0.04% v/v)과 칼슘 염료 0.1배(예: Cal520 AM)를 형광 밝은 매체에 혼합합니다. 50mL 원뿔형 튜브에 Cal520 10μL와 비이온성 세제 용액 20μL를 추가합니다. 완전히 녹을 때까지 섞는다. 세포에 첨가하기 전에 용액을 어둠 속에 보관하십시오.

2. 완충액의 제조

1. 투과화 및 차단 완충액 준비: 이 완충액에는 10mL의 PBS, 5% wt/v BSA 및 0.3% v/v Triton-X-100이 포함되어 있습니다.
2. 유세포 분석 완충액 준비: 이 완충액에는 50mL의 PBS, 1% wt/v BSA 및 0.3% v/v Triton-X-100이 포함되어 있습니다.
3. 유세포 분석 세척 완충액: 이 완충액에는 50mL의 PBS와 1% wt/v BSA가 포함되어 있습니다.
4. 스페로이드 세척 완충액(SWB): 이 완충액에는 1L의 PBS에 1mL의 Triton-X-100, 2mL의 10%(DPBS의 w/v) SDS 및 2g의 BSA가 포함되어 있습니다.
   알림: SWB는 4°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다.
5. 임베딩 용액(ES) 준비: 100mL의 임베딩 용액을 준비하기 위해 50mL의 글리세롤과 9.09mL의 dH 2O, 1mL의 트리스완충액(1M, pH 8.0) 및 200μL의 EDTA(0.5M)를 혼합합니다. 과당 22.7g을 넣고 녹을 때까지 어두운 곳에서 RT에서 혼합하십시오. 투명해지면 과당 22.2g을 넣고 녹을 때까지 섞는다. 그런 다음 요소 15g을 넣고 녹을 때까지 혼합합니다(어두운 곳에서 4°C에서 보관).
6. PBT(PBS with Tween-20) 버퍼를 준비합니다. 이 버퍼에는 PBS/Tween-20(0.1% v/v)이 포함되어 있습니다. PBS 1L에 Tween-20 1mL를 추가합니다.

3. 소분자의 제조

1. DMSO에서 50μL의 10mM 분취액으로 티아조비빈(ROCK 억제제) 분말을 재구성하고 최대 6개월 동안 -20°C에서 보관합니다. 빛으로부터 보호하십시오.
2. DMSO에서 Cal-520 AM의 각각 10μL의 2.5mM 분취량을 준비하고 최대 6개월 동안 -20°C에서 보관합니다. 빛으로부터 보호하십시오.

4. 심장 스페로이드 생성

참고: 더 많은 양의 CS의 경우 2mL의 hiPSC-CM 재도금 매체가 있는 6웰 초저 부착 플레이트에 최대 100만 CM을 시드합니다. 이 연구는 96웰 플레이트의 웰당 최소 2,500(2.5k CS)에서 최대 20,000(20k CS)의 hiPSC-CM을 사용했습니다.

1. 하나의 96웰 플레이트에 대해 최소 2 x 10⁶ 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포(hiPSC-CM)¹⁰을 포함하는 세포 배양물을 준비합니다.
2. 배양된 hiPSC-CM이 합류점에 도달하면 0.1mL/^cm2 의 멸균 심장 박리 용액(예: tryple)을 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 15분 동안 인큐베이션합니다.
3. 5mL 피펫을 사용하여 2mL의 따뜻한 기본 배지로 플러싱하여 세포를 기계적으로 해리하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 명시야 현미경(4배 배율)으로 분리를 확인합니다. 세포는 흰색으로 보이고 둥근 모양입니다.
4. 세포 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 300 x g에서 3분 동안 원심분리합니다.
5. 상층액을 흡인하고 1mL의 hiPSC-CM 재도금 배지에 세포를 재현탁합니다.
6. 1,000 μL 피펫 팁을 사용하여 세포 펠릿을 기계적으로 해리합니다. 용액은 3 회 또는 4 회 혼합 후 균질하게 나타납니다. 세포를 세십시오. 적절한 양의 세포를 100 μL의 재도금 배지에 각각 초저부착 둥근 바닥 96웰 웰로 옮긴다.
7. 인큐베이터에서 70 rpm의 궤도 쉐이커에 CS의 플레이트를 24 시간 동안 놓습니다. 인큐베이터 조건을 37°C, 5% CO2, 21%_O2 및 90% 습도로 설정합니다.
8. 각 웰에서 50μL의 배지를 흡인하고 처음 48시간 동안 웰당 100μL의 RPMI + B27 배지를 추가합니다.
   알림: 우발적인 흡인 및 스페로이드 파열을 방지하기 위해 항상 50μL의 배지를 96웰 플레이트에 보관하십시오.
9. 각 웰에서 배지 100μL를 흡인하고 웰당 성숙 배지 100μL를 추가합니다. 성숙 배지에서 세포를 유지하고 2-3 일마다 배지를 새로 고칩니다.

5. CS의 냉동 보존

알림: CS는 장기 보관을 위해 냉동 보존할 수 있습니다. 냉동보존은 CSs 생성 후 3일째부터 수행할 수 있습니다. CS는 96웰 플레이트의 웰에서 직접 또는 극저온 이온의 CS 현탁액으로 냉동보존할 수 있습니다.

1. 접시를 얼음 위에 10분 동안 올려 접시를 미리 식힙니다.
2. 스페로이드 플레이트를 70 x g에서 3분 동안 원심분리합니다.
3. 50 μL가 남을 때까지 상청액을 제거하고 웰당 200 μL의 얼음처럼 차가운 hiPSC 동결 배지를 추가합니다.
   알림: 시술의 전체 기간 동안 CS 서스펜션을 얼음 위에 두십시오. 스페로이드가 있는 6웰 플레이트의 경우 500μL 동결 배지 cryovial에서 하나의 웰을 동결합니다.
4. 플레이트 밀봉 필름으로 플레이트를 밀봉합니다.
   알림: 96웰 플레이트는 폴리스티렌 상자에 보관해야 하며, 사용할 수 없는 경우 5.5.1단계에 설명된 대로 실리콘 몰드를 만들 수 있습니다.
5. 웰 플레이트와 냉동실 사이의 균일한 열 교환을 보장하려면 플레이트를 폴리스티렌 상자나 실리콘 몰드에 조심스럽게 넣습니다.
   1. 실리콘 몰드를 준비하려면: 실리콘 엘라스토머 키트의 두 구성 요소를 10:1 비율로 세게 혼합합니다. 진공 펌프를 사용하여 15-20분 동안 용액의 기포를 제거합니다. 이어서, 웰 플레이트의 바닥 부분 내부에 용액을 던지고 진공 펌프를 사용하여 10분 동안 기포를 제거합니다. 몰드를 오븐에 넣고 60°C에서 8시간 동안 경화시켜 플레이트에서 벗겨지는 반가요성 엘라스토머를 얻습니다.
6. 플레이트를 -80°C에서 폴리스티렌 상자 또는 준비된 실리콘 몰드에서 최소 4시간 동안 동결합니다.
7. 장기간 보관을 위해 플레이트를 액체 질소 탱크 또는 -150°C 냉동고로 옮깁니다.

6. 심장 스페로이드의 해동

알림: 빠른 해동 과정을 위해 한 번에 두 개 이상의 플레이트를 해동하지 마십시오.

1. 50mL 원뿔형 튜브에 37°C로 예열된 기본 배지 20mL를 준비합니다.
2. 액체 질소에서 CS가 있는 세포 플레이트를 수집하고 15분 동안 인큐베이터에 넣습니다. 인큐베이터 조건을 37°C, 5% CO2, 21%_O2 및 90% 습도로 설정합니다.
3. 상청액 및 세포 펠릿을 제거하고, 따뜻한 기저 배지에서 각 웰을 재현탁시킨다. 웰당 200 μL의 배지를 사용합니다.
4. 70 x g에서 3분 동안 원심분리합니다.
5. 6.3단계와 6.4단계를 반복합니다.
6. 세포 펠릿이 남을 때까지 상청액을 제거하고 각 웰에 CM 해동 배지 200μL를 추가합니다.
7. 24 시간 동안 인큐베이터에서 70rpm으로 궤도 셰이커에 CS의 플레이트를 놓습니다. 인큐베이터 조건을 37°C, 5% CO2, 21%_O2 및 90% 습도로 설정합니다.
8. 각 웰에서 배지 50μL를 흡인하고 처음 48시간 동안 웰당 RPMI + B27 배지 100μL를 추가합니다.
9. 각 웰에서 배지 100μL를 흡인하고 웰당 성숙 배지 100μL를 추가합니다. 성숙 배지에서 세포를 유지하고 2-3 일마다 배지를 새로 고칩니다.

7. 세포내^Ca2+ 일시적인 현상의 평가

참고: CS는 총 3주 동안 배양됩니다. 냉동 2주 전, 해동 1주 후. '신선한' 컨트롤은 연령에 맞게 조정됩니다.

1. 배양 1주일 후, 해동된 CS는 칼슘 취급 광학 이미징에 최적입니다. 칼슘 염료(예: Cal520AM)를 사용하여 세포에서^Ca2+ 의 흡수 및 방출을 평가합니다.
2. 웰당 칼슘 염료 배지 100μL로 처리하고 인큐베이터에서 60분 동안 배양합니다. 인큐베이터 조건을 37°C, 5% CO2, 21%_O2 및 90% 습도로 설정합니다.
   알림: Cal520AM은 빛에 민감합니다. 어둠 속에서 모든 로딩 절차와 실험을 수행하십시오.
3. 칼슘 획득 및 분석 시스템을 준비합니다.
   1. 현미경에 전원을 공급하여 환경 제어 옵션이 켜져 있는지 확인합니다.
   2. 카메라와 프레이밍 조리개 크기를 조정하여 배경 영역을 최소화합니다.
      참고: 여기서는 라이카 썬더 DMi8 현미경을 사용했습니다. 다른 현미경 시스템도 30FPS(프레임/초) 이상의 샘플링 속도를 허용할 때까지 적용할 수 있습니다.
4. 10초 이내에 2-10개의 피크가 일정하게 흐르는 비디오를 녹화하고 96웰 플레이트를 스캔하여 처음에는 왼쪽으로 이동한 다음 지그재그 방식으로 아래쪽으로 이동하여 전체 플레이트를 덮습니다. 488 nm 레이저를 사용하여 칼슘 신호를 측정하고; 칼슘 방출 중에 밝은 녹색 신호가 있는 검은색 배경으로 대비를 설정합니다.
5. 일시적인^Ca2+ 를 획득한 후, 형광 추적 분석 소프트웨어(예를 들어, CyteSeer, Vala Sciences)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 데이터를 분석한다.

8. 해리된 심장 스페로이드의 유세포 분석

참고: 이 연구에서는 해동 과정 전후에 CS의 생존력을 결정하기 위해 유세포 분석을 사용했습니다.

1. 스페로이드 손상을 방지하기 위해 5mL 피펫을 사용하여 15mL 원뿔형 튜브에 CS를 수집하고 70 x g에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 PBS 1mL를 추가합니다.
2. 200 x g에서 3분 동안 원심분리기. 상층액을 흡인하고 1mL의 심장 박리 용액(예: tryple)을 추가하여 CS를 해리합니다. 튜브를 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
3. 5mL 피펫을 사용하여 현미경으로 관찰할 때 단일 세포를 볼 수 있을 때까지 2mL의 기본 배지로 플러싱하여 세포를 기계적으로 해리합니다.
4. 200 x g에서 3분 동안 원심분리기.
5. 상층액을 흡인하고 1x PBS에 200μL의 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액으로 CM을 고정합니다. RT에서 10 분 동안 배양하십시오.
6. 200 x g에서 3분 동안 원심분리기. 상층액을 흡인하고 PBS 1mL를 추가합니다.
   알림: 일시 중지 지점: 고정된 hiPSC-CM은 최대 4주 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
7. 세포 현탁액을 FACS 튜브로 옮기고 200 x g에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 50μL의 투과화 완충액에 1 x 10⁵ 세포를 재현탁합니다.
8. 세포를 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.
9. 면역형광 유세포 분석을 위해 8.9.1-8.9.4단계를 수행합니다.
   1. α-액티닌 항체가 포함된 유세포 분석 완충액(50μL)에 세포를 1:300의 희석액으로 재현탁합니다. 또 다른 FACS 튜브에서, 각각의 이소타입 대조군 (예를 들어, FITC 마우스 IgM, κ 이소타입 [1:200 희석])과 함께 유세포 분석 완충액 (50 μL) 중에 1 x 10⁵ 세포를 재현탁한다. 유사하게, 음성 대조군을 위해 50 μL의 유세포 분석 완충액에 1 x 10⁵ 세포를 재현탁합니다.
   2. 세포를 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.
   3. 2.5 mL의 유세포 분석 완충액을 첨가하고, 세포를 4°C에서 3분 동안 200 x g 에서 원심분리하고; 상층액을 버리고 이 세척 단계를 두 번 반복합니다.
   4. 50μL의 유세포 분석 완충액에 세포를 2차 항체 염소 항-마우스(1:300 희석)로 재현탁합니다.
      참고: 2차 항체 용액은 빛에 민감하므로 튜브를 어두운 곳에 두십시오.
10. 요오드화 프로피듐(PI)으로 생존력을 검사하려면 시료당 150μL의 PI(1:1,000)를 추가하고 15분 동안 배양합니다.
    알림: PI 용액은 빛에 민감하므로 튜브를 어두운 곳에 두십시오.
11. 보충 그림 1에 표시된 대로 표준 게이팅 전략에 따라 게이트를 조정하고 유세포 분석기로 세포를 분석합니다.

9. 전체 3D 스페로이드의 면역형광 염색

참고: 이 프로토콜은 이전에 발표된²⁹ 및 심장 스페로이드에 맞게 조정된 면역형광 표지 시 전체 오가노이드의 고해상도 3D 이미징을 위한 프로토콜을 기반으로 합니다. 절차 중에 모든 피펫 팁과 원뿔형 튜브는 스페로이드가 플라스틱에 달라붙는 것을 방지하기 위해 1% wt/v BSA-PBS로 코팅할 수 있습니다. 재료를 코팅하려면 1% BSA-PBS에 담그십시오. 5mL 피펫을 사용하여 스페로이드가 손상되지 않도록 주의하여 기계적 중단을 방지하십시오.

1. 5mL 피펫이 있는 15mL 코팅 튜브에 CS를 수집합니다. 스페로이드는 눈으로 볼 수 있습니다. 항체 조합당 ~20-50개의 스페로이드를 수집합니다. 70 x g 에서 3분 동안 원심분리하고 상층액을 흡인합니다.
2. 코팅된 1mL 팁을 사용하여 1x PBS의 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액 1mL에 스페로이드를 조심스럽게 재현탁합니다.
3. 4°C에서 45분 동안 고정합니다. 20분 후 코팅된 1mL 팁을 사용하여 스페로이드를 부드럽게 재현탁합니다. 이것은 모든 스페로이드 사이에 균일한 고정을 제공합니다.
4. 얼음처럼 차가운 PBS 10mL를 튜브에 넣고 튜브를 뒤집어 부드럽게 섞습니다. 4°C에서 10분 동안 배양하고 70 x g 에서 3분 동안 스핀다운합니다.
   알림: 이 단계부터는 고정 후 CS가 팁에 달라붙지 않기 때문에 일반적으로 팁과 원추형 튜브의 코팅이 필요하지 않습니다.
5. 펠렛을 얼음처럼 차가운 SWB(웰당 SWB 200μL)에 재현탁하여 CS를 차단하고 스페로이드를 24웰 현탁 배양 플레이트로 옮깁니다.
   참고: 하나의 큰 펠릿의 CS를 여러 웰로 분할하여 다양한 염색을 수행할 수 있습니다. 항체 조합 당 ~ 20-50 CS를 사용하십시오.
6. 4°C에서 최소 15분 동안 배양합니다.
7. 빈 웰에 SWB 200μL를 추가하여 참조 웰로 사용합니다.
   참고: 면역형광 염색의 경우 48웰 또는 96웰 플레이트를 사용하여 항체 사용량을 줄일 수도 있습니다. 그러나, 염색 및 세척 결과는 웰 당 더 작은 부피로 인해 감소될 수 있다.
8. 플레이트를 45분 동안 5° 각도로 기울인 상태로 두어 스페로이드가 플레이트 바닥에 안착되도록 합니다.
9. SWB를 제거하고 CS를 SWB 200μL에 남겨 둡니다(기준 웰을 사용하여 최소 부피 200μL를 추정).
10. 1차 항체(예: ɑ-액티닌[1:200] 및 트로포닌 T[1:200])와 함께 SWB 200μL를 추가하고 흔들거나 흔들면서 4°C에서 밤새 배양합니다(수평 셰이커에서 40rpm).
11. 다음날 SWB 1mL를 각 웰에 추가합니다.
12. 플레이트를 45분 동안 5° 각도로 그대로 두어 스페로이드가 플레이트 바닥에 가라앉도록 합니다.
13. SWB를 제거하고 플레이트에 200μL를 남깁니다. SWB 1mL를 넣고 천천히 흔들거나 흔들면서 2시간 동안 세척합니다.
14. 9.12단계와 9.13단계를 두 번 더 반복합니다.
15. 플레이트를 45분 동안 5°로 기울인 상태로 두어 CS가 플레이트 바닥에 안착되도록 합니다. SWB를 제거하고 각 웰에 200μL를 남깁니다
16. SWB 200μL에 2차 항체, 접합 항체 및 염료 2배 농축(예: DAPI[1μg/mL], mouse-AF488[1:500], rabbit-AF568[1:500])을 추가하고 4°C에서 밤새 배양합니다.
17. 다음 날 9.12단계와 9.13단계를 두 번 더 반복합니다.
18. CS를 1.5mL 튜브에 조심스럽게 옮기고 70 x g 에서 3분 동안 회전합니다.
19. CS를 방해하지 않고 피펫팅을 통해 SWB를 최대한 많이 제거합니다.
20. 끝이 잘린 상태에서 200μL 팁을 사용하여 임베딩 용액(ES, RT에서 최소 50μL)을 추가하고 기포 형성을 방지하기 위해 부드럽게 다시 현탁하고 RT에서 20분 동안 배양합니다.
21. 그 동안 매니큐어 또는 실리콘 실런트로 유리 슬라이드에 정사각형 용기를 만듭니다.
22. 200μL 팁의 끝을 잘라내고 ES의 CS를 정사각형 용기의 중앙으로 옮깁니다.
23. 그 위에 정사각형 커버슬립을 놓습니다. 기포를 줄이려면 커버슬립의 한쪽을 먼저 놓은 다음 표면 아래에 공기가 갇히지 않을 때까지 커버슬립을 한쪽에서 다른 쪽으로 천천히 내린 다음 커버슬립을 분리합니다.
24. 커버슬립의 모든 가장자리를 부드럽게 눌러 매니큐어나 실리콘 실런트에 밀봉합니다.
25. RT에서 밤새 슬라이드를 그대로 두십시오. 다음 날, 슬라이드는 이미징 준비가 완료됩니다.
    알림: ES에 의한 광학 제거는 경미한 조직 수축을 유발할 수 있습니다. 그러나 이것은 CS의 전체 형태에 영향을 줄 수 없습니다. 염색 절차는 슬라이드를 4°C(최소 1주일 동안) 또는 -20°C(최소 6개월 동안)에서 보관하여 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.

그림 1A에 표시된 프로토콜은 이전에 확장된 hiPSC-CM에서 CS를 생성하는 방법을 설명합니다. CS는 초저 부착 둥근 바닥 플레이트에서 파종 후 1일까지 3D 구조를 획득하고 최대 6주 동안 배양할 수 있습니다(그림 1B). 면역형광 염색에 의해 평가된 바와 같이, 3주령 CS의 세포 대부분은 α-액티닌 및 트로포닌 T와 같은 육종 단백질을 발현하고 규칙적인 육종 조직을 나타냈습니다(그림 1C). α-actinin 양성 세포의 정량화를 위해 유세포 분석을 수행하였다. 면역형광 결과에 따라, 유세포 분석 데이터는 0일째(76.9% ± 16.6%) 및 3주령 CS(71.1% ± 22.7%) 모두에서 비교할 수 있는 높은 수준의 α-악티닌을 입증했으며(그림 1D), 이는 배양 동안 일정하고 매우 순수한 세포 조성을 나타냅니다. 90일 동안 2D에서 배양된 hiPSC-CM에 비해 hiPSC-CM 유래 스페로이드(42일)에서 접합부(GJA1, JPH2 및 PKP2), 데스모솜(DES) 및 미토콘드리아(ATP5A)에 대한 심장 유전자의 발현이 증가했습니다(그림 1E). 이들 유전자의 발현은 세포-세포 상호작용 및 성숙의 특징이다30.

그 후, CS의 기능적 특성, 즉 박동률 및Ca2+ 핸들링을 서로 다른 시점에서 평가하였다(그림 2). 상승 시간, 피크 시간, 붕괴 시간 및 칼슘 과도 기간(CTD90)과 같은 칼슘 과도 매개변수는 그림 2A, B에 표시된 대로 평가되었습니다. CS를 이기는 비율은 생성 후 처음 3주 동안은 비슷하지만 6주차(Wk6) CS에서는 크게 감소했습니다(그림 2C). 구타율은 Wk1에 비해 Wk3에서 유의하게 감소했으며, CS를 구타하는 비율과 유사하게 Wk6에서 극적으로 감소했습니다(그림 2D). Wk6에서 CS 열화가 관찰되었으며, 이는 박동률과 박동 CS의 수 모두의 감소를 설명할 수 있습니다. 칼슘 과도 매개변수의 측정은 Wk2에서 유의하게 더 높은 피크 값을 나타내었고(그림 2E), 상승 시간, 감쇠 시간 및 CTD90은 Wk1에 비해 Wk3에서 유의하게 증가했습니다(그림 2F-H ). 종합하면, 이러한 결과는 hiPSC-CM 유래 스페로이드가 생성 후 약 2주 및 3주차에 기능적으로 최적임을 보여줍니다.

그림 3은 박동 속도와 칼슘 처리에 대한 스페로이드 크기의 영향을 보여줍니다. CS는 조건당 총 24개의 CS/웰에 대해 96웰 플레이트의 웰에서 2.5 x 10 4, 5 x 10 4, 10 x 104 및 20 x 104 hiPSC-CM을 시딩하여 생성되었습니다(그림 3A). 예상대로 사용된 셀 수가 증가함에 따라 스페로이드 크기가 증가하여 178 ± 36 μm에서 351 ± 65 μm까지 다양했습니다(그림 3A, 오른쪽 패널). Ca2+ 과도 현상은 4개의 상이한 파종 밀도에서 3주령 CS에서 측정되었다(도 3B). 박동하는 CS를 측정한 결과, 더 작은 크기의 CS(2.5K 및 5K-CS)의 약 50%만이 박동하는 반면, 더 큰 크기의 CS(10K 및 20K-CS)의 비율은 훨씬 더 높았습니다(약 85%)(그림 3C). 5K, 10K, 20K-CS에서도 유사한 박동률(약 28bpm)이 나타났으며, 이는 2.5K-CS에 비해 훨씬 높았습니다(그림 3D). 칼슘 이미지의 피크 값은 모든 테스트 조건에서 유사했지만(그림 3E), 상승 시간(그림 3F), 붕괴 시간(그림 3G) 및 CTD90(그림 3H)은 더 작은 크기(10K- 및 20K-CS)에 비해 더 큰 크기-CS(2.5K- 및 5K-CS)에서 유의하게 증가했습니다. 종합하면, 이러한 결과는 10K와 20K hiPSC-CM/웰 사이의 파종 밀도를 사용할 때 hiPSC-CM 유래 스페로이드가 칼슘 취급 스크리닝에 최적임을 보여줍니다.

다음으로 냉동보존이 CS의 생존력과 기능에 미치는 영향을 평가했습니다. 분석 전에, 해동된 CS를 1주일 동안 배양물에서 유지하였다(도 4A). 유세포 분석(도 4B) 및 Calcein-AM(도 4C) 세포 생존율 검정 모두에 의해 나타난 바와 같이, 냉동보존은 CSs 내의 세포 생존율에 영향을 미치지 않았다. 또한, 해동된 CS는 신선한 연령 일치 CS와 비교하여 유사한 육종 단백질의 발현 수준을 나타내었다(도 4D). 이러한 데이터는 CS가 후속 심장 기능 분석 및 고처리량 스크리닝을 위해 효율적으로 냉동 보존될 수 있음을 나타냅니다.

마지막으로, 박동 활성 및Ca2+ 취급은 신선 및 냉동보존된 CS 모두에서 측정되었다(도 5). CS를 박동하는 비율은 해동 후 각각 2일, 5일 및 7일에 다른 시점에서 측정되었습니다. 대부분의 신선한 CS는 시간이 지남에 따라 박동 활성을 보였지만, 냉동 보존된 CS는 박동 활성을 회복하기 위해 최대 1주일의 배양이 필요했습니다(그림 5B). 해동된 CS와 신선한 CS의 박동률에는 큰 변화가 없었습니다. 그러나 일부 냉동 CS에서는 자발적인 구타 활동이 관찰되지 않았습니다(그림 5C). 신선 CS에 비해 냉동/해동 CS에서 피크 값이 유의하게 감소했지만(그림 5D), 신선 CS와 비교하여 상승 시간, 감쇠 시간 및 냉동/해동 CS의 CTD90에서 유의한 변화가 관찰되지 않았습니다(그림 5E-G). 이러한 데이터는 해동 후 CS가 최소 1주일 동안 인큐베이터에서 회복되도록 하는 것이 중요하다는 것을 나타내며, 그 전에 박동 활동 및 일시적인Ca2+를 측정합니다.

종합하면, 이러한 결과는 hiPSC-CM 유래 스페로이드의 냉동 보존이 심근 세포 생존력, 육종 구조 및 자발적인 박동 활동 및 칼슘 취급과 같은 기능적 특성을 보존한다는 것을 보여줍니다. 따라서 hiPSC-CM 유래 스페로이드는 시험관 내에서 심장 전기생리학을 정확하게 요약하는 데 적합한 모델을 나타냅니다.

그림 1: 심장 스페로이드 생성. (A) Wnt 기반 지시 심장 분화, hiPSC-CM의 후속 확장 및 C 생성의 개략도. biorender.com 로 만들어졌습니다. (B) CS 배양의 다른 시점에서의 명시야 이미지. 스케일 바, 200 μm. Wk는 주를 나타냅니다. (C) 3주 된 CS에서 심장 육종 단백질α-액티닌 및 트로포닌 T에 대한 대표적인 면역형광 이미지. 면역형광: Hoechst(파란색), α-액티닌(녹색) 및 트로포닌 T(빨간색). 스케일 바, 200 μm. 오른쪽의 확대된 병합 그림은 sarcomere 조직을 표시합니다. 스케일 바, 50 μm. (D) CSs 형성 전(0일) 및 3주 후 α-액티닌 양성 세포의 유세포 분석 정량화(조건당 n = 14-23. (E) 90일 동안 배양된 hiPSC-CM에 대해 RT-qPCR(2D)을 수행하고 42일 동안 배양된 스페로이드 샘플에서 수행하여 세포 접합부, 중간 필라멘트 및 미토콘드리아와 관련된 다양한 심장 유전자의 발현 수준을 확립합니다. (n = 1-3 배치). 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. NS(유의하지 않음)는 짝을 이루지 않은 t-검정에 의해 계산됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 생성 후 다른 주에 CS의 박동률 및 칼슘 처리. (A) Cyteseer Software의 Vala sciences 분석 알고리즘에 의해 계산된 칼슘 과도 파라미터의 예. (B) 생성 후 다른 시점(주)에서 CS의 대표적인 칼슘 과도 흔적 및 타임랩스 이미지. 스케일 바, 200 μm. (C) 자발적 박동 활동의 시간 경과 정량화는 구타 CS의 백분율로 표현됩니다. (D) 배양 시간 동안 CS의 박동 속도. (E-H) 피크 값, 상승 시간, 붕괴 시간 및 CTD90을 보여주는 칼슘 과도 현상의 정량화. 표시된 데이터는 평균 ± SD입니다. 생물학적 복제 = 3, 기술 복제 = 각각 38, 50, 66 및 7. *p < 0.05, ****p < 0.001; 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 사후 다중 비교 테스트. 약어; CTD = 칼슘 과도 기간, Wk = 주, CSs = 인간 심장 스페로이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 서로 다른 세포 파종 밀도를 사용하여 생성된 CS의 박동률 및 칼슘 처리. (A) 서로 다른 수의 hiPSC-CM을 사용하여 생성된 CS의 명시야 이미징(왼쪽) 및 크기 측정(오른쪽). 스케일 바, 200 μm. (B) 2.5K-20K-CS의 대표적인 칼슘 과도 추적 및 타임랩스 이미지. (씨, 디) 2.5K-20K-CS의 박동 비율 및 박동 비율. (E-H) 2.5K-20K-CS의 피크 값, 상승 시간, 감쇠 시간 및 CTD90. 데이터는 평균± SD입니다. 생물학적 복제 = 3, 기술 복제 = 28-39. *p < 0.05, ****p < 0.001; 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 사후 다중 비교 테스트. 약어: CTD = 칼슘 과도 기간, Wk = 주, k = x 1,000개 세포, CS = 심장 스페로이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4. 냉동보존이 심장 스페로이드의 생존력과 구조에 미치는 영향. (A) CS 생성, 후속 바이오뱅킹 및 해동의 개략도. (B) 신선 및 냉동보존된 CS에서 유세포 분석 세포 생존율 테스트. 양성 대조군으로서 5분 동안 10% Triton-X 용액으로 처리한 것을 사용하였다. (조건당 n = 4). 데이터는 평균 ± SD로 표시된다. ****p < 0.001; 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 사후 다중 비교 테스트. (C) 배양 7일 후 신선 CS와 해동된 CS에서의 Calcein-AM 세포 생존율 테스트(조건당 n = 15-17, ****p < 0.001, paired t-test; 스케일 바, 200μm). (D) 신선하고 해동된 CS에서 α-액티닌 및 트로포닌 T 발현에 대한 대표적인 명시야(왼쪽) 및 면역형광 염색. 면역형광: Hoechst(파란색), α-액티닌(녹색) 및 트로포닌 T(빨간색). 오른쪽의 병합된 그림은 CS의 sarcomere 줄무늬를 표시합니다. 스케일 바, 50 μm. 약어: X = 해동일 선택, PI = 요오드화 프로피듐, Cal-AM = 칼세인-AM, EthD-I = 에티듐 호모다이머 I. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 신선 CS와 해동된 CS의 칼슘 과도 현상. (A) 냉동 보존 전과 해동 후 1주일 CS의 대표적인 칼슘 과도 상태 및 시간 경과 이미지. (B) 신선 및 냉동/해동된 심장 스페로이드의 박동 비율. 막대는 개별 실험을 나타냅니다. (C) 신선 및 냉동/해동된 심장 스페로이드의 박동률. (D-G) 칼슘 과도 매개변수의 정량화: 피크 값, 상승 시간, 붕괴 시간 및 CTD90. 데이터는 SD± 평균입니다. *p < 0.05, ****p < 0.001; 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 사후 다중 비교 테스트. 약어; CTD = 칼슘 과도 기간, CSs = 심장 스페로이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 유세포 분석을 위한 대표적인 게이팅 전략. (A) 순수 모집단에서 α-액티닌 양성 hiPSC-CM에 대한 대표적인 게이팅 전략 대 음성 대조군 및 동형 대조군. α-액티닌 양성 분석 세포의 수는 25 x 105입니다. 약어; SSC = 측면 산란, PI+ = 프로피듐 요오드화물 양성. (B) 신선, 해동, 양성 대조군(Triton-X) 및 음성 대조군(염색되지 않음) 모두에서 생존력 분석을 위한 대표적인 게이팅 전략. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개 할 것이 없습니다.