현재 논문에서는 마우스 세 번째 중족골의 조직 수준 기계적 부하에 대한 반응으로 생체 내에서 내장된 골세포의 기계적으로 유도된 칼슘 신호를 실시간으로 관찰하기 위해 생체 내 이미징 접근 방식을 수행하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
뼈 조직은 기계적 하중 크기의 차이에 매우 민감합니다. 뼈 전체에 세포융합을 형성하는 수지상 세포인 골세포(osteocyte)는 뼈 조직의 기계 감각 기능을 담당합니다. 조직학, 수학적 모델링, 세포 배양 및 생체 외 뼈 장기 배양을 사용하는 연구는 골세포 기계생물학에 대한 이해를 크게 발전시켰습니다. 그러나 골세포가 생체 내 분자 수준에서 기계적 정보에 어떻게 반응하고 인코딩하는지에 대한 근본적인 질문은 잘 이해되지 않았습니다. 골세포의 세포 내 칼슘 농도 변동은 급성 뼈 기계 전달 메커니즘에 대해 더 많이 배울 수 있는 유용한 표적을 제공합니다. 여기에서는 골세포에서 발현되는 형광 유전자 인코딩 칼슘 지표와 마우스 균주를 in vivo loading and imaging system과 결합하여 로딩 중 골세포 칼슘 수치를 직접 감지하는 in vivo osteocyte mechanobiology를 연구하는 방법을 보고합니다. 이는 살아있는 마우스의 제3 중족골에 잘 정의된 기계적 부하를 전달하는 동시에 이광자 현미경을 사용하여 골세포의 형광 지시 칼슘 반응을 모니터링할 수 있는 3점 굽힘 장치를 통해 달성됩니다. 이 기술은 전체 뼈 부하에 대한 반응으로 골세포 칼슘 신호 전달 이벤트를 직접 생체 내에서 관찰할 수 있게 해주며 골세포 기계생물학에서 메커니즘을 밝히려는 노력에 유용합니다.
서론
뼈 매트릭스는 기계적 요구량 1,2에 따라 조직되어 있으며 기계적 요구 사항의 변화 3,4,5를 고려하여 동적으로 변화할 수 있습니다. 뼈의 기계감각 메커니즘에 관한 획기적인 연구는 약 30년 전에 모델링 논문으로 발표되었으며, 6,7,8 뼈 내에 내장된 골세포는 국소 환경에서 유체 이동을 통해 조직 수준의 기계적 변형을 감지한다고 제안되었습니다. 이 모델은 시험관 내 및 생체 외 실험을 통해 실험적으로 검증되었으며, 여기서 골세포는 매우 기계적으로 민감하며(1,2,3,4,5,6
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프로토콜
모든 방법은 코넬 대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.
1. 재료 및 장비 준비
- 오버헤드 다광자 현미경과 함께 사용할 중족골 로딩 장치를 설계하고 제작합니다.
참고: 구성 요소 사양 및 장치 작동에 대한 세부 사항은 이전 연구25의 보충 문서에 설명되어 있습니다. 간단히 말해서, 주요 구성 요소는 로드셀과 로딩 브래킷이 있는 직렬의 액추에이터, 수조 및 지점점 핀으로 구성됩니다. 액추에이터와 로드셀은 상업적으로 구할 수 있으며 최대 300g의 하중을 수용할 수 있어야 합니다. 수조, 받침점 핀 및 하중 브래킷은 티타늄 또는 스테인리스강으로 구성되어야 합니다. 사내에서 제작하거나 3D 금속 프린팅 을 통해 상업적으로 제작할 수 있습니다. - 개별 마우스 그룹(즉, 성별, 처리, 유전자형)에 대해 사전에 액추에이터 변위에 대한 변형률 크기 값을 보정합니다. 이는 이전 연구25에서 설명한 절차에서 표면 변형률 매핑을 사용하여 수행됩니다....
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결과
여기에서는 급성 수술 준비 및 다광자 형광 이미징을 사용하여 생체 내에서 내장된 골세포의 칼슘 신호 전달을 연구하는 방법론을 보고합니다. 녹색 형광 신호는 DMP1-Cre 발현 을 통해 골세포의 유전적으로 암호화된 칼슘 지표에서 관찰할 수 있습니다. 그림 4 는 포매된 골세포의 단일 평면 이미지입니다. 모든 세포에는 라벨링이 되어 있고 baseline green fluorescence를 발현하므로 실험적 관찰을 위한 후보 물질을 쉽게 찾을 수 있습니다. 세포체는 명확하게 볼 수 있으며, 때때로 세포 과정을 만들 수 있습니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 뼈 내벽 세포는 DMP1-Cre 발현에 의해 유도되는 GCaMP6f 구조체를 발현하지 않습니다. 골세포는 뼈 기질에 유일하게 내장된 세포로, DMP1을 발현할 수 있는 다른 세포(예: 근육 세포)를 쉽게 식별하고 구별할 수 있습니다.
이 시스템.......
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토론
골세포는 경조직 기질(hard tissue matrix)에 박혀 있는 위치 때문에 실험적으로 연구하기 어려우며, 이 틈새가 제거되면 빠르게 악화되거나 역분화됩니다. 지난 30년 동안 골세포를 연구하기 위해서는 골세포와 유사한 계통(line)을 만드는 것 29,30,31, 일차 골세포를 분리하기 위한 프로토콜의 수립32,33, 심지어 잠재적으로 감소할 수 있는 골세포의 형광 반응을 시각화하기 위해 안락사 직후 절개된 뼈를 장전하려는 노력16 등 엄청난 독창성이 필요했습니다. 이미 수많은 연구에서 칼슘 신호전달 13,1.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| #3 핸들 메스 | 전자 현미경 과학 | 72040-03 | 수술 용품 |
| 20x 수침 대물렌즈 | Olympus | XLUMPLFLN20XW | 이것은 20x 대물렌즈이지만 이 프로토콜에는 40x도 사용할 수 있습니다. 이미징 중에 욕조에 담가야 하므로 야외 대물렌즈가 수차를 유발할 수 있으므로 물에 담그는 것이 좋습니다. |
| AM Bickford Omnicon F/AIR | AM Bickford | 80120 | 수술실의 마취 가스 문제에 대한 현명한 해답인 F/AIR 마취 가스 필터는 Isoflurane과 같은 폐마취 가스를 제거하도록 특별히 설계되었습니다. 수술실 환경의 할로탄, 엔플루란 등. |
| AM 빅포드 옴니콘 F/AIR 키트 | AM Bickford | 80000 | F/AIR를 B6J 설정에 연결하기 위한 튜브와 어댑터가 포함된 전체 키트 |
| 입니다. Cg-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/MwarJ | 잭슨 연구소 | 28865 | GCaMP6f Dmp1-Cre 마우스 B6N과의 교배를 위한 마우스 |
| . FVB-Tg(Dmp1-cre)1Jqfe/BwdJ | 잭슨 연구소 | 23047 | GCaMP6f 마우스와의 교배를 위한 Dmp1-Cre 마우스 |
| 로드셀 | FUTEK Advanced Sensor Technology, Inc. | 905898 | LCM100 , 1000 g , 초소형 인장 및 압축 로드셀(소형/인라인 스레드), RoHS 무연, 재질 - 17-4 PH S.S. , M3x0.5 스레드, 34 Awg 4 도체 편조 폴리에스테르 케이블, 5피트 길이 |
| Corning 500 mL DPBS(Dulbecco's phosphate buffered 식염수), 1x [+] 칼슘, 마그네슘 | VWR International | 21-030-CV | 칼슘을 함유한 이온 균형 수조는 이미징 |
| 중에 중족골을 잠깁니다.치과 선택 도구 | 전자 현미경 과학 | 수술 용품 | |
| 에틸 알코올 순수 200 프루프 ACS 시약>99.5% | Sigma Aldrich | SIAL-459844-500ML | 살균 목적 |
| Fulcrum 핀 | Fathom | N/A | 3D SolidWorks STL 파일에서 스테인리스강(PH1 합금)의 직접 3D 레이저 소결로 제작되었습니다. 원래 공급업체는 GPI Prototype & 현재 FATHOM에 인수된 Manufacturing Services, Inc.의 사양은 이전에 게시된 문서 |
| 해상도 및 고속 USB220 출력 키트 | FUTEK Advanced Sensor Technology, Inc. | 717435 | 셀을 랩톱에 연결하는 데 사용 |
| Java 1.8.0_172(Windows 64비트용)가 포함된 ImageJ 1.53tNIH | N/A | 여기에 설치 https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | 66794-013-25 | 100% 흡입 증기 액체 |
| 로딩 브래킷 | Fathom | N/A | 3D SolidWorks STL 파일에서 스테인리스강(PH1 합금)의 직접 3D 레이저 소결로 제작되었습니다. 원래 공급업체는 GPI Prototype & 현재 FATHOM에 인수된 Manufacturing Services, Inc의 사양은 이전에 게시된 문서 |
| MATLAB R2019a | MathWorks | 딩 장치 실행용 | |
| Matrx VIP 3000 기화기 웰 필 이소플루란 | Butler Schein Animal Health | 14309 | 취제용 기화기 |
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| 날카롭고 미세한 팁이 있는 스테인리스 스틸 핀셋. 길이: 120mm | 전자현미경 Sciences | 78326-42 | 수술 용품 |
| Thorlabs Bergamo 다광자 현미경 | ThorLabs | N/A | ThorLabs는 원하는 경우 레이저 옵션을 제공하지만 이미징 시스템일 뿐이며 레이저가 포함되어 있지 않습니다 |
| . 티타늄-사피어 카멜레온 디스커버리 NX 토탈 파워 컨트롤(TPC)이 포함됨 | 코히어런트 | N/A | 이 시스템에는 기술적으로 조정 가능한 레이저와 고정 레이저의 두 가지 레이저가 있습니다. 그러나 프로토콜의 경우 조정 가능한 항목만 필요합니다. |
| Vannas 스프링 가위 - 4mm 최첨단 | Fine Science Tools | 15018-10 | 수술 용품 |
| 수조 | Fathom | N/A | 3D SolidWorks STL 파일에서 스테인리스강(PH1 합금)의 직접 3D 레이저 소결로 제작되었습니다. 원래 공급업체는 GPI Prototype & 현재 FATHOM에 인수된 Manufacturing Services, Inc의 사양은 이전에 게시된 문서에 제공됩니다 |
참고문헌
- Lu, X. L., Huo, B., Park, M., Guo, X. E. Calcium response in osteocytic networks under steady and oscillatory fluid. Bone. 51 (3), 466-473 (2012).
- Wu, D., Schaffler, M. B., Weinbaum, S., Spray, D. C.
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재인쇄 및 허가
