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방법 논문

차 샘플에서 Pyrrolizidine 알칼로이드 오염의 출처 및 경로

2.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/64375

⸱

2022년 9월 28일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Agri-food Safety of Anhui Province, School of Resource & Environment, Anhui Agricultural University, 2State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, School of Tea and Food Science & Technology, Anhui Agricultural University, 3Key Laboratory of Tea Quality and Safety & Risk Assessment, Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Ministry of Agriculture, 4Department of Molecular Biosciences and Bioengineering, University of Hawaii at Manoa

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 차밭에서 PA를 생산하는 잡초의 차 샘플에서 피롤리지딘 알칼로이드(PA)의 오염을 설명합니다.

초록

독성 피롤리지딘 알칼로이드(PA)는 차 샘플에서 발견되어 인체 건강에 위협이 됩니다. 그러나 차 샘플에서 PA 오염의 원인과 경로는 불분명하다. 이 연구에서는 UPLC-MS/MS와 결합된 흡착 방법을 개발하여 잡초 Ageratum conyzoides L., A. conyzoides rhizospheric 토양, 신선한 찻잎 및 말린 차 샘플에서 15개의 PA를 측정했습니다. 평균 회수율은 78%-111% 범위였으며 상대 표준 편차는 0.33%-14.8%였습니다. 중국 안후이성의 진자이 차밭에서 15쌍의 A. conyzoides 및 A. conyzoides 근권 토양 샘플과 60개의 신선한 찻잎 샘플을 수집하여 15개의 PA에 대해 분석했습니다. 중간중간-N-옥사이드(ImNO)와 세네시오닌(Sn)을 제외하고 신선한 찻잎에서 15개의 PA가 모두 검출된 것은 아닙니다. ImNO(34.7μg/kg)의 함량은 Sn(9.69μg/kg)보다 컸습니다. 또한, ImNO와 Sn은 모두 차 나무의 어린 잎에 집중되어 있었고, 그 함량은 오래된 잎에서 더 낮았다. 결과는 차의 PA가 차밭에서 PA를 생산하는 잡초-토양-신선한 찻잎의 경로를 통해 옮겨진 것으로 나타났습니다.

서론

2차 대사산물인 피롤리지딘 알칼로이드(PA)는 초식동물, 곤충, 병원균으로부터 식물을 보호한다 1,2. 지금까지 전 세계적으로 6,000종 이상의 식물 종에서 서로 다른 구조를 가진 660개 이상의 PA와 PA-N-산화물(PANO)이 발견되었습니다 3,4. PA 생산 식물은 주로 국화과, 보라기과, 파바과, 아포시나과에서 발견됩니다 5,6. PA는 불안정한 디하이드로피롤리지딘 알칼로이드로 쉽게 산화되는데, 이는 강한 친전자성을 가지며 DNA 및 단백질과 같은 친핵체를 공격하여 간세포 괴사, 정맥 폐색, 간경변, 복수 및 기타 증상을 유발할 수 있습니다 7,8. PA 독성의 주요 표적 기관은 간입니다. PA는 또한 폐, 신장 및 기타 장기 독성과 돌연변이 유발 성, 발암 성 및 발달 독성을 유발할 수 있습니다 9,10.

PA가 함유된 전통 허브, 보충제 또는 차의 섭취 또는 우유, 꿀 또는 육류와 같은 식품의 간접적인 오염(PA가 포함된 목초지 섭취로 인한 독성)으로 인해 많은 국가에서 인간 및 동물 중독 사례가 보고되었습니다.11,12,13. 유럽식품안전청(EFSA)의 조사 결과에 따르면 (허브) 차와 같은 물질은 인체가 PA/PANO에 노출되는 중요한 원인이다14. 차 샘플은 PA를 생산하지 않는 반면, PA 생산 식물은 일반적으로 차밭에서 발견됩니다(예: Emilia sonchifolia, Senecio angulatus 및 Ageratum conyzoides)15. 이전에는 차가 수확 및 가공 중에 생산 공장의 PA로 오염될 수 있다고 의심되었습니다. 그러나 일부 손으로 딴 찻잎(즉, PA 생산 식물이 없음)에서도 PA가 검출되어 다른 경로나 오염원이 있어야 함을 시사한다16. 돼지풀(Senecio jacobaea)과 멜리사(Melissa officinalis), 페퍼민트(Mentha piperita), 파슬리(Petroselinum crispum), 카모마일(Matricaria recutita), 한련(Tropaeolum majus)의 공동 재배 실험을 실시한 결과, 이들 식물 모두에서 PA가 검출되는 것으로 나타났다17. PA는 실제로 토양18,19를 통해 살아있는 식물간에 전달되고 교환되는 것으로 확인되었습니다. Van Wyk et al.20은 루이보스 차(Aspalathus linearis)가 잡초가 풍부한 지역에서 심하게 오염되었으며 동일한 유형과 비율의 PA를 함유하고 있음을 발견했습니다. 그러나 잡초가 없는 지역의 루이보스 차에서는 PA가 검출되지 않았습니다.

현재 선택성과 감도가 높은 초고성능 액체 크로마토그래피 탠덤 질량분석법(UPLC-MS/MS)은 농산물 및 식품의 PA의 정성 및 정량 분석에 널리 사용되었습니다21,22. 시료 처리 방법은 일반적으로 고체상 추출법(SPE) 또는 복합 식품 매트릭스 추출물의 QuEChERS(Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe) 세척으로 구성되며, 이는 가능한 가장 높은 감도12,19를 얻을 수 있습니다. 그러나 토양, 잡초 및 신선한 찻잎과 같은 복잡한 매트릭스에서 PA를 검출하고 정량화할 수 있는 강력한 분석 방법은 여전히 부족합니다.

이 연구는 흡착제 정제 방법과 결합된 UPLC-MS/MS를 사용하여 말린 차 샘플, 신선한 찻잎, 잡초 및 잡초 근권 토양 샘플에서 15개의 PA를 분석했습니다. 또한, 중국 안후이성 진자이 차밭의 5개 샘플링 장소에서 15쌍의 잡초 및 잡초 뿌리권 토양 샘플과 60개의 신선한 찻잎 샘플을 수집하여 15개의 PA에 대해 분석했습니다. 이러한 결과는 차의 품질과 안전성을 보장하기 위해 차 샘플에서 PA(오염)의 출처 및 경로에 대한 조사 방법과 일부 정보를 제공할 수 있습니다.

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프로토콜

본 연구를 위해 다음과 같은 잡초 종을 수집하였다: Ludwigia prostrata Roxb., Murdannia triquetra (Wall. ex C. B. Clarke) Bruckn., Ageratum conyzoides L., Chenopodium ambrosioides, Trachelospermum jasminoide (L.) Lem., Ageratum conyzoides L., Emilia sonchifolia (L.) DC, Ageratum conyzoides L. 및 Crassocephalum crepidioides (벤스.) S. 무어. 신선한 찻잎은 다양한 Longjing 43# 차나무에서 채취했으며, 건조된 차 샘플은 녹차 제조 공정에 따라 가공된 시판되는 차였습니다(재료 표 참조).

1. 시료 채취

  1. 40개의 실제 샘플을 수집합니다.
    1. 여러 차밭에서 무작위로 잡초 10개, 흙 10개, 신선한 찻잎 10개를 수집하세요.
      참고: 본 연구를 위해 토양을 20cm 깊이에서 샘플 양 200g으로 샘플링했습니다.
    2. 슈퍼마켓에서 10 개의 말린 차 제품 (250g)을 무작위로 수집하십시오.
  2. 잡초, 토양 및 신선한 찻잎 샘플을 수집하여 차에 있는 PA의 오염원을 연구합니다.
    1. 동일한 차밭에 5개의 표본 추출 점을 설정하고 각 점에 3번의 반복실험을 실시합니다.
    2. 차밭에서 흔히 볼 수 있는 PA 함량이 가장 높은 Ageratum conyzoides L. 잡초 샘플을 수집합니다.
      참고: 본 연구를 위한 샘플 양은 250g이었습니다.
    3. 토양 샘플을 수집합니다.
      참고: 토양 샘플은 A. conyzoides 뿌리 줄기 토양 깊이 20cm, 샘플 양은 200g입니다.
    4. 두 개의 잎을 가진 하나의 새싹, 세 개의 잎을 가진 하나의 새싹, 네 개의 잎을 가진 하나의 새싹 및 성숙한 잎을 포함하여 차나무의 다른 부분에서 신선한 찻잎을 수집하십시오.
      참고: 샘플 양은 250g이었습니다.

2. 샘플 처리

  1. 아래 단계에 따라 샘플을 전처리하십시오.
    1. 건조 된 차 및 토양 샘플을 분쇄기로 분쇄하고 분쇄 된 샘플을 200 메쉬 체에 통과시키고 -20 °C에서 보관합니다.
      참고: 말린 차는 시중에서 판매되는 차 제품( 재료 표 참조)이므로 저장을 위해 직접 분쇄하고 체질했습니다. 토양 샘플(200 g)을 약 1주일 동안 공기 건조시키기 위해 어두운 곳에서 통풍이 잘 되는 곳에 두었다.
    2. 잡초와 신선한 찻잎을 균질화기로 균질화하고 -20 °C에서 보관하십시오.
  2. 말린 차 제품, 신선한 찻잎 및 잡초의 샘플 처리를 수행합니다.
    1. 각 샘플(말린 차 제품, 신선한 찻잎 및 잡초) 1.00g의 무게를 측정하여 50mL 원심분리기 튜브에 넣습니다.
    2. 10 mol/L 황산 용액 0.1mL를 넣고 고체상 추출(SPE 카트리지 사용, 재료 표 참조)을 위해 2분, 흡착제 정제를 위해 1분 동안 와류합니다. 초음파 추출23 을 15 분 동안 수행 한 다음 실온에서 9,390 x g 의 속도로 10 분 동안 원심 분리합니다.
      참고: 초음파 발진기의 전력은 290W, 발진 주파수는 35kHz, 온도는 30°C로 설정되었습니다.
    3. 상층액을 플라스틱 팁 스포이드가 있는 50mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
    4. 위의 단계에 따라 추출을 한 번 반복하십시오. 두 상청액을 결합하십시오.
      1. 메탄올 5mL와 탈이온수 5mL로 SPE 카트리지를 활성화합니다. 사전 활성화된 카트리지에 10mL의 상청액을 추가하고 샘플 청소를 수행합니다.
      2. 샘플 용액 레벨이 카트리지의 상부 층에 도달한 후 5mL의 1% 포름산 용액과 5mL의 메탄올로 분석물을 용리합니다. 용리액을 폐기합니다.
      3. 5mL의 메탄올(0.5% 암모니아수 함유)로 용리하고, 0.22μm 멤브레인 필터를 통해 용리액을 여과하고, UPLC-MS/MS로 분석합니다( 재료 표 참조).
    5. 흡착제를 사용하여 시료 청소를 수행합니다.
      1. 상층액 2mL(단계 2.2.4)를 GCB:PSA:C10(10mg:20mg:15mg, 재료 표 참조)의 흡착제로 채워진 10mL 원심분리기 튜브에 넣고 1분 동안 와동하고 실온에서 9,390 x g 에서 8분 동안 원심분리합니다.
      2. UPLC-MS/MS로 분석하기 전에 0.22μm 멤브레인 필터를 통해 상층액 1mL를 통과시킵니다.
  3. 토양 샘플의 처리를 수행하십시오.
    1. 토양 샘플 1.00g의 무게를 잰다. 50mL 원심분리기 튜브에 넣고 0.1mL의 0.1mol/L 시트르산삼나트륨 용액( 재료 표 참조)을 추가하여 토양 pH 값을 6.0으로 조정합니다.
    2. 2 분 동안 방치 한 다음 0.1 mol / L 황산 메탄올 용액 10mL를 넣고 2 분 동안 소용돌이 치고 30 분 동안 흔들어 30 분 동안 초음파 추출을 수행합니다.
    3. 9,390 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 플라스틱 팁 스포이드가 있는 50mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
    4. 위의 단계에 따라 추출을 반복하고 상청액을 두 번 결합합니다.
      참고: 정제 방법은 단계 2.2.5.1 및 단계 2.2.5.2와 동일하였다.

3. 기기 분석

  1. 시중에서 판매되는 UPLC-MS/MS 시스템(2.1mm x 100mm, 1.8μm)을 사용하여 말린 차 샘플, 신선한 찻잎, 잡초 및 토양(2단계 샘플)에서 15개의 PA를 검출합니다( 재료 표 참조).
  2. 컬럼 온도를 40°C로, 유속을 0.250mL/분으로, 주입량을 3μL로 설정합니다.
  3. 이동상 A: 메탄올(0.1% 포름산 + 1mmol/L 포름산암모늄 함유) 및 이동상 B: 물(0.1% 포름산 + 1mmol/L 포름산암모늄 함유)을 설정합니다.
  4. 그래디언트 용리 절차 설정: 0.0분에서 0.25분까지 10%A, 0.25분에서 6.0분까지 10%-30% A, 6.0분에서 9.0분까지 30%-40% A, 9.0분에서 9.0분까지 40%-98% A를 1.9분 동안 유지, 11.0분에서 11.1분까지 98%-100% A를 2.9분 동안 유지했습니다.
  5. 질량 분석기 매개변수 설정: 이온화 모드, 전기 분무 양이온 소스(ESI+); 분무기 압력, 7.0 bar; 모세관 전압, 4.0 kV; 테이퍼 구멍 백 블로잉 흐름, 150 L/h; 용매 가스 흐름, 800 L/h; 용해 온도, 400°C; 충격 가스 흐름, 0.25mL/분

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결과

말린 차 시료, 신선한 찻잎, 잡초 및 토양에서 15PA의 최적화된 흡착제 정제 및 분석 방법을 확립하고 SPE 카트리지를 사용하여 일반적으로 사용되는 정제 방법과 비교했습니다. 그 결과 SPE 카트리지를 사용한 말린 차 샘플, 잡초 및 신선한 찻잎에서 15개의 PA의 회수율은 72%-120%인 반면 흡착제 정제를 사용한 것은 78%-98%인 것으로 나타났습니다(그림 1). 흡착제 정화를 사용한 토양에서 15개의 PA의 회수율은 79%-111%였습니다(그림 1). 40개의 실제 샘플을 무작위로 수집하여 두 가지 클린업 방법을 비교하기 위해 PA의 함량을 검출했습니다(보충 표 1-7). 헬리오트린(He)은 1.3-22 μg/kg의 함량으로 흡착법을 사용하여 10개의 건조 차 샘플 모두에서 검출된 반면, 1.8-24.6 μg/kg의 함량...

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토론

현재 연구는 차 샘플에서 PA의 오염 경로와 출처를 탐색하고 차 식물의 다른 부분에서 PA의 분포를 탐색하는 효과적이고 민감한 방법을 개발하도록 설계되었습니다. 그러나 이 연구에서는 크로마토그래피 컬럼에서 15개의 PA만이 성공적으로 분리되었으며, 이는 식물 종 3,4의 많은 수의 알칼로이드에 비해 매우 적은 수입니다. 이것은 컬럼 자체의 패킹 특성뿐만 아니라 검사된 차 샘플의 복잡한 매트릭스와도 관련이 있습니다. 따라서 다중 PA를 검출하기 위한 더 나은 분리 및 정제 방법은 여전히 추가 탐색이 필요합니다.

SPE 카트리지 및 흡착제 방법은 다양한 샘플 매트릭스에서 다중 PA를 검출하기 위해 적용되었지만 차의 복잡한 매트릭스에서는 흡착 방법이 보고되지 않았습니다24. 따라서 이 연구에서는 GCB:PSA:C18(10mg:20mg:15...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 중국 국립 자연 과학 재단 (32102244), 국가 농산물 품질 및 안전 및 위험 평가 프로젝트 (GJFP2021001), 안후이 성 자연 과학 재단 (19252002) 및 USDA (HAW05020H)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세토니트릴 (99.9%)Tedia Company, Inc.21115197CAS No:75-05-8
암모니아(25%-28%)Wuxi Zhanwang 화학 시약 Co., Ltd.181210CAS No:1336-21-6
Ammonium formate (97.0%)Anpel Laboratory Technoiogies (shanghai)G0860050CAS No:540-69-2
Carbon-GCBCNWB7760030120-400 MESH, 10g. 상자당 
원심분리기 Z 36 HKHERMLEZ36HK30000  rpm(최소:10rpm), 치수(W x H x D):  71.5 cm× 42cm &시간; 51cm
시판차 제품Lvming, Qingshan, Luyuchun, Changling, Huixing, Wuyunjian, Heshengchunloose tea녹차
Europine N-oxid (EuNO) (98.0%)BioCrick323256CAS No:65582-53-8
Europine (Eu) (98.0%)BioCrick98222CAS No:570-19-4
Formate (98.0%)AladdinE2022005CAS No:64-18-6
HC-C18CNWD211006040-63 μ m,100g.per
box 헬리오트린(He) (98.0%)BioCrick906426CAS No:303-33-3
Heliotrine-N-oxide (HeNO) (98.0%)BioCrick22581CAS No:6209-65-0
고속 원심분리기 TG16-WScence203158000Max:16000 r/min, 330 × 390 × 300 mm (L × W &타임스; H), 수용량: 6 × 50 mL
HSS T3 컬럼Waters186004976ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 × 100 mm 1.8 μ m)
인터메딘(Im) (98.0%)BioCrick114843CAS No:10285-06-0
인터메딘-N-옥사이드(ImNO) (98.0%)BioCrick340066CAS No:95462-14-9
자코빈(Jb) (98.0%)BioCrick132282048CAS No:6870-67-3
자코빈-N-옥사이드(JbNO) (98.0%)ChemFacesCFN00461CAS No:38710-25-7
메틸알코올 (99.9%)테디아 컴퍼니, Inc.21115100CAS No:67-56-1
PSA아겔라P19-0083340-60 μ m, 60 Å 100g.per
box Retrorsine (Re) (98.0%)BioCrick5281743CAS No:480-54-6
Retrorsine-N-oxide (ReNO) (98.0%)BioCrick5281734CAS No:15503-86-3
Senecionine (Sc) (98.0%)BioCrick5280906CAS No:130-01-8
Senecionine-N-oxide (ScNO) (98.0%)BioCrick5380876CAS No:13268-67-2
Seneciphylline N-oxid (SpNO) (98.0%)BioCrick6442619CAS No:38710-26-8
Seneciphylline (Sp) (98.0%)BioCrick5281750CAS No:480-81-9
Senkirkine (Sk) (98.0%)BioCrick5281752CAS No:2318-18-5
SPE PCXAgilent Technologies12108206양이온 혼합 모드, 6 mL
황산(97%)Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. 1003019CAS No:7664-93-9
Trisodium citrateSinpharm 화학 시약 Co., Ltd.20121009CAS No:6132-04-3
초음파 세척기SupmileKQ-600B내부 슬롯 크기: 500 > 300 > 150 mm; 용량: 22.5 L
UPLC-xevoTQMSWatersZPLYY-003트리플 4단계 로드 질량 분석기, Waters Alliance 2695/Waters ACQUITY UPLC 액상 시스템
수조 온도조절기 발진기Guoyu 기기SHY-2AHS진동 시간:  60-300회/분, 일정한 온도 범위: 실온 100°C; 씨

참고문헌

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