Method Article

인테그린 억제 약물 스크리닝을 위한 유세포 분석 기반 고처리량 기법

DOI:

10.3791/64401

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February 2nd, 2024

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1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Center for Molecular Discovery, University of New Mexico Health Sciences Center, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 4Department of Pathology, University of New Mexico Health Sciences Center, 5Autophagy, Inflammation, & Metabolism (AIM) Center, University of New Mexico

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 인간 호중구에서 β2 인테그린 활성화를 억제하는 저분자 약물을 식별하기 위한 유세포 분석 기반의 고처리량 스크리닝 방법을 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 구조적 변화 보고 항체 및 고처리량 유세포 분석을 활용하여 β2 인테그린 활성화의 소분자 길항제를 식별하는 방법을 확립하는 것을 목표로 합니다. 이 방법은 또한 다른 항체 기반 고처리량 스크리닝 방법에 대한 가이드 역할을 할 수 있습니다. β2 인테그린은 면역 반응에 중요한 백혈구 특이적 접착 분자입니다. 호중구는 혈류를 빠져나가기 위해 인테그린 활성화에 의존하며, 감염과 싸울 뿐만 아니라 여러 염증성 질환에도 관여합니다. β2 인테그린 활성화를 조절하는 것은 호중구 관련 염증성 질환을 치료하기 위한 실행 가능한 접근법을 제시합니다. 이 프로토콜에서는 β2 인테그린의 고친화성 헤드피스에 특이적으로 결합하는 단클론 항체인 mAb24를 사용하여 분리된 1차 인간 호중구에서 β2 인테그린 활성화를 정량화합니다. N-포르밀메티오닐-류실-페닐알라닌(fMLP)은 호중구 β2 인테그린을 활성화하기 위한 자극제로 사용됩니다. 이 연구에서는 384웰 플레이트 샘플을 자동으로 실행할 수 있는 고처리량 유세포 분석기를 사용했습니다. β2 인테그린 억제에 대한 320가지 화학 물질의 효과는 3시간 이내에 평가됩니다. β2 인테그린을 직접 표적으로 하는 분자 또는 G 단백질 결합 수용체 개시 인테그린 인사이드-아웃 활성화 신호 경로에서 분자를 표적으로 하는 분자는 이 접근법을 통해 식별할 수 있습니다.

Introduction

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많은 염증성 질환은 부종이나 부상 부위에 호중구가 침윤하는 것이 특징이다1. 이러한 조직에 침투하기 위해 호중구는 내피에 대한 체포, 혈관 벽을 통한 유출 및 조직 내로의 모집을 포함하는 호중구 모집 캐스케이드를 완료해야 합니다2. 순환 호중구는 특히 정지 단계에서 이 캐스케이드를 완료하기 위해 β2 인테그린 활성화가 필요합니다. 따라서 호중구 부착, 외래 및 모집을 감소시키는 인테그린 억제 약물은 염증성 질환을 효과적으로 치료할 수 있습니다 3,4.

β2 인테그린은 이전에도 염증성 질환의 표적이 된 적이 있습니다. 인테그린 αLβ2를 직접 표적으로 하는 단클론 항체인 에팔리주맙(Efalizumab)은 건선5를 치료하기 위해 개발되었습니다. 그러나 에팔리주맙은 JC 바이러스 재활성화로 인한 진행성 다발성 백질뇌병증이라는 치명적인 부작용으로 인해 철회되었다 6,7. 새로운 항염증 인테그린 기반 요법은 부작용을 최소화하기 위해 백혈구의 항감염 기능을 유지하는 것을 고려해야 합니다. 에팔리주맙의 부작용은 혈류 내 단일클론항체의 장기적 순환으로 인해 발생할 수 있으며, 이는 장기적으로 면역 기능을 저해할 수 있다8. 최근 연구에 따르면 에팔리주맙은 αLβ2 교차결합과 α4 인테그린의 원치 않는 내재화를 매개하여 부작용에 대한 대안적 설명을 제공한다9. 따라서 수명이 짧은 저분자 길항제는 이 문제를 피할 수 있습니다.

인간 호중구를 사용하여 저분자 β2 인테그린 길항제를 스크리닝하는 고처리량 분석법이 여기에 제시되어 있습니다. β2 인테그린 활성화는 리간드에 접근하고 결합 친화도를 높이기 위해 인테그린 엑토도메인의 구조적 변화를 필요로 합니다. 표준 스위치블레이드 모델에서, 벤트-클로즈드 인테그린 엑토도메인(benent-closed integrin ectodomain)은 먼저 확장-폐쇄 형태(extended-closed conformation)로 연장된 다음, 완전히 활성화된 확장-개방 형태(10,11,12,13)로 그 헤드피스를 개방한다. 구부러진 닫힘에서 구부러진 열림 및 확장 열림으로 시작하여 결국 14,15,16,17,18,19로 시작하는 대체 경로도 있습니다. 형태 특이적 항체 mAb24는 엑토도메인의 헤드피스가 열려 있을 때 인간 β2-I 유사 도메인의 에피토프에 결합합니다(20,21,22,23).

여기서, mAb24-APC는 β2 인테그린의 활성화 여부를 결정하기 위해 사용된다. 호중구와 인테그린을 활성화하기 위해, 호중구 β2 인테그린을 활성화할 수 있는 박테리아 유래 짧은 화학주성 펩타이드인 N-포르밀메티오닐-류실-페닐알라닌(fMLP)이 이 프로토콜에서 자극제로 사용됩니다. fMLP가 호중구의 Fpr1에 결합하면 G-단백질, 포스포리파제 Cβ 및 포스포이노시티드 3-키나아제 γ와 관련된 다운스트림 신호 캐스케이드가 활성화됩니다. 이러한 신호전달 사건은 궁극적으로 인사이드-아웃(inside-out) 신호전달 경로(18,25)를 통해 인테그린 활성화를 초래한다. β2 인테그린에 직접 결합하고 인테그린 활성화26의 구조적 변화를 방지하는 저분자 길항제 외에도, β2 인테그린 인사이드-아웃 활성화 신호 경로의 성분을 억제할 수 있는 화합물도 이 방법으로 검출할 수 있습니다. 자동 유세포 분석기는 고처리량 스크리닝을 가능하게 합니다. 새로운 길항제를 식별하면 인테그린 생리학에 대한 이해를 심화할 수 있을 뿐만 아니라 인테그린 기반 항염증 요법에 대한 중개적 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

헤파린화된 전혈 샘플은 헬싱키 선언의 원칙에 따라 UConn Health의 기관 검토 위원회(Institutional Review Board of UConn Health)에서 승인한 정보에 입각한 동의를 얻은 후 식별되지 않은 건강한 인간 기증자로부터 획득되었습니다. 모든 기증자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 이 연구의 포함/제외 기준은 참가자의 적합성을 보장하고 잠재적 위험을 최소화하기 위해 신중하게 개발되었습니다. 적격 참가자는 18세에서 65세 사이, 모든 인종, 영어에 능통하고 정보에 입각한 동의를 제공할 수 있는 사람이었습니다. 제외된 참가자에는 법적 권한이 있는 대리인이 필요한 사람, 18세 미만 또는 65세 이상의 개인, 수감자 및 임산부와 같이 정보에 입각한 동의를 제공할 수 없는 사람이 포함되었습니다. 또한 참가자들은 항염증제 사용 및 염증 질환이 없어야 했습니다. 현재 감염 또는 진행 중인 만성 또는 급성 염증 상태도 제외 기준이었습니다. 마지막으로, 현재 또는 최근 COVID-19 감염 이력이 있는 개인은 연구에 부적격했습니다. 이러한 기준은 연구 결과에 영향을 미칠 수 있는 잠재적인 교란 요인을 최소화하면서 참가자의 안전과 적합성을 보장하기 위해 고안되었습니다.

1. 시약의 준비

  1. 호중구 배지: 페놀 레드 없이 RPMI-1640에 2% 인간 혈청 알부민을 첨가하여 호중구 배지를 준비합니다( 재료 표 참조).
  2. fMLP 용액: 페놀 레드가 없는 RPMI 1640으로 10mM fMLP 디메틸 설폭사이드(DMSO) 저장 용액( 재료 표 참조)에서 100배 희석하여 fMLP 용액을 준비합니다.
  3. 항체 용액: β2 integrin의 고친화성 형태를 보고하는 알로피코시아닌(APC)-복합 단클론 항체 mAb24(mAb24-APC) 120μL를 호중구 배지 10mL에 희석하여 1.2μg/mL mAb24-APC 용액을 만듭니다.
  4. 화합물 라이브러리: 액체 처리기를 사용하여 384웰 플레이트에서 10mM 라이브러리( 재료 표 참조) 5μL를 DMSO 45μL에 추가하여 초기 화합물 라이브러리를 10mM에서 1mM 농도로 희석합니다. 그 후, 액체 처리기를 사용하여 1mM 화합물 라이브러리의 웰당 5μL를 빈 384웰 플레이트로 옮깁니다.
  5. 그림 1에서 볼 수 있듯이 4개의 컬럼( 1, 2, 23, 24)에는 DMSO만 포함되고 화합물은 포함되지 않아 스크리닝에서 양성 및 음성 대조군 역할을 했습니다. 페놀 레드 없이 45μL의 RPMI-1640을 추가하여 각 웰을 더 희석하여 모든 화합물에 대해 최종 농도가 100μM가 됩니다.

2. 인간 혈액에서 호중구 분리

  1. 혈청학적 피펫을 사용하여 15mL 원심분리 튜브에 시판되는 밀도 구배 배지( 재료 표 참조) 8mL 위에 4mL의 혈액을 조심스럽게 층층합니다(그림 2A).
  2. 20°C에서 30-50분 동안 550× g 에서 혈액을 원심분리합니다. 로터를 점진적으로 감속합니다(감속 계수 1).
    참고: 적혈구에서 호중구( 그림 2B의 밴드 2)를 성공적으로 분리하는 것은 기증자마다 다를 수 있습니다. 대부분의 기증자의 경우 30분의 원심분리로 충분합니다. 그러나 일부 기증자의 경우 분리가 성공하지 못할 경우 추가로 10-30분의 원심분리가 필요할 수 있습니다(그림 2C).
  3. 플라즈마(상단의 노란색 액체)와 단핵 전지(상단의 흐린 띠; 도 2B의 PBMC 밴드)를 1mL 피펫으로 사용하였다.
  4. 하부 탁한 띠( 그림 2B의 호중구 띠)와 맑은 액체 아래 약 3-4mL의 호중구를 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)가 들어 있는 15mL 원심분리 튜브로 수집합니다. 호중구 현탁액을 2-3회 뒤집어 부드럽게 섞습니다.
  5. 현탁액을 400× g 에서 20°C에서 10분 동안 원심분리한 다음 디캔팅하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
  6. 펠릿을 5mL의 PBS로 부드럽게 재현탁시키고 20°C에서 5분 동안 300× g 으로 원심분리합니다.
  7. 디캔팅으로 상층액을 제거하고 진공 흡입을 사용하여 튜브 입구 주변과 튜브 벽에 남아 있는 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 펠릿을 호중구 배지 1mL에 재현탁시킵니다.
  8. 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 전형적으로, 1 내지 4 × 107 호중구는 8 mL의 인간 혈액으로부터 얻어졌다.
    알림: 호중구 현탁액에 적혈구 오염이 있을 수 있습니다. 적혈구는 대부분의 분석에 큰 영향을 미치지 않으며 호중구 활성화/프라이밍을 예방할 수 있다27. 정확한 호중구 농도를 얻기 위해 계산하기 전에 적혈구를 용해해야 합니다. 적혈구를 용해하기 위해 10-30초 동안 891μL의 탈이온수에 세포 현탁액 10μL를 첨가한 다음 99μL의 10× PBS를 추가하여 삼투압의 균형을 유지하여 호중구의 용해를 방지합니다.
  9. 호중구 배지를 추가하여 세포 밀도를 6.25 × 105 cells/mL로 조정합니다.

3. 384웰 플레이트의 준비

  1. 1.5mL 원심분리 튜브에 1mL의 항체 용액(1.2μg/mL mAb24-APC)과 0.2mL의 호중구 배지를 결합하여 1μg/mL mAb24-APC 용액을 만듭니다. 그런 다음 이 혼합물 25μL를 384웰 플레이트의 음성 대조군 웰( 그림 1의 파란색 웰)에 추가합니다.
  2. 15mL 원심분리 튜브에 9mL의 항체 용액을 21.6μL의 fMLP 용액(100μM) 및 1.7784mL의 호중구 배지와 혼합하여 1μg/mL mAb24-APC 및 200nM fMLP를 포함하는 용액을 만듭니다. 다음으로, 이 혼합물 25μL를 384웰 플레이트( 그림 1의 빨간색 및 파란색 웰)의 양성 대조군 및 테스트 웰에 추가합니다.
  3. 멀티 채널 피펫을 사용하여 100μM 화합물 용액 5μL를 화합물 라이브러리 플레이트에서 384웰 플레이트로 옮깁니다.
  4. 실온에서 500× g에서 1분 동안 액체를 원심분리합니다.
    알림: 플레이트를 원심분리하려면 스윙 버킷 로터와 플레이트 버킷이 필요합니다.

4. 세포의 처리

  1. 16채널 피펫을 사용하여 각 웰에 20μL의 호중구 현탁액을 추가합니다(384웰 플레이트의 각 컬럼에 대해 5-50μL 범위). 피펫을 사용하여 5-10회 부드럽게 혼합하고 각 피펫팅 사이에 일정한 시간 간격을 유지합니다.
    참고: 웰의 최종 농도는 다음과 같습니다: 호중구 2.5 × 105 cells/mL(모든 웰); mAb24-APC 0.5μg/mL(모든 웰); fMLP 100nM(포지티브 대조군 및 테스트 웰); 화합물 10μM(테스트 웰).
  2. 300rpm의 Shaker에서 실온(RT)에서 10분 동안 배양합니다.
  3. 16채널 피펫(최종 PFA 농도 ~0.91%)을 사용하여 각 웰에 16% 파라포름알데히드(PFA) 3μL를 추가하여 셀을 고정합니다. 그런 다음 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.
    알림: 호중구와 PFA를 추가할 때 서로 다른 컬럼 사이에 일관된 시간 간격을 유지하는 것이 좋습니다. 이를 통해 각 웰의 호중구가 fMLP 및 mAb24-APC와 동일한 배양 시간을 갖도록 할 수 있습니다.

5. 유세포 분석

  1. 유세포 분석기를 켜고( 재료 표 참조) 기기에 연결된 컴퓨터도 켜져 있는지 확인합니다.
  2. 피복 유체 용기가 채워져 있고 폐기물 용기가 비어 있고 기기에 제대로 연결되어 있는지 확인하십시오.
  3. 384웰 플레이트를 유세포 분석기의 샘플 로더에 로드합니다. 플레이트의 A1 웰이 로더의 A1 표시와 정렬되는지 확인하십시오.
  4. 소프트웨어를 열고 새 실험을 만듭니다. 384 well 을 선택하고 원하는 형광단을 선택합니다. 그런 다음 플레이트 설정(Plate setup)을 클릭하고 드래그하여 모든 웰을 선택한 다음 샘플( Sample)을 클릭합니다. "High throughput(높은 처리량)" 스위치를 켜고 rate 패널에서 High(높음 )를 선택합니다.
    1. 볼륨 상자에 50을 입력합니다. 홀수 열에서 샘플을 선택한 다음 "교반" 스위치를 활성화합니다. 마지막으로 오른쪽 패널에서 샘플의 이름을 지정합니다.
  5. 플롯 및 게이트를 클릭합니다. 그런 다음 적용 버튼(녹색으로 채워진 원에 두 개의 화살표)을 클릭한 다음 재생 버튼(삼각형 모양)을 클릭합니다. 첫 번째 우물에서 일부 세포를 관찰할 때까지 몇 초 동안 기다린 다음 일시 중지 버튼을 클릭합니다.
    1. FSC 및 SSC 전압을 조정하여 플롯에서 세포를 적절하게 시각화합니다. Acquisition( 획득)을 클릭한 다음 재생 버튼(삼각형 모양)을 클릭하여 분석을 시작합니다.
  6. 유세포 분석기는 각 웰에서 ~50μL의 1000-3000 호중구를 순차적으로 샘플링합니다. 전체 384웰 플레이트를 완성하는 데 약 3시간이 걸립니다.
  7. 모든 샘플을 완료한 후 다음 단계를 위해 .fcs 파일을 내보냅니다.

6. 데이터 분석

  1. 유세포 분석 데이터 분석 소프트웨어를 엽니다( 재료 표 참조). 모든 .fcs 파일이 포함된 폴더를 선택하여 소프트웨어 창으로 드래그한 다음 손을 떼면 데이터가 소프트웨어로 가져옵니다.
  2. 그림 3과 같이 팝업 창에서 FSC 및 SSC28,29,30을 기반으로 하는 단일 호중구를 게이트하는 샘플 하나를 두 번 클릭합니다. 게이트 행을 선택하고 폴더로 끈 다음 놓아 해당 폴더의 모든 샘플에 게이팅을 적용합니다.
  3. 소프트웨어의 테이블 편집기 기능을 사용하여 각 웰에서 호중구의 APC 평균 형광 강도(MFI)를 계산하고 내보낼 수 있습니다. Edit(편집) 탭에서 Add Column(열 추가)을 클릭합니다. 통계량 탭에서 중앙값을 선택하고, 게이트 모집단 호중구를 선택하고, APC를 매개변수로 선택합니다. 확인 버튼을 클릭합니다.
  4. "Table editor" 탭으로 돌아가서 "Group" 탭에서 All Samples 를 선택하고 Create table 버튼을 누릅니다. 생성된 테이블을 표시하는 새 창이 나타납니다. 텍스트, CSV 또는 Excel 파일로 저장합니다.
  5. 내보낸 표를 열고 양성 및 음성 대조군 샘플에 대한 APC MFI의 평균값과 표준 편차를 계산합니다(그림 4).
  6. 다음 방정식을 사용하여 플레이트의 Z'-계수(Z')를 계산합니다.
    Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μp - μn),
    여기서σ p와 σ n은 각각 양성 및 음성 대조군의 표준 편차이고,μ p 및 μn은 각각 양성 대조군과 음성 대조군의 평균입니다(31).
    참고: Z' 계수는 양성 및 음성 제어 분포의 분리를 나타냅니다. Z'가 0이면 분리가 없음을 의미하고, Z'가 0.5이면 분리가 동일함을 나타냅니다. 이전 연구31에서 언급한 바와 같이, Z' > 0.5는 화합물 스크리닝을 위한 우수한 분석법을 나타낸다. 0.5에서 0 사이의 Z'는 허용되지만 분석에서 강한 적중만 식별할 수 있으므로 2차 분석에서 추가 검증이 필요합니다.
  7. 화합물 처리된 호중구의 APC MFI가 양성 대조군 MFI에서 뺀 양성 대조군 MFI의 표준 편차의 3배 미만인 경우(P = 0.0013, 그림 4의 점선으로 표시) 화합물을 스크리닝을 위한 "히트"로 간주합니다.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

대표적인 384웰 플레이트 스크리닝 데이터(그림 4)에 따르면 음성 대조군은 mAb24-APC의 MFI가 3236 ± 110인 반면, 양성 대조군은 mAb24-APC의 MFI가 7588 ± 858이었습니다. 이 플레이트의 Z' 계수는 약 0.33으로, 허용 범위31 내에 있습니다. 그러나 Z'는 2차 분석에서 추가 검증이 필요합니다.

데이터를 정규화하기 위해 양수 평균에 최대값 1을 할당하고 음수 평균에 최소값 0을 할당하도록 모든 값의 크기를 조정했습니다. Z' 인자는 2차 분석에서 보다 엄격한 검증을 거칩니다. 이 플레이트의 컷오프는 0.41로 설정되며, 이는 상대적 MFI가 0.41보다 낮은 샘플이 인간 호중구에서 fMLP 유도 β2 인테그린 활성화를 억제하는 히트로 간주됨을 의미합니다. 이 플레이트에서 히트가 확인되지 않았습니다.

프로토콜의 효과를 확인하기 위해 Rac-1 기능을 길항하여 β2 인테그린 활성화를 억제하는 Nexinhib20과 인테그린 αLβ2를직접 길항하는 lifitegrast를 32,33 사용하였다. 그러나 배양 시간은 Nexinhib20의 경우 1시간, lifitegrast의 경우 30분으로 조정되었습니다. 이러한 실험의 결과 데이터는 위에서 설명한 것과 동일한 스케일링 방법을 사용하여 정규화되었습니다. 그런 다음 이러한 데이터 포인트를 플레이트 결과와 결합하고 집합적으로 분석했습니다(그림 4).

화합물 스크리닝을 위한 96웰 플레이트 템플릿; 양성, 음성 대조군을 식별합니다. 다이어그램.
그림 1: 복합 스크리닝을 위한 플레이트 레이아웃. 384웰 플레이트에서 스크리닝 화합물 및 대조군의 배열을 보여주는 개략도. 네거티브 대조군은 파란색(1열과 23열)으로 표시되고, 포지티브 대조군은 빨간색(2열과 24열)으로 표시됩니다. 테스트 웰은 베이지색(3-22열)으로 표시됩니다. 화살표는 플레이트를 읽는 순서를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

혈액 분획 다이어그램; Polymorphprep, PBMC, RBC를 사용한 밀도 구배 분리가 확인되었습니다.
그림 2: 밀도 구배 배지를 사용한 호중구 분리. 밀도 구배 배지를 사용한 호중구의 성공적인 분리와 실패한 분리를 보여주는 대표 사진. (A) 처음에는 4mL의 혈액을 8mL의 밀도 구배 배지에 적층합니다. (B) 원심분리 후 두 개의 흐린 띠가 보여야 하는데, 위쪽 띠는 주로 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함하고 아래쪽 띠는 대부분 호중구와 일부 적혈구(RBC)를 포함합니다. 대부분의 적혈구는 바닥에서 펠릿화됩니다. (C) 적혈구가 펠릿화되지 않고 호중구 밴드가 관찰되지 않는 분리 실패. 호중구 밴드를 분리하기 위해 추가 원심분리(10-30분)가 필요합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

호중구 및 단일 세포 게이팅을 보여주는 유세포 분석 그래프; FSC-A, FSC-H, SSC-W.
그림 3: FSC/SSC 플롯을 사용한 호중구 게이팅. 호중구를 식별하기 위한 게이팅 전략을 보여주는 대표 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 플롯. (A) 호중구는 유세포 분석기에 의해 기록된 전방 산란(FSC-A) 및 측면 산란(SSC-A) 면적을 기준으로 게이팅됩니다. (B) 단일 셀은 전방 산란의 너비(FSC-W) 및 높이(FSC-H), (C) 측면 산란의 너비(SSC-W) 및 높이(SSC-H)를 기준으로 추가로 게이트됩니다. 색상 눈금은 밀도가 감소함에 따라 빨간색에서 노란색, 녹색 및 파란색으로 전환되는 세포 밀도를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

양성 및 음성 대조군에 대한 샘플 분석 결과를 보여주는 정규화된 mAb24 MFI의 도트 플롯.
그림 4: 대표적인 384웰 플레이트의 스크리닝 결과. 대표적인 384웰 플레이트의 스크리닝 결과로, Z' 계수 0.3을 보여줍니다. 네거티브 및 포지티브 컨트롤은 각각 파란색과 빨간색 점으로 표시됩니다. 다양한 화합물로 처리된 테스트 샘플은 베이지색 점으로 표시됩니다. 점선은 히트를 식별하기 위한 MFI(평균 형광 강도) 컷오프를 나타냅니다. 테스트된 모든 화합물이 컷오프 라인 위에 MFI 값을 표시했기 때문에 테스트된 화합물 중 어느 것도 β2 인테그린 길항제로 확인되지 않았습니다. 다양한 배양 시간(1시간 동안 Nexinhib20, 30분 동안 lifitegrast)으로 알려진 β2 인테그린 길항제를 테스트하는 독립적인 실험의 결과를 이 그림에 제시하기 위해 통합했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

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호중구 자극 및 염색의 시작과 종료는 호중구와 고정제 PFA의 첨가에 의해 결정됩니다. 따라서 호중구 또는 PFA를 각 컬럼에 피펫팅하는 사이에 동일한 시간 간격을 유지하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 각 웰에서 호중구의 자극 및 염색 시간이 일정하게 유지됩니다. 호중구의 수명이 짧기 때문에 기증자로부터 혈액을 채취하는 것부터 유세포 분석 완료에 이르기까지 전체 실험을 같은 날에 수행해야 합니다. 호중구는 온도 변화에 매우 민감하며 4°C에서 실온으로 또는 실온에서 37°C로 전환하는 것과 같은 급격한 온도 상승에 노출되면 활성화될 수 있습니다. 또한 이전 경험에 비추어 볼 때 fMLP 유도 호중구 β2 인테그린 활성화는 세포를 얼음 위 또는 4°C에 보관할 때 발생하지 않습니다(데이터 표시 안 됨). 따라서 고정 전에 전혈 및 호중구는 실온 또는 20°C(분리 원심분리 단계 중)에 보관해야 합니다. 전혈과 호중구를 얼음 위에 올려놓지 마십시오.

음성 대조군에서 mAb24를 염색하면 매우 낮은 결과를 얻을 수 있습니다. 실험에서 높은 mAb24 염색 수준이 관찰되면 다음을 확인하십시오: (1) 고정 전 실험 중에 상당한 온도 변화가 있었는지 여부; (2) 호중구 배지에 fMLP 또는 내독소 오염이 있었는지 여부; (3) 피펫팅 및 혼합 중 기포 발생과 같이 시료 취급이 너무 공격적이었는지 여부.

현재 프로토콜은 mAb24를 사용하여 β2 인테그린 헤드피스의 개방을 보고합니다. 이론적으로 β2 인테그린 34,35의 확장을 보고하는 단클론 항체인 KIM127을 mAb24와 함께 사용하여 β2 인테그린 형태를 종합적으로 평가할 수 있습니다. 그러나 KIM127 염색의 신호 대 잡음비(1.5-2배)는 mAb24(5-10배)만큼 유리하지 않으며, 이는 일반적으로 384웰 플레이트 분석에서 만족스러운 Z' 인자를 제공하지 않습니다. 96웰 플레이트 분석에서는 유세포 분석을 수행하기 전에 샘플을 세척하여 용해성 항체 유래 배경 신호를 줄일 수 있습니다. 따라서 KIM127 기반 분석은 384-well plate assay에 비해 처리량이 낮은 96-well plate assay에서 수행할 수 있습니다.

이 방법은 약물의 인테그린 억제 효과를 평가하기 위해 형광 강도를 판독값으로 사용하기 때문에 일부 형광 약물은 결과를 방해할 수 있습니다. 또한 10분 자극 기간 내에 호중구 사멸을 유도하는 독성 약물도 인테그린 억제를 보고하는 것으로 보입니다. 호중구 탈과립을 억제하는 약물은 전반적인 β2 인테그린 발현을 억제합니다. 이러한 탈과립 억제제는 스크리닝에서도 확인됩니다. 따라서 히트의 억제 효과를 확인하기 위해 다른 대조군을 사용한 2차 스크리닝이 필요합니다. 보조 화면은 히트의 작동 메커니즘을 검증하고 결정하는 수단으로 참조됩니다. mAb24 테스트를 반복하는 것 외에도 세포 표면의 총 CD18 발현은 pan anti-human CD18 항체를 사용하여 평가됩니다. mAb24로 측정한 활성화된 β2 인테그린의 수준은 총 CD18 발현에 의해 정규화됩니다. 이를 통해 약제의 작용 기전이 인테그린 활성화를 길항하거나 세포 표면에서 CD18의 발현을 억제하는지 여부를 결정할 수 있습니다. 또한 2차 스크리닝에서 생존도 분석을 수행하여 히트의 독성 효과를 배제해야 합니다.

이 프로토콜에는 제한 사항이 있습니다. 첫째, mAb24는 인테그린이 높은 친화성 상태에 있는 경우에만 β2 I-유사 영역을 검출할 수 있습니다. 따라서 mAb24 결합 감소를 통해 lifitegrast와 같은 α/β I-유사 알로스테릭 길항제를 식별할 수 없습니다. Lifitegrast는 더 많은 mAb24 결합을 유도합니다32 및 mAb24에서 비정상적으로 증가된 MFI 값을 보여줍니다(그림 4). 이러한 비정상 값의 경우, 이러한 히트가 lifitegrast와 같은 α/β I-유사 알로스테릭 길항제인지 확인하기 위해 다른 분석이 필요할 수 있습니다. 둘째, 이 분석에 대한 Z' 인자는 차선책이며 자동 피펫팅 및 교반을 사용하여 잠재적으로 개선될 수 있습니다. 불행히도 우리 실험실에는 이 가설을 테스트하는 데 필요한 장비가 부족합니다. 중복 또는 삼중 분석은 위의 방법으로 Z' 인자를 더 이상 개선할 수 없는 경우 위양성 및 음성을 식별하는 데 도움이 됩니다. 또한, 억제 효과를 내기 위해 한 시간의 배양이 필요한 알려진 β2 인테그린 활성화 억제제인 Nexinhib20에서 관찰된 바와 같이 더 많은 히트를 식별하기 위해 배양 시간을 연장하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 이 연구는 속효성 물질을 식별하는 데 중점을 두었습니다. 연구자는 특정 요구 사항에 맞게 배양 시간을 수정할 수 있다는 점에 유의해야 합니다.

우리가 아는 한, 이것은 β2 인테그린 길항제에 대한 최초의 고처리량 스크리닝 방법입니다. 이 접근법은 β2 인테그린에 직접 결합하고 인테그린 αIIbβ3 및 α4β126에 대해 최근에 기술된 "작용성" 특성이 없는 길항제와 유사한 중간/고친화성 인테그린 상태로 이어지는 구조적 변화를 방지하는 저분자 화합물을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 호중구는 심근 허혈 재관류 손상(myocardial ischemia-reperfusion injury)36, 패혈증(sepsis)37, 자가면역질환(autoimmune diseases)38,39과 같은 많은 염증성 질환에 매우 중요하다. 저분자 약물은 항체 기반 약물에 비해 이러한 질병을 치료하는 데 더 많은 유연성을 제공할 수 있습니다. 스크린의 히트는 염증성 질환에 대한 잠재적인 치료법을 제공할 수 있습니다.

현재 방법은 형광 항체 기반의 고처리량 스크리닝입니다. 활성화 리포터 항체는 β1 40,41,42,43,44, αIIbβ345,46 및 αL 인테그린47,48,49,50에 대해서도 사용할 수 있기 때문에 이 방법은 다른 인테그린에 대한 길항제를 식별하는 것으로 확장될 수 있습니다. β1 하이브리드 도메인 51,52,53에 결합하는 HUTS-21과 같은 구조적으로 민감한 항체는 매우 늦은 항원-4(VLA-4, integrin α4β1) 알로스테릭 길항제(54)를 식별하기 위해 고처리량 스크리닝에 사용되어 왔다. 본 스크리닝 방법은 또한 낭포성 섬유증(CF) 세포 상의 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절제(CFTR) 표면 발현을 증가시키는 화합물과 같은 다른 표면 수용체의 발현을 억제하거나 촉진하는 약물을 찾기 위해 수정 및 확장될 수 있다. CF에서, 다수의 돌연변이는 CFTR 미폴딩을 유발하여, 세포막(55) 상에 CFTR의 발현이 결석하게 된다. 저분자 약물은 CFTR 발현56을 복원하는 것으로 나타났다. 프로토콜 변형의 경우 단백질 발현 변화가 발생할 수 있도록 약물의 배양 시간을 몇 시간으로 늘려야 합니다.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

유세포 분석에 도움을 주신 UConn Health의 유세포 분석 코어의 Evan Jellison 박사와 Li Zhu 박사, 기기를 지원해 주신 UConn Health 면역학과의 Lynn Puddington 박사, 혈액 샘플 채취에 도움을 주신 UConn Health의 임상 연구 핵심 부서의 Slawa Gajewska 박사와 Paul Appleton 박사에게 감사드립니다. 이 원고의 과학적 집필 및 편집에 도움을 주신 UConn School of Medicine의 Christopher "Kit" Bonin 박사와 Geneva Hargis 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health), 미국 국립심장폐혈액연구소(National Heart, Lung, and Blood Institute, R01HL145454), 미국 국립종합의학연구소(National Institute of General Medical Sciences, P20GM121176), 미국심장협회(American Heart Association)의 경력개발상(Career Development Award, 18CDA34110426), UConn Health의 스타트업 펀드의 지원을 받았습니다. 그림 1 은 BioRender.com 사용하여 만들었습니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16채널 피펫Thermo4661090NInstrument
384-well plateGreiner784201재료
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) 항체 클론: m24BioLegend363410시약
Bravo  자동화된 액체 처리 플랫폼 Agilent16050-102384 다중 채널 액체 처리기
원심 분리기Eppendorf모델 5810R기기
FlowJoBecton, Dickinson & 회사NASoftware
Human Serum Albumin Solution (25%)GeminiBio800-120시약
LifitegrastThermofisher  50-208-2121시약
Nexinhib20Tocris6089시약
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)SigmaF3506시약
파라포름알데히드 16% 용액전자 현미경 과학15710시약
플레이트 버킷EppendorfUL155액세서리
플레이트 쉐이커 Fisher88-861-023Instrument
PolymorphPrepPROGEN1895 (이전 1114683)시약
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)Prestwick Chemical LibrariesVer19_3841520 small molecules, 98% commercial approved drugs (FDA, EMA, JAN 및 기타 기관 승인)
RPMI 1640 Medium, no phenol redGibco11-835-030시약
스윙 버킷 로터 EppendorfA-4-62Rotor
ZE5 Cell AnalyzerBio-Rad Laboratories모델 ZE5기기

References

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