방법 논문

항원 내재화를 촉진하기 위한 입자 안정화 에멀젼의 세포 친화도

DOI:

10.3791/64406

⸱

2022년 9월 2일

 ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Bio-Applications and Systems Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 2Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, 4University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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효율적인 보조제를 합리적으로 설계하기 위해 우리는 폴리 락틱 공동 글리콜 산 나노 입자 안정화 피커링 에멀젼 (PNPE)을 개발했습니다. PNPE는 강력한 세포 접촉을 위한 독특한 부드러움과 소수성 인터페이스를 가지고 있으며 고함량 항원 로딩을 제공하여 항원 제시 세포에 대한 전달 시스템의 세포 친화도를 개선하고 항원의 효율적인 내재화를 유도했습니다.

초록

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마이크로/나노입자의 세포 친화력은 약물 전달 및 면역 반응에 필수적인 세포 인식, 세포 흡수 및 활성화의 전제 조건입니다. 본 연구는 고체 입자의 전하, 크기 및 모양이 세포 친화도에 미치는 영향이 일반적으로 고려된다는 관찰에서 비롯되었지만 세포 친화도에서 부드러움, 동적 구조 조정 현상 및 복잡한 계면 상호 작용의 본질적인 역할을 거의 깨닫지 못합니다. 여기에서 우리는 단단한 형태의 단점을 극복하고 병원균의 유연성과 유동성을 시뮬레이션한 폴리락틱-코-글리콜산(PLGA) 나노입자 안정화 피커링 에멀젼(PNPE)을 개발했습니다. 세포 표면에 대한 PNPE의 친화력을 테스트하고 면역 세포에 의한 후속 내재화에 대해 자세히 설명하는 방법이 설정되었습니다. 골수 수지상 세포(BMDC)를 대체하는 생체 모방 세포외 소포(bEV)에 대한 PNPE의 친화도는 소산 모니터링(QCM-D)이 있는 석영 결정 마이크로 저울을 사용하여 결정되었으며, 이를 통해 세포 에멀젼 접착을 실시간으로 모니터링할 수 있었습니다. 이어서, PNPE를 사용하여 항원 (오발 부민, OVA)을 전달하고 BMDCs에 의한 항원의 흡수를 공초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)을 사용하여 관찰했습니다. 대표적인 결과는 PNPE가 bEV와 조우했을 때 즉시 빈도(ΔF)를 감소시켰으며, 이는 BMDC에 대한 PNPE의 빠른 접착력과 높은 친화력을 나타냅니다. PNPE는 PLGA 미세입자(PMP) 및 AddaVax 보조제(계면활성제-안정화 나노에멀젼[SSE]로 표시됨)보다 세포막에 훨씬 더 강한 결합을 보였다. 또한, 동적 곡률 변화 및 측면 확산을 통해 면역 세포에 대한 향상된 세포 친화력으로 인해 항원 흡수가 PMP 및 SSE에 비해 연속적으로 증가했습니다. 이 프로토콜은 높은 세포 친화도와 효율적인 항원 내재화를 가진 새로운 제형을 설계하기 위한 통찰력을 제공하여 효율적인 백신 개발을 위한 플랫폼을 제공합니다.

서론

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전염병, 만성 및 전염병과 싸우기 위해서는 예방 및 치료 예방 접종을위한 효과적인 보조제를 개발하는 것이 필수적입니다 1,2. 이상적으로, 보조제는 우수한 안전성 및 면역 활성화 3,4,5를 가져야한다. 항원 제시 세포(APC)에 의한 항원의 효과적인 흡수 및 과정은 다운스트림 신호 전달 캐스케이드 및 면역 반응 6,7,8의 시작에서 필수적인 단계로 생각됩니다. 따라서 면역 세포와 항원의 상호 작용 메커니즘을 명확하게 이해하고 내재화를 강화하기 위해 보조제를 설계하는 것은 백신의 효율성을 향상시키는 효율적인 전략입니다.

독특한 특성을 갖는 마이크로-나노입자는 이전에 항원의 세포 흡수 및 병원체-관련 분자 패턴과의 세포 상호작용을 매개하는 항원 전달 시스템으로서 조사되었다

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프로토콜

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이 프로토콜에 설명 된 모든 방법은 중국 과학원의 공정 공학 연구소의 승인을 받았습니다. 모든 동물 실험은 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 규정 및 동물의 윤리적 검토 지침 (중국, GB / T35892-2018)에 따라 엄격하게 수행되었습니다.

1. PLGA 나노입자의 제조 및 특성화

  1. PLGA 나노입자(PNP)의 제조
    1. 90°C에서 탈이온수 120mL에 폴리비닐알코올(PVA) 0.5g을 첨가하고 완전히 용해될 때까지 교반하여 PVA 용액을 제조하였다. 실온으로 냉각한 후 용액을 냉장고(4°C)에 보관한다.
    2. 100mg의 PLGA를 10mL의 아세톤과 에탄올 혼합물(4:1의 비율)에 첨가하여 오일상 역할을 합니다.
    3. 흄 후드 아래에 PVA 수용액 20mL를 놓고 400rpm/min으로 자석으로 저어줍니다. 5mL의 오일 상을 PVA 용액에 주사기 펌프를 사용하여 한 방울씩 추가합니다. 그런 다음 유기 용매가 완전히 증발 할 때까지 흄 후드에서 혼합물을 저어줍니다.
      참고 : 오일 상태의 입자 농도가 증가함에 따라 수상 용액은 점차 투명하고 투명한 밝은 청백색 또는 유백색으로 변합니다.
    4. 유기 용매를 휘발시킨 후(2-3시간), ....

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결과

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PNPE를 얻기 위해 간단한 1단계 초음파 화를 사용했습니다. 먼저, 고체 안정제로 사용하기 위해 균일 한 PNP를 준비했습니다 (그림 1A). PNP의 형태는 SEM을 통해 관찰되었으며, 이는 대부분 균일하고 구형임을 보여줍니다(그림 1B). 제형의 유체역학적 크기 및 제타 전위는 DLS 를 통해 검출되었다. PNP의 직경은 187.7 ± 3.5 nm이고 제타 전위는 -16.4 ± 0.4 mV였습니다 (그림 1C 및 보충 표 1). PNPE를 준비하기 위해 PNP 용액 (0.4 %, w / v)과 스쿠알렌의 혼합물을 100w에서 5 분 동안 간단히 초음파 처리했습니다 (그림 1D). 연속상의 최적화 후, 수득 된 PNPE는 내부적으로 스쿠알렌으로 구성되고 외부적으로 PN.......

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토론

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우리는 향상된 항원 내재화를 위한 전달 시스템으로 PLGA 나노입자 안정화 오일/물 에멀젼을 개발했습니다. 준비된 PNPE는 착륙 지점을 지원하기 위해 조밀하게 채워진 표면과 면역 세포막과의 강력한 세포 접촉을 위한 독특한 부드러움과 유동성을 가지고 있습니다. 또한 오일/물 계면은 고함량 항원 로딩을 제공했으며 양친매성 PLGA는 항원을 면역 세포로 운반하기 위한 높은 안정성을 PNPE에 부여했습니다. PNPE는 세포 표면에 빠르게 부착 될 수 있으며, 이는 PLGA 나노 입자 안정화 에멀젼이 세포 흡수를 위해 세포막에 강한 친화력을 가짐을 나타냅니다. 또한 PNPE는 스쿠알렌과 PLGA가 모두 식품의 약국 (FDA) 승인 성분30이기 때문에 높은 안전성 프로파일을 가졌으며, 이는 임상 내로의 안전한 이전을 활용할 것으로 예상됩니다.

PLGA의 분자량과 연속 및 분산상의 유형은 안정성 및 소수성을 포함한 PNPE 특성에 영향을 미쳤습니다.......

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 작업은 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142)이 지원하는 프로젝트, 0에서 1까지 중국 과학원 기초 프론티어 과학 연구 프로그램 (ZDBS-LY-SLH040), 중국 국립 자연 과학 재단 혁신 연구 그룹 재단 (보조금 번호 21821005).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AddVaxInvivoGenVac-adx-10
세포 여과기BiosharpBS-70-CS70 μ m
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)NikonA1
Cy3 NHS 에스테르YEASEN40777ES03
DAPI 염색 용액BeyotimeC1005
소 태아 혈청(FBS)Gibco16000-044
FITC PhalloidinSolarbioCA1620
Mastersizer 2000 입자 크기 분석기Malvern
Micro BCA 단백질 분석 키트Thermo Science23235
멤브레인 유화 장비Zhongke Senhui Microsphere TechnologyFM0201/500M
미니 압출기Avanti Polar Lipids, Inc
NANO ZSMalvernJSM-6700F
폴리카보네이트 멤브레인Avanti Polar Lipids,
Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA)Sigma-Aldrich26780-50-7Mw 7,000-17,000
Poly-L-lysine SolutionSolarbioP2100
Poly (vinyl alcohol) (PVA)Sigma-Aldrich9002-89-5
QSense 이산화규소 센서Biolin ScientificQSX 303표면 거칠기 < 1 nm RMS
석영 크리스탈 마이크로밸런스BiosharpQ-SENSE E4
RPMI 매체 1640 기본GibcoC22400500BTL-글루타민, 25mM HEPES
주사 전자 현미경(SEM)JEOLJSM-6700F
스쿠알렌시그마-알드리치111-02-4
Inc

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ma, G., Gu, Z., Wei, W. Advanced vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 183, 114170(2022).
  2. Sharma, J., Carson, C. S., Douglas, T., Wilson, J. T., Joyce, S. Nano-particulate platforms for vaccine delivery to enhance antigen-specific cd8(+) t-ce....

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재인쇄 및 허가

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