칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 펩타이드의 항진균 활성 정량화

요약

이 프로토콜은 칸 디다 알비칸스에 대한 펩타이드 및 소분자 항진균제와 같은 기타 화합물의 항진균 활성에 대한 정량적 데이터를 얻는 방법을 설명합니다. 성장 억제를 정량화하기 위해 집락 형성 단위를 세는 대신 광학 밀도를 사용하면 시간과 자원을 절약할 수 있습니다.

초록

칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 항진균성 감수성 검사를 수행하는 전통적인 방법은 시간이 많이 걸리고 정량적 결과가 부족합니다. 예를 들어, 일반적인 접근법은 한천 플레이트에 다양한 농도의 항진균 분자로 처리된 세포를 도금한 다음 콜로니를 계수하여 분자 농도와 성장 억제 사이의 관계를 결정하는 데 의존합니다. 이 방법은 식민지를 세는 데 많은 판과 상당한 시간이 필요합니다. 또 다른 일반적인 접근법은 성장을 억제하는 데 필요한 최소 농도를 확인하기 위해 항진균제로 처리된 배양물을 육안으로 검사하여 플레이트와 콜로니 계수를 제거합니다. 그러나 육안 검사는 정성적 결과만 생성하며 하위 억제 농도에서의 성장에 대한 정보는 손실됩니다. 이 프로토콜은 항진균 펩타이드에 대한 C. albicans의 감수성을 측정하는 방법을 설명합니다. 배양의 광학 밀도 측정에 의존함으로써 이 방법은 다양한 펩타이드 농도에서 배양 성장에 대한 정량적 결과를 얻는 데 필요한 시간과 재료를 줄입니다. 펩타이드를 사용한 곰팡이의 배양은 적절한 완충액을 사용하여 96웰 플레이트에서 수행되며, 대조군은 성장 억제 없음 및 완전한 성장 억제를 나타냅니다. 펩티드와 함께 배양한 후, 생성된 세포 현탁액을 희석하여 펩티드 활성을 감소시킨 다음 밤새 성장시킵니다. 하룻밤 성장 후, 각 웰의 광학 밀도를 측정하고 양성 및 음성 대조군과 비교하여 각 펩티드 농도에서 결과적인 성장 억제를 계산합니다. 이 분석을 사용한 결과는 한천 플레이트에 배양물을 도금하는 전통적인 방법을 사용한 결과와 비슷하지만 이 프로토콜은 플라스틱 폐기물과 집락 계수에 소요되는 시간을 줄입니다. 이 프로토콜의 적용은 항진균 펩타이드에 초점을 맞추었지만 이 방법은 항진균 활성이 알려지거나 의심되는 다른 분자를 테스트하는 데에도 적용할 수 있습니다.

서론

칸디다 알비칸스(Candida albicans)는 구강, 피부, 위장관 및 질을 포함한 수많은 위치에 서식하는 인간 미생물총의 일원입니다¹. 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 및 면역억제 치료와 같은 질병으로 인해 면역이 저하된 환자의 경우, C. albicans의 집락화는 국소 또는 전신 칸디다증을 유발할 수 있다 ^2,3. 암포테리신 B, 아졸 또는 에키노칸딘과 같은 현재 이용가능한 소분자 항진균 치료제의 사용은 용해도 및 독성 문제와 치료제에 대한 감염의 저항성에 의해 복잡해질 수 있다 ^4,5. 현재 항진균제의 한계로 인해 연구자들은 C. albicans에 대한 활성을 가진 새로운 항진균 분자를 지속적으로 찾고 있습니다.

항균 펩티드(AMP)는 현재의 소분자 항진균제^6,7,8....

프로토콜

이 프로토콜(PN 274)에서 C. albicans 를 사용한 작업에 대해 메릴랜드 대학교 칼리지 파크, 기관 생물안전 위원회(IBC)로부터 승인을 받았습니다. C. albicans 균주 SC5314 ( 재료 표 참조)를 본 연구에 사용하였다; 그러나, 임의의 다른 균주가 또한 사용될 수 있다.

1. 완충액, 멸균수 및 배양액의 제조

1. pH 7.4에서 멸균 된 0.1M 인산 나트륨 완충액 (NaPB) ²⁶ 을 준비하고 멸균 수로 2mM 및 1mM로 희석합니다. 2 mM NaPB 및 1 mM NaPB 각각을 100 mL 제조하는 것은 이 프로토콜의 대부분의 적용에 충분할 것이다.
2. 멸균 액체 효모-펩톤-포도당(YPD, 재료 표 참조) 배지(10g/L 효모 추출물, 20g/L 포도당, 20g/L 펩톤)를 준비합니다. 100mL의 YPD를 준비하는 것은 이 프로토콜의 대부분의 응용 분야에 충분합니다.
3. 멸균 된 초순수를 준비하십시오. 100mL의 물을 준비하는 것은 이 프로토콜의 대부분의 응용 분야에 충분합니다.
   참고: 완충액, 매....

결과

항진균 펩타이드로 인한 성장 감소를 정량화하기 위해 OD₆₀₀ 측정을 사용하면 도금 샘플 및 CFU 계수에 비해 상당한 시간을 절약할 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명된 방법은 서로 다른 3일에 단계를 완료해야 합니다. 첫날에는 완충액과 배지(멸균 시간 제외)를 준비하고 하룻밤 배양을 위해 C. albicans 의 시작 배양을 접종하는 데 약 1시간이 필요합니다. 둘째 날에, 단계는 17시간 인큐베이션을 위한 96-웰 플레이트를 제조하기 위해 5-6시간(계대배양 시간 포함)을 필요로 한다. 셋째 날에는 1 시간 이내에 단계를 완료 할 수 있습니다. 생존력에 대한 정량적 데이터 수집과 관련된 프로토콜 부분에는 약 30분의 작업(17시간의 배양 포함)이 필요합니다. 대조적으로, 한천에 샘플을 도금하고 각 96웰 플레이트 내용물의 단일 복제에 대한 CFU를 계산하려면 3시간 이상의 작업(24시간의 배양 포함)이 필요하므로 이 프로토콜을 사용하여 생존력 정량화를 완료하는 데 필요한 시간이 2.5시간 .......

토론

이 프로토콜은 진균 병원체 C. albicans에 대한 AMP의 항진균 활성에 대한 정량적 데이터를 얻기 위한 효율적인 접근 방식을 설명합니다. 펩타이드 및 기타 항진균제를 검사하는 일반적인 대안 접근법 중 하나는 CLSI(Clinical Laboratory Standards Institute)의 표준 M27¹⁸에 설명된 브로스 미세 희석이지만 이 표준은 정량적 결과 대신 정성적 시각적 결과를 얻는 데 중점을 둡니다. 또 다른 대안적 접근법은 이 프로토콜에 기술된 것과 유사한 방법을 사용하여 펩티드를 제조하고 세포와 함께 배양한 다음 웰의 내용물을 한천에 플레이트하여 CFU의 수를 계산하고 펩티드의 효과를 정량화하는 것입니다. 대표적인 결과 섹션에서 언급했듯이, 이 프로토콜에서 세포 성장을 측정하기 위한 OD₆₀₀ 의 사용은 도금 및 계수 CFU에 비해 시간 부담을 실질적으로 감소시킵니다. 우물의 내용물을 한천에 도금할 필요가 없어지면 펩타이드 테스트.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96-웰 플레이트 (둥근 바닥)	VWR	10062-902
흡광도 마이크로플레이트 리더	N/A	N/A	사용 가능한 마이크로플레이트 리더는 충분합니다
C. 알비칸스 strain SC5314	ATCC	MYA-2876	기타 C. albicans도 사용할 수 있습니다
혈구계	N	/A 해당 없음	세포 수와 관련된 표준 곡선을 만드는 데 사용할 수 있습니다 OD600
microplate shaker	VWR	2620-926
펩타이드	N/		A 해당 없음펩티드는 신뢰할 수 있는 공급업체에 의해 상업적으로 합성될 수 있습니다. &ge의 순도; 95% 및 트리플루오로아세트산 염을 염산염으로 제거하는 것이 좋습니다
다채널 피펫터용 시약 저장소	VWR	18900-320	다채널 피펫터로 멀티웰 플레이트로의 피펫팅을 단순화
합니다 인산나트륨, 이염기성	Fisher Scientific	BP332-500	NaPB 인
산나트륨 제조용, 일염기성	Fisher Scientific	BP329-500	NaPB 제조용
UV 분광 광도계	N/A	/	A 사용 가능한 모든 UV 분광 광도계로 충분합니다
YPD 매체 분말	BD Life Sciences	242820	효모 추출물, 펩톤 및 포도당으로도 만들 수 있습니다

N.