바이러스 동시 감염 시 콜로니자에서 병원체로 Streptococcus pneumoniae 의 전환을 위한 마우스 모델은 연령 악화 질병을 요약합니다.

폐렴구균(Streptococcus pneumoniae, 폐렴구균)은 그람 양성균으로 대부분의 건강한 사람의 비인두에 무증상으로 존재한다 ^1,2. 완전히 정의되지 않은 요인에 의해 촉진되는 폐렴구균은 비인두의 양성 집락 형성자에서 다른 장기로 퍼져 중이염, 폐렴, 균혈증 등 심각한 감염을 초래하는 병원체로 전환될 수 있다³. 폐렴구균성 질환 발현은 부분적으로 협막 다당류의 조성에 기초하는 혈청형을 포함한 균주 특이적 차이에 의존합니다. 지금까지 100가지 이상의 혈청형이 특징지어졌으며 일부는 보다 침습적인 감염과 관련이 있습니다 ^4,5. 몇 가지 다른 요인들이 폐렴 구균 성 질환의 위험을 증가시킵니다. 그러한 요인 중 하나는 폐렴 구균 성 폐렴의 위험이 IAV ^6,7에 의해 100 배 증가하는 바이러스 감염입니다. 역사적으로 S. pneumoniae는 인플루엔자 이후 이차성 세균성 폐렴의 가장 흔한 원인 중 하나이며, 더 나쁜 결과와 관련이 있다⁸. 또 다른 주요 위험 요소는 고령입니다. 사실, S. pneumoniae는 65세 이상의 노인에서 지역사회 획득 세균성 폐렴의 주요 원인입니다 ^9,10. 노인은 폐렴 및 인플루엔자로 인한 사망의 대부분(>75%)을 차지하며, 이는 노화와 IAV 감염의 두 가지 위험 요소가 질병 감수성을 상승적으로 악화시킨다는 것을 나타낸다^11,12,13,14. 그러나 바이러스 감염이 폐렴구균을 무증상 집락 형성자에서 침습성 병원체로 전환하도록 유도하는 메커니즘과 이것이 숙주 요인에 의해 형성되는 방식은 아직 잘 정의되어 있지 않습니다. 이것은 주로 무증상 폐렴구균 집락화에서 중대한 임상 질환으로의 전환을 요약하는 작은 동물 모델이 없기 때문입니다.

동시 감염 연구는 인플루엔자 감염 후 7일 후에 폐렴구균을 폐에 직접 접종한 마우스에서 고전적으로 모델링되었습니다^15,16. 이는 이차성 세균성 폐렴에 대한 감수성을 재현하며, 항바이러스 면역 반응이 어떻게 항균 방어를 손상시키는지를 연구하는 데 이상적이다¹⁷. 그러나, 인간을 대상으로 한 종단적 연구는 박테리아가 무증상 생물막을 형성할 수 있는 비인두의 폐렴구균 운반(pneumococcal carriage)이 침습성 질병(invasive diseases)^과 균일하게 연관되어 있음이 입증되었다^19,20. 중이, 폐 및 혈액의 감염으로부터 분리된 박테리아는 비인두에서 발견되는 것과 유전적으로 동일하다²⁰. 따라서, IAV 감염 후 무증상 운반에서 침습성 질환으로의 전환을 연구하기 위해, 마우스를 비강 내 투여한 후 비인두의 IAV 감염을 초래하는 모델을 확립하였다^21,22. 상기도의 바이러스 감염은 숙주 환경의 변화로 이어져 생물막에서 폐렴구균이 분산되고 하부 기도로 퍼졌다²¹. 이 분산된 박테리아는 감염에 중요한 독성 인자의 발현을 상향 조절하여 식민지 개척자에서 병원체로 전환시켰다²¹. 이러한 관찰은 바이러스, 숙주 및 박테리아 사이의 복잡한 상호 작용을 강조하고 바이러스 감염에 의해 유발된 숙주의 변화가 폐렴구균 행동에 직접적인 영향을 미치며, 이는 차례로 박테리아 감염 과정을 변화시킨다는 것을 보여줍니다. 그러나 이 모델은 바이러스가 비강에 국한되어 있고 숙주 면역 및 폐 손상에 대한 바이러스 감염의 전신 효과가 요약되지 않기 때문에 인간에서 관찰되는 질병의 심각한 징후를 요약하지 못합니다.

우리는 최근에 숙주와 병원체 사이의 복잡한 상호 작용을 통합하지만 인간에서 관찰되는 질병 중증도를 더 가깝게 모방하는 모델을 구축했습니다²³. 이 모델에서, 마우스는 먼저 생물막 성장 폐렴 구균에 비강 내 감염되어 무증상 운반을 확립한 다음, 비인두와 폐 모두의 IAV 감염이 뒤따른다. 그 결과 폐에 박테리아가 전파되고, 폐 염증이 발생했으며, 어린 생쥐의 일부에서 치사율로 진행된 질병이 발생했다²³. 이 이전 연구는 바이러스 및 박테리아 감염 모두 숙주 방어를 변경했음을 입증했습니다: 바이러스 감염은 박테리아 전파를 촉진하고 이전의 박테리아 집락화는 폐 IAV 수준을 제어하는 숙주의 능력을 손상시켰습니다²³. 면역 반응을 조사한 결과, IAV 감염은 호중구의 항균 활성을 감소시키는 반면, 박테리아 집락화는 항바이러스 방어에 중요한 I형 인터페론 반응을 둔화시키는 것으로 나타났다²³. 중요한 것은 이 모델이 노화의 감수성을 재현했다는 것입니다. 어린 생쥐에 비해 늙은 생쥐는 질병의 징후를 더 일찍 보였고, 더 심각한 임상적 질병을 보였으며, 감염에 더 자주 굴복했다²³. 이 원고에 제시된 연구는 침습성 폐렴구균 균주가 IAV 감염 시 더 효율적인 전파를 나타내고, 폐 염증의 더 명백한 징후를 보여주며, 비침습적 균주에 비해 질병의 속도를 가속화하기 때문에 질병의 정도도 박테리아 균주에 의존한다는 것을 보여줍니다. 따라서 이 S. pneumoniae/IAV 동시 감염 모델은 병원체와 숙주 인자 모두에 대한 자세한 검사를 허용하며 질병 진행의 여러 단계에서 다미생물 감염에 대한 면역 반응을 연구하는 데 매우 적합합니다.

모든 동물 연구는 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드의 권장 사항에 따라 수행되었습니다. 모든 절차는 University at Buffalo Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다.

1. 화학적으로 정의된 매체(CDM) 준비

1. 다음과 같이 주식을 준비하십시오.
   1. 표 1에 열거된 혼합물 I 화합물을 교반하면서 초순수 100mL에 녹인다. -20 °C에서 200 μL 분취량으로 보관하십시오.
   2. 표 1에 열거된 혼합물 II 화합물을 교반하면서 0.1 M NaOH 중 20 mL에 용해시킨다. -20 °C에서 100 μL 분취량으로 보관하십시오.
   3. 표 1에 열거된 혼합물 III 화합물을 교반하면서 초순수 1mL에 녹입니다. 4 °C에서 10 μL 분취량으로 보관하십시오.
   4. 표 1에 열거된 혼합 IV 화합물을 교반하면서 초순수 1 mL에 녹인다. -20°C에서 10μL 분취량으로 보관하십시오.
   5. 교반하면서 처음에 표 2 에 나열된 화합물을 초순수 15mL에 녹입니다. 0.1M NaOH 몇 방울로 pH를 7.0으로 조정하고 초순수를 사용하여 최종 부피를 20mL로 조정합니다. -20 °C에서 1 mL 분취량에 보관하십시오.
   6. 표 3에 열거된 화합물을 교반하면서 50°C의 핫 플레이트 상의 초순수 90 mL에 녹인다. 0.1M NaOH로 pH를 7.0으로 조정한 후 초순수를 사용하여 최종 부피를 100mL로 조정합니다. -20 °C에서 5 mL 분취량으로 보관하십시오.
2. 교반하면서 표 4의 화합물을 초순수 70 mL에 용해시켜 매번 스타터 스톡을 신선하게 만든다.
3. 200 μL의 Mix I 스톡(표 1), 80 μL의 Mix II 스톡(표 1), 10 μL의 Mix III 스톡(표 1), 10 μL의 Mix IV 스톡(표 2), 1 mL의 비타민 스톡(표 3) 및 5 mL의 아미노산 스톡(표 4)을 순서대로 추가합니다.
4. 스톡이 추가되면 비커에 100mL의 초순수를 추가하여 최종 부피를 30mL로 조정합니다.
5. 표 4의 화합물로 CDM을 보충한다. 완전히 혼합되면 필터 멸균하고 최대 4주 동안 4°C에서 보관합니다.

2. S. pneumoniae 생물막 성장

1. RPMI 1640 445mL와 열 불활성화 소 태아 혈청(FBS) 50mL 및 페니실린/스트렙토마이신 5mL를 각각 10,000U/mL 및 10,000μg/mL로 혼합하여 RP-10 배지를 준비합니다.
2. NCI-H292(H292) 점막표피양 암종 세포주를 성장시킵니다. 구입한 바이알 1개에서 세포를 T-25 조직 배양 처리된 플라스크의 RP-10 배지 5mL에 넣습니다. 37°C/5%_CO2 에서 3-5일 동안 배양하여 100% 합류점에 도달합니다.
3. 밀도를 평가하기 위해 10x 배율을 사용하여 광학 현미경으로 세포를 확인합니다.
   참고: 모든 셀이 다른 셀과 접촉하고 그 사이에 간격이 없으면 원하는 100% 밀도에 도달합니다.
4. 세포를 실온의 PBS 5mL로 2배 세척합니다. 다음 단계에서 EDTA가 킬레이트화되는 것을 방지하기 위해 완충액에 칼슘이 없는지 확인하십시오.
5. 플라스크에 트립신-EDTA 1mL를 넣고 세포가 분리될 때까지 37°C/5% CO₂ 에서 5-10분 동안 배양합니다. 4mL의 RP-10 배지로 중화합니다. 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합하고 50mL 코니컬 튜브에 옮깁니다.
6. 웰 당 500 μL의 세포 현탁액을 조직 배양 처리된 24-웰 플레이트에 첨가한다. 합류 T-25 플라스크에서 2 × 10 6-4 × 10⁶ cells/mL를 예상합니다.
7. 다음 날, 2.3단계에서와 같이 광학 현미경으로 세포를 검사하여 세포가 합류하는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 더 오래 배양하십시오.
8. H292 세포가 24웰 플레이트에서 100% 합류하면 항생제나 파편이 포함된 배지가 남지 않도록 실온 PBS 1mL로 세포를 3배 부드럽게 세척합니다.
9. 세포를 세척한 후 250μL/웰의 4% 파라포름알데히드를 추가하여 세포를 고정합니다. 얼음에서 1시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
10. 세포 고정 전날 밤, 혈액 한천 플레이트에 관심 있는 S. pneumoniae 균주를 줄무늬로 만들고 37°C/5%_CO2에서 밤새 배양합니다.
    참고: 여기에 제시된 데이터는 협력 교환을 통해 얻은 다음 S. pneumoniae 균주와 함께 제공됩니다: 혈청형 19F 중이염 분리 EF3030 24, 고전적 혈청형 2 Avery 균주 D39²⁵ 및 혈청형 4 균혈증 분리^{TIGR4 26}. 균주는 재료 표에 참조된 공개 컬렉션에서도 사용할 수 있습니다.
11. 20mL의 CDM에 100μL의 옥시라제(30U/mL)를 추가하여 CDM과 옥시라제(0.15U/mL)를 준비합니다.
    참고: 옥시라제는 액체 배양에서 S. pneumoniae 의 효율적인 성장을 허용하기 위해 산소를 제거하는 데 사용된다²⁷.
12. CDM + 옥시라제 1mL를 첨가하여 플레이트에서 박테리아를 세척하고 한천이 긁히지 않도록 주의하면서 1mL 피펫 팁의 측면을 사용하여 박테리아 콜로니를 부드럽게 들어 올려 플레이트에서 박테리아를 신선한 CDM + 옥시라제로 접종합니다. 또는 접종 루프를 사용하여 박테리아를 들어 올리고 CDM + 옥시라제 1mL가 들어 있는 튜브에 접종합니다.
13. 박테리아를 CDM+ 옥시라제에서 0.05의 출발_OD600 으로 희석한다.
14. OD_{50의 OD 37}에 도달할 때까지 5°C/5% CO 2에서 느슨하게 캡을 씌운 0.2mL 원추형 튜브에서 박테리아를 성장시킵니다(_2-5시간 소요). OD₆₀₀이 0.2를 초과하지 않는지 매시간 확인하십시오.
15. OD가 0.2에 도달하면 박테리아 배양 튜브를 소용돌이칩니다. 고정된 H292 세포에 0.5 mL의 박테리아를 시딩하고, 웰 당 또 다른 0.5 mL의 CDM+ 옥시라제 배지를 첨가한다. 박테리아가 없는 대조군 웰에 1mL의 CDM + 옥시라제를 추가합니다. 플레이트를 34°C/5%_CO2에서 48시간 동안 배양합니다.
    참고: 34°C에서의 성장은 비인두의 낮은 온도를 보다 가깝게 모방하는 데 사용됩니다²¹.
16. 초기 파종 후 12시간마다 0.5mL의 배지를 부드럽게 제거하고 0.5mL의 신선한 CDM + 옥시라아제를 보충합니다. 형성되는 생물막을 방해하지 않도록 주의하십시오. 플레이트 바닥에 생물막이 있는지 확인하고 생물막의 성장으로 인해 시간이 지남에 따라 흐림이 증가하는 것을 확인합니다. 오염을 제어하려면 박테리아가 없는 웰을 확인하여 제어 웰이 깨끗하게 유지되는지 확인합니다.
17. 접종 후 48시간에 상층액을 제거하고 PBS 1mL로 2배 부드럽게 세척합니다. 신선한 CDM 1mL에 재현탁하고 위아래로 세게 피펫하여 생물막을 들어 올립니다. 각 박테리아 균주에 대해 모든 웰의 박테리아를 50mL 원뿔형 튜브에 모읍니다. 단단히 덮인 튜브를 위아래로 여러 번 부드럽게 기울여 잘 섞습니다.
18. 50mL 원뿔형 튜브에 CDM에 40% 글리세롤을 동일한 부피로 첨가하여 최종 농도가 20% 글리세롤인 박테리아 현탁액을 만듭니다. 1mL를 미세 원심분리기 튜브에 분취하여 드라이아이스에서 급속 동결하고 -80°C에서 저장합니다.
19. 사용하기 전에, 1개의 분취액을 얼음 위에서 해동하고, 튜브를 1,700 × g 에서 5분 동안 회전시키고, 상층액을 제거하고, 펠릿을 PBS 1 mL에 재현탁시키고, 혈액 한천 플레이트²⁸에 연속 희석액을 도금하여 박테리아를 열거한다.
20. 한천 플레이트를 37°C/5% CO₂ 에서 밤새 성장시키고 관련 희석액에서 콜로니를 계수하여 콜로니 형성 단위(CFU)/mL의 박테리아 농도를 얻습니다.
    참고: 처음 24시간 이내에 박테리아 생존력이 떨어지므로 냉동 후 최소 하루 또는 그 이후에 주식에 있는 박테리아를 열거하는 것이 좋습니다. 저장된 냉동 분취량은 최대 2 개월 동안 마우스의 후속 감염에 사용할 수 있습니다.

3. 생쥐의 비강 내 접종 생물막 성장 S. pneumoniae;

1. 마우스를 구입하여 원하는 나이에 사용하십시오.
   참고: 생후 3-4개월령 마우스는 어린 숙주를 모델링하는 데 선호되며, 생후 21-24개월령 마우스는²⁹세>65세의 노인 개체를 모델링하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에 제시된 데이터는 C57BL/6 수컷 마우스에 대한 것입니다.
2. 생물막에서 성장한 박테리아 분취량을 얼음에서 해동하고 1,700× g 에서 5분 동안 회전합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 제거하고 버리고, 펠릿을 PBS 1mL에 재현탁하여 박테리아를 세척하고, 1,700× g 에서 5분 동안 다시 회전시킵니다. 상층액을 제거하고 원하는 농도에 도달하는 데 필요한 부피로 펠릿을 다시 현탁합니다(비강 내 접종을 위해 5 × 10⁶ CFU/10 μL 목표). 단계 2.19에서와 같이 제조된 접종물을 혈액 한천 플레이트에 플레이팅하여 투여된 균의 양을 확인한다.
3. 희석된 접종물 5μL를 각 나리스에 피펫팅하여 5 ×^{10 6} CFU로 마우스를 비강 내 접종합니다. 부피가 흡입될 때까지 마우스를 단단히 잡고 머리를 안정시키십시오(일반적으로 부피를 콧구멍에 피펫팅한 후 몇 초 이내). 접종 물의 폐 흡인을 방지하기 위해 마취가 없을 때이 단계를 수행하십시오.

4. 인플루엔자 A 바이러스(IAV)에 의한 바이러스 감염

1. S. pneumoniae로 비강내 접종 후 48시간에 관심 있는 IAV 균주를 얼음 위에서 해동합니다.
   참고: 여기에 제시된 데이터는 협력 교환 30을 통해 얻은 인플루엔자 A 바이러스 A/PR/8/³⁴ H1N1의 마우스 적응 균주입니다.
2. 바이러스가 해동되면 PBS에서 원하는 농도로 바이러스를 희석합니다. 기관내 감염의 경우 20 플라크 형성 단위(PFU)/50 μL, 비강내 감염의 경우 200 PFU/10 μL을 목표로 합니다. 모의 감염 및 박테리아 전용 그룹의 경우 PBS를 사용하여 마우스를 접종합니다.
3. 마취 전에 생쥐의 눈에 안과 윤활제를 바르십시오. 5 % 이소 플루 란을 사용하여 마우스를 마취시키고 단단한 발가락 핀치로 마취를 확인합니다.
4. 동물이 마취되면 이소플루란 챔버에서 제거하고 마취된 마우스에 50μL(20PFU)의 IAV를 기관 내로 즉시 감염시켜 무딘 핀셋을 사용하여 혀를 입 밖으로 빼내고 액체의 양을 기관 아래로 피펫팅합니다.
5. 마우스를 별도의 케이지에 넣고 완전히 회복 될 때까지 모니터링합니다 (흉골 누운 자세를 유지할 수 있습니다 [가슴에 똑바로 눕힐 수 있음]).
6. 회수 후, 3.3 단계의 접종 방법을 사용하여 마우스에 10 μL (200 PFU)의 IAV를 즉시 비강 내 접종한다.
7. 동일한 감염 그룹으로 단일 또는 이중 박테리아 및 바이러스 감염을 겪은 집 마우스를 다른 그룹과 분리합니다.

5. 질병 증상에 대한 마우스 모니터링

1. 최소 10 일 동안 매일 마우스를 모니터링하고 다음과 같이 질병의 징후에 대해 맹목적으로 점수를 매깁니다.
   1. 체중 감소에 대한 점수는 다음과 같습니다: 0 = 5% 이하; 1 = 5%-10%; 2 = 10%-15%; 3 = 20% 이상. 체중 감량 점수가 3일 때 CO₂ 흡입을 사용하여 마우스를 안락사시킵니다.
   2. 활동에 대한 점수는 다음과 같습니다: 0 = 정상/활성; 1 = 움직이지만 약간 감소; 2 = 감소; 3 = 심하게 감소/무기력(만져야만 움직임), 4 = 혼수상태/움직이지 않음. 활동 점수가 3일 때 마우스를 안락사시킵니다.
   3. 자세에 대한 점수는 다음과 같습니다: 0 = 직감 없음(정상); 1 = 약간 구부러진 자세; 2 = 심한 직감. 자세 점수가 2일 때 마우스를 안락사시킵니다.
   4. 눈에 대한 점수는 다음과 같습니다: 0 = 정상; 1 = 돌출; 1 = 침몰; 1 = 닫힘; 1 = 방전. 조합이 될 수 있습니다. 최종 시력 점수의 합계를 더합니다.
   5. 호흡에 대한 점수는 다음과 같습니다: 0 = 정상 호흡; 1 = 불규칙하거나 변경됨(높은/낮은 비율); 2 = 수고(과장된 노력 또는 헐떡임). 호흡 점수가 2일 때 마우스를 안락사시킵니다.
2. 위의 기준에 따라 건강(0)에서 중증(15)의 총 임상 점수에 대한 개별 점수를 더합니다. 총점이 2 이상인 마우스는 아픈 것으로 간주합니다. 총 점수가 9점 이상이거나 각 기준에 대해 표시된 점수를 나타내는 마우스를 인도적으로 안락사시키고 생존 곡선에 표시하십시오.

6. 박테리아 계수를 위한 감염된 조직 처리

1. IAV 감염 후 48시간에, 마우스를 안락사시킨다.
2. 마우스를 앙와위 자세로 놓습니다. 70 % 에탄올을 사용하여 마우스의 가슴과 복부에 스프레이하여 모피를 청소하십시오. 집게를 사용하여 마우스 중앙의 털과 피부를 꼬집고 4.5 절개 가위로 털을 잘라 간에서 가슴까지 해당 부위를 노출시킵니다.
3. 채혈
   1. 해부 가위를 사용하여 복강을 부드럽게 잘라 간을 노출시킵니다. 집게를 사용하여 횡격막 근처의 간 상단에있는 간문맥을 노출시킵니다. 해부 가위를 사용하여 간문맥을 자릅니다. 혈액이 복강에 고이기 시작하면 마이크로피펫을 사용하여 혈액 10μL를 수집하고 박테리아 부담을 위한 도금용 미세 원심분리기 튜브에 항응고제 용액 90μL(PBS의 50mM EDTA 용액)에 넣습니다.
   2. P-1000 마이크로피펫을 사용하여 나머지 혈액을 채취하여 채혈관에 넣고 7,600× g 에서 2분 동안 원심분리하여 혈청을 채취합니다. 원하는 사이토카인 또는 대사산물의 후속 분석을 위해 -80°C의 미세 원심분리 튜브에 혈청을 저장합니다.
4. 폐 수집
   1. 해부 가위를 사용하여 노출된 흉곽의 측면을 잘라내고 갈비뼈를 마우스 머리 쪽으로 부드럽게 당겨 심장을 노출시킵니다. PBS로 미리 채워진 10mL 주사기에 부착된 25G 바늘을 우심실에 삽입하고 천천히 관류를 시작합니다. 성공적인 관류의 지표로 폐 표백을 찾으십시오. 폐 조직이 부러지지 않도록 천천히 씻어 내십시오.
   2. 집게로 심장을 들어 올리고 폐와 심장을 분리하기 위해 절개하십시오. 분리되면 집게로 폐의 모든 엽을 집어 들고 멸균 PBS가 든 접시에 헹구어 잔류 혈액을 제거합니다. 페트리 접시에 폐를 작은 조각으로 다지고 잘 섞는다. 박테리아 CFU 또는 바이러스 PFU를 측정하기 위해 폐 혼합물의 절반을 제거하고 균질화를 위해 0.5mL의 PBS로 미리 채워진 둥근 바닥 15mL 튜브에 넣습니다.
      참고: 다양한 평가를 위해 동일한 폐의 다른 엽을 사용하지 않는 것이 중요합니다. 대신, 모든 로브를 다지고, 잘 혼합하고, 다른 평가를 위해 동등하게 구문 분석해야 합니다.
   3. 유세포 분석을 위해 폐의 나머지 절반을 제거하고(아래 섹션 7) 각 웰에 0.5mL의 RP-10이 미리 채워진 비조직 배양 처리된 24웰 플레이트에 넣습니다. 처리 될 때까지 실온에서 방치하십시오.
5. 비 인두 수집
   1. 목에서 해부 가위를 사용하여 털을 잘라낸 다음 근육을 잘라내어 기관을 노출시킵니다.
      참고: 기관은 근육 아래에 위치한 튜브 모양의 구조입니다.
   2. 마우스의 턱에서 1cm 떨어진 기관 아래에 작은 집게를 놓아 안정화시킵니다. 해부 가위를 사용하여 기관을 완전히 절단하지 않고 기관 앞부분에 0.1cm 슬릿을 부드럽게 만듭니다.
   3. 25G 바늘에 부착된 0.58mm 튜브가 있는 0.5mL의 PBS로 채워진 1mL 주사기를 준비합니다. 튜브를 비인두를 향해 위쪽으로 가는 기관에 삽입하여 비강 세척액을 수집합니다. 저항이 비강으로 들어가는 것이 느껴지면 미세 원심 분리기 튜브를 코에 놓고 기관을 통해 PBS를 천천히 씻어내어 비강 세척을 수집합니다.
   4. 마우스를 엎드린 자세로 놓습니다. 마우스의 머리에 에탄올을 뿌립니다. 해부 가위를 사용하여 털을 자르고 신비한 패드를 사용하여 마우스의 머리 뼈를 노출시킵니다.
   5. 해부 가위를 사용하여 하악의 측면과 눈 사이를 1cm 자릅니다. 집게를 사용하여 얼굴 뼈를 몸에서 천천히 당겨 비강을 노출시킵니다.
   6. 집게를 사용하여 비강 조직을 부드럽게 제거하고 균질화를 위해 0.5mL의 PBS로 미리 채워진 둥근 바닥 튜브에 넣습니다.
6. 수집된 조직을 균질화하려면 먼저 70% 에탄올에 넣고 60% 전력으로 30초 동안 균질기를 켜서 균질화 프로브를 세척합니다. 멸균 된 물에서 10 초 동안 단계를 반복하십시오. 각 조직을 1분 동안 균질화합니다. 균질화기 프로브를 멸균수로 세척합니다.amp각 s와 각 기관 사이의 70% 에탄올이 함유된 신선한 튜브에서amp르 그룹.
7. 박테리아 수의 열거
   1. 모든 장기가 적출되고 균질화되면 혈액 한천 플레이트에 연속 희석액을 플레이트합니다. 총 CFU를 계산하려면 10μL를 사용하여 각 샘플의 최종 부피(mL)를 플레이트에 기록하고 기록합니다. 3μg/mL 겐타마이신이 보충된 혈액 한천 플레이트에 비인두 샘플을 플레이트하여 해당 조직에 서식하는 다른 미생물의 성장을 억제하면서 S. pneumoniae 의 성장을 선택합니다. 37°C/5%_CO2에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   2. 폐와 비 인두에 대한 박테리아 CFU를 열거하려면 먼저 혈액 한천 플레이트의 콜로니를 세십시오. 그런 다음 방정식 (1)과 방정식 (2)를 사용하여 mL당 양과 총 수를 계산합니다.
      mL당 양 = 콜로니 수 × 희석 계수 × 100 (1)
      총 수 = mL당 양 × 샘플당 총 부피(2)
      참고: 방정식 (1)에서 100은 10μL가 도금되기 때문에 곱하는 데 사용되며, 이는 1mL의 100배 희석입니다. 식 (2)의 샘플 당 총 부피는 6.7.1 단계로부터이며, 이는 기관 당 100의 검출 한계를 초래합니다.
   3. 박테리아 CFU를 열거하려면 균혈증의 경우 먼저 혈액 한천 플레이트의 콜로니를 세십시오. 그런 다음 방정식 (3)을 사용하여 혈액 mL당 양을 결정합니다.
      혈액 mL당 양 = 집락 수 × 희석 계수 × 100 × 10 (3)
      참고: 식 (3)에서 100은 10μL를 도말로 사용하며, 이는 1mL의 100배 희석이며, 10은 항응고제에서 혈액의 1:10 희석을 나타냅니다. 그 결과 검출 한계는 1,000/mL입니다.

7. 유세포 분석을 위한 폐 샘플 처리

1. 다음과 같이 필요한 미디어를 준비합니다.
   1. 2.1단계에서 설명한 대로 RP-10을 준비합니다.
   2. RP-10을 2mg/mL 콜라게나제 및 30μL/mL DNase I과 혼합하여 분해 완충액을 준비합니다.
   3. 1L의_H2O에 8.29g의_NH4Cl, 1g의_NaHCO3 및 0.038g의 EDTA를 용해시켜 용해 완충액을 제조한다.
   4. HBSS 450mL와 열 비활성화 FBS 50mL 및 아지드화나트륨 5g을 혼합하여 10x FACS 완충액을 준비합니다.
   5. 450mL의 HBSS에 50mL의 10x FACS 완충액을 희석하여 1x FACS 완충액을 준비합니다.
2. 6.4.3 단계에서 폐 샘플을 채취하여 24웰 플레이트에 넣습니다. 500 μL의 소화 완충액을 각 웰에 첨가한다. 37°C/5%_CO2에서 45분, 최대 1시간 동안 배양합니다.
3. 각 샘플에 대해 50mL의 원뿔형 튜브를 5mL의 RP-10으로 미리 채웁니다. 배양이 끝나면 50mL 원뿔형 튜브 상단에 100μm 필터를 놓고 1mL의 RP-10으로 적십니다.
4. P-1000 마이크로피펫을 사용하여 소화된 폐를 움직여 필터에 올려 놓습니다. 3mL 주사기의 플런저를 사용하여 장기를 으깬다. 매번 RP-10 1mL로 2회 헹굽니다.
5. 샘플을 4°C 및 327× g 에서 5분 동안 회전시킵니다. 상층액을 흡인하고 펠릿을 용해 완충액 1mL에 재현탁합니다. 적혈구가 용해될 수 있도록 3분 동안 그대로 두십시오. 5mL의 RP-10으로 중화합니다.
6. 샘플을 4°C 및 327× g 에서 5분 동안 회전시킵니다. 상층액을 흡인하고, RP-10 1mL에 펠렛을 재현탁하고, 샘플 계수를 위해 10 μL를 취한다.
7. 샘플을 4°C 및 327×g에서 5분 동안 회전시킵니다. 상층액을 흡인하고 2 ×¹⁰ 6-4 × 10⁶ cells/mL에서 RP-10의 펠릿을 다시 현탁합니다. 각 샘플 60 μL를 96-웰 플레이트에 추가하여 단계 7.9, 표 5 및 표 6에 나열된 원하는 세포 유형²³에 대해 염색합니다.
8. 플레이트를 4°C 및 327× g 에서 5분 동안 회전시킵니다.
9. 한편, 원하는 항체로 항체 마스터 믹스, 형광 마이너스 원(FMO) 및 단일 염색 대조군을 준비합니다. 다형핵 백혈구(PMN), 대식세포, 단핵구, 수지상 세포 및 T 세포를 염색하려면 표 5 및 표 6에 나열된 항체 및 최종 희석액을 사용하십시오. 항체 혼합물의 총 부피 100μL/웰을 사용합니다. 마스터 믹스의 적절한 부피와 필요한 개별 항체를 결정하기 위해 표에 나열된 희석액을 따르십시오.
10. 스핀이 완료되면(단계 7.8), 상청액을 경사로 처리하고, 항체 혼합물, FMO 또는 단일 염색 대조군 100μL에 펠릿을 재현탁하고, 어둠 속에서 30분 동안 얼음 위에서 배양합니다.
11. 150 μL의 FACS 완충액을 웰에 첨가하고, 플레이트를 4°C 및 327 × g 에서 5분 동안 회전시켜 세포를 2x 세척하였다.
12. 스핀이 완료되면 상층액을 경사 조절하고 펠릿을 100μL의 고정 완충액에 재현탁하고 얼음에서 20분 동안 배양합니다.
13. 150 μL의 FACS 완충액을 웰에 첨가하고, 플레이트를 4°C 및 327 × g 에서 5분 동안 회전시켜 세포를 2배 세척하였다.
14. 200μL의 FACS 버퍼로 표지된 FACS 튜브를 준비합니다. 펠릿을 150μL의 FACS 완충액에 재현탁합니다. 100μm 필터를 사용하여 각 샘플을 해당 FACS 튜브로 개별적으로 필터링합니다. 얼음 위 또는 4°C에서 보관하고 분석할 준비가 될 때까지 빛으로부터 보호하십시오.
15. 유세포 분석기를 이용하여 세포를 분석한다.

8. IAV 열거를 위한 플라크 분석

1. 다음과 같이 필요한 미디어를 준비합니다.
   1. 소혈청알부민(BSA) 2.5g을 DMEM 40mL에 용해시켜 감염배지를 준비하고, 용해될 때까지 37°C에서 10-20분 동안 교반한다. 460mL의 DMEM으로 필터 멸균합니다.
   2. 1.2mg의 미결정셀룰로오스를 50mL의_H2O에 용해시켜 2.4% 미결정셀룰로오스를 제조한다.
   3. 37°C에서 10-20분 동안 교반하면서 BSA 2.5g을 DMEM 40mL에 용해시켜 BSA DMEM 5%를 준비합니다. 나머지 10mL의 DMEM을 추가하여 최종 부피가 50mL가 되도록 합니다. 필터 멸균 및 4 °C에서 보관하십시오.
   4. 5% BSA DMEM 1mL와 2x MEM 9mL를 혼합하여 2x MEM/0.5% BSA를 준비합니다.
   5. 2.4% 미세결정성 셀룰로오스와 2x MEM/0.5% BSA를 1mg/mL TPCK(키모트립신 억제제) 트립신과 1:1 비율로 혼합하여 저점도 오버레이 배지를 준비합니다.
   6. 10mL의 EMEM(Eagle's Minimum Essential Medium)과 450mL의 열 비활성화 FBS를 혼합하여 EMEM/50% FBS를 준비합니다.
2. Madin-Darby 개 신장(MDCK) 세포주를 성장시킵니다. 구입한 바이알 1개에서 세포를 T-25 조직 배양 처리 플라스크의 EMEM/10% FBS 5mL에 추가합니다. 세포가 100% 합류에 도달할 때까지 37°C/5% CO₂ 에서 3-5일 동안 배양합니다. 2.3단계에서와 같이 밀도를 확인합니다.
3. 배양 배지를 제거하고 버리고 5mL의 실온 PBS로 2x 헹굽니다. 플라스크에 트립신-EDTA 1mL를 넣고 세포가 분리될 때까지 37°C/5% CO₂ 에서 10-15분 동안 배양합니다. 들어 올리면 4mL의 EMEM/10% FBS로 중화하여 2 ×^{10 5} cells/mL의 세포 현탁액을 얻습니다.
4. 플라크 분석을 시작하기 1일 전에 웰당 1mL의 재현탁 세포(2 × 10⁵ cells/well)를 추가하여 MDCK 세포를 12웰 조직 배양 처리된 플레이트에 시드합니다.
   알림: 사용하기 전에 세포가 100% 밀도에 도달했는지 확인하고 밀도에 도달하기 위해 필요한 경우 더 오래 배양하십시오.
5. 표준으로 사용하려면 10 단계에 나열된 감염 배지에서 IAV 스톡 (알려진 역가의)을 10 배 연속 희석 (6-10-8.1.1^{)하십시오}. 각 희석액 1.2mL를 만들어 세 번 테스트합니다.
6. 장기 균질액을 얼음에서 해동하십시오. 2,000 × g 의 탁상용 원심분리기에서 회전하여 투명한 상층액을 수집합니다.
7. 8.5 단계를 반복하되 8.6 단계의 샘플에서 상청액을 사용합니다.
8. 세포로부터 배지를 흡인하고 1 mL의 PBS로 2x 세척하여 모든 FBS를 제거하였다.
9. 각 표준 희석액 또는 연속 희석된 샘플 300μL를 각 웰의 측면을 따라 가장 높은 희석액부터 가장 낮은 희석액까지 부드럽게 추가하고 이를 세 번 수행합니다.
10. 플레이트를 37°C/5%_CO2의 인큐베이터에 넣고 총 50분 동안 10분마다 플레이트를 흔들었습니다. 인큐베이터에 평평하게 놓고 쌓지 마십시오.
11. 50분 후, 세포를 1 mL의 PBS로 2x 세척하였다.
12. 저점도 오버레이 배지 2mL를 가장 희석이 적고 바이러스가 없는 웰을 제외한 각 웰에 추가합니다. 여기에 감염 배지와 트립신을 첨가하십시오.
13. 플레이트를 37°C/5%_CO2 의 인큐베이터에 2-4일 동안 다시 넣어 육안으로 시각화할 수 있는 플라크를 얻습니다.
14. 플레이트를 측면으로부터 빠르게 각 웰에 2 mL의 PBS를 첨가하여 세척하고, 침전된 저점도 오버레이 배지를 현탁시키기 위해 부드럽게 흔들었다.
15. 배지를 부드럽게 피펫팅하여 웰의 전체 액체 부피를 버립니다.
16. 각 웰에 PBS 2mL로 세척을 한 번 더 반복한 다음 부드러운 피펫팅으로 전체 액체 부피를 버립니다.
17. 플라크를 고정하려면 500μL의 4% 파라포름알데히드를 각 웰에 넣고 흔들고 30분 동안 그대로 두십시오.
18. PBS 1mL로 측면을 천천히 씻으십시오. 그런 다음 액체를 부드럽게 버리십시오.
19. 500 μL의 1 % 크리스탈 바이올렛 (물에 희석)을 각 웰에 첨가하여 세포 단층을 덮습니다. 5분 동안 배양합니다.
20. 수돗물 1mL로 씻으십시오. 부드러운 피펫팅으로 우물에 있는 모든 액체를 버리십시오. 기저귀 패드에 접시를 거꾸로 놓고 밤새 건조시킵니다.
21. 플라크를 시각적으로 계산하고 사용 가능한 이미저에 이미지를 저장합니다.

생물막 성장 S. pneumoniae(그림 1A)는 마취되지 않은 마우스에 비강 내로 전달된 작은 10μL 접종물을 사용하여 마우스(그림 1B)를 감염시키는 데 사용되었습니다. 이 소량 접종물은 전신 확산을 피하면서 비인두로 제한되는 일관된 폐렴구균 운반을 초래합니다(그림 2A, +sp 그룹). 비강내 접종 이틀 후, 마우스는 비인두와 폐에 특정 양을 일관되게 전달하기 위해 비강내 및 기관내로 전달되는 쥐 적응 H1N1 인플루엔자 A 바이러스 A/PR/8/34 (IAV)22,30에 감염되었다 23.

여기서, 이 모델은 균혈증으로 진행되는 폐렴을 유발하는 침습성 균주인 TIGR4 및 D39와 중이염 균주인 EF3030을 포함하여 S. pneumoniae의다른 균주로 비강 내 도전된 마우스에서 바이러스 감염 후 질병 경과를 비교하는 데 사용되었습니다. S. pneumoniae/IAV 동시 감염 마우스의 질병 발현은 박테리아 균주에 의존적이었습니다(그림 2). 모든 균주 중에서 비인두의 박테리아 수에는 유의미한 차이가 없었지만(그림 2A), S. pneumoniae TIGR4 및 D39(EF3030은 아님)는 IAV 감염 후 48시간까지 폐로 전파되었습니다(그림 2B). S. pneumoniae TIGR4에 비강 내 감염된 마우스의 40%가 폐로 박테리아 전파를 나타냈고, 그 중 절반은 균혈증이 되었으며(그림 2C), 이는 이전 연구 결과와 일치합니다23.

S. pneumoniae D39로 비강내 감염된 마우스는 동시 감염된 마우스의 100%에서 폐로의 확산이 관찰되었기 때문에 보다 효율적인 파종을 보였다(도 2B). S. pneumoniae TIGR4와 유사하게, 그 중 절반이 균혈증을 경험했습니다(그림 2C). 박테리아 균주에 관계없이 전체 생존율을 추적함에 있어서, 동시 감염된 마우스의 생존율은 테스트된 모든 균주에 대해 S. pneumoniae만 단독으로 챌린지된 마우스보다 유의하게 낮았다(그림 2D). IAV 단독으로 챌린지된 대조군 마우스와 비교하여, EF3030이 아닌 S. pneumoniae TIGR4 및 D39에 비강내 감염된 마우스는 가속화된 질병 비율을 나타냈다. IAV 감염 후 2일째까지 마우스의 30%(D39) 및 20%(TIGR4)가 굴복한 반면, IAV 전용 대조군은 챌린지 후 5일까지 굴복하기 시작하지 않았습니다(그림 2D). S. pneumoniae EF3030 및 IAV에 동시 감염된 마우스는 IAV 전용 대조군과 더 유사한 지연 증상을 보였다(그림 2D). 이러한 발견은 동시 감염 모델이 박테리아 균주에 의존하는 젊은 건강한 마우스에서 질병을 초래한다는 것을 보여주며, 이는 질병 진행의 각 단계에서 필요한 박테리아 요인을 탐색하는 데 이상적입니다.

이 모델은 S. pneumoniae 의 다른 균주를 비강 내 접종한 마우스에서 IAV 감염 후 폐에 있는 다양한 면역 세포의 존재를 평가하는 데 사용되었습니다(그림 3의 세포 유형 및 게이팅 전략). IAV 감염 후 폐로 분산된 박테리아 균주 D39 및 TIGR4는 호중구(PMN) 및 단핵구와 같은 순환계에서 염증성 면역 세포의 유입이 기준선(감염되지 않은) 이상으로 크게 증가한 반면 EF3030은 그렇지 않았습니다(그림 4A-C). IAV 감염 단독은 NK 세포 및 감마-델타 T 세포와 같은 바이러스 감염에 대한 숙주 방어에 중요한 면역 세포의 유입에서 기준선보다 유의한 증가를 유도했습니다(그림 4A-C). 이러한 항바이러스 반응은 바이러스 챌린지 전에 S. pneumoniae에 비강내 감염된 마우스에서 유의하게 둔화되었습니다(그림 4A-C). 이는 사이토카인 반응을 평가한 선행 연구에서 S. pneumoniae가 I형 인터페론의 생성을 둔화시키고 폐에서 IAV 부하를 조절하는 숙주의 능력을 손상시킨다는 것을 발견했다23. 이러한 발견은 동시 감염 모델이 단일 대 다미생물 감염에서 면역 반응이 어떻게 변하는지 연구하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다.

이 모델은 또한 S. pneumoniae 에 비강내 감염된 마우스에서 IAV 감염 후 질병 경과에 대한 노화의 영향을 평가하기 위해 사용되었습니다. 단독으로 감염된 마우스에서 바이러스 역가는 젊은 코호트와 노인 코호트 간에 변하지 않았습니다(그림 5A)23. 이전 연구(23)에서와 같이, 늙은 쥐는 더 높은 임상 점수에 의해 입증된 바와 같이 젊은 쥐에 비해 더 일찍 그리고 훨씬 더 심각한 질병 징후를 나타냈다(그림 5B). 질병 증상과 일치하게, S. pneumoniae 를 접종한 늙은 쥐는 IAV 감염 후 24시간 이내에 더 빨리 죽기 시작했고, 모두 질병에 굴복한 반면, 젊은 대조군은 감염에서 유의하게 더 높은(33%) 비율로 생존했습니다(그림 5C). 이러한 발견은 동시 감염 모델이 취약한 숙주에서 더 심각한 질병을 감지하는 데 사용될 수 있음을 보여주며, 동시 감염에 대한 내성 또는 감수성을 부여하는 숙주 인자를 탐색하는 데 이상적입니다.

그림 1: 면역 세포 유입 및 병원체 부담 평가를 위한 동시 감염 및 장기 처리 일정. (A) 폐렴 연쇄상 구균은 생물막에서 자랍니다. (B) 마우스에 표시된 생물막 성장 S. pneumoniae 균주의 5 ×10 6 CFU를 비강 내 접종하여 비인두 운반을 확립하거나 치료하지 않은 채로 둡니다. 48시간 후, 마우스를 PBS로 모의 처리하거나 비강내 인플루엔자 A 바이러스 PR8 200PFU 및 기관내 20PFU를 투여받습니다. 마우스는 임상 질병 점수 및 생존에 대해 시간 경과에 따라 모니터링됩니다. (C) IAV 감염 후 48시간에, 다른 장기의 박테리아 CFU 또는 바이러스 PFU 또는 폐의 면역 세포 유입을 평가합니다. 약어: CFU = 집락 형성 단위; PFU = 플라크 형성 단위; IAV = 인플루엔자 A 바이러스 PR8; IT = 기관 내; NP = 비인두. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: S. pneumoniae 접종 마우스의 이중 비강내/기관내 IAV 감염은 박테리아 확산 및 박테리아 균주에 의존하는 질병을 유발합니다. 어린(10-12주령) 수컷 C57BL/6(B6) 마우스가 도 1에서와 같이 감염되었다. (A) 비인두, (B) 폐 및 (C) 혈액의 박테리아 수는 모두 IAV 감염 후 48시간에 결정되었습니다. (나,씨) 백분율은 확산을 보인 마우스의 비율을 나타냅니다. (D) IAV 감염 후 10일 동안 생존율을 모니터링하였다. 그룹당 (A,B) n = 5, (C) n = 11 및 (D) n = 6 마우스의 풀링된 데이터가 표시됩니다. 각 원은 하나의 마우스에 해당하며 점선은 감지 한계를 나타냅니다. (A-C)*는 Kruskal-Wallis 검정에 의해 결정된 바와 같이 지시된 그룹들 사이에 유의한 차이(p < 0.05)를 나타낸다. (d)*는 로그-랭크 (Mantel-Cox) 시험에 의해 결정된 바와 같이 박테리아 균주 당 +sp 및 Co-inf 마우스 사이에 유의한 차이 (p < 0.05)를 나타낸다. 약어: +sp = 표시된 균주만을 사용하여 박테리아로 비강 내 감염된 마우스; Co-inf = IAV에 감염된 박테리아 감염 마우스; IAV = 인플루엔자 A 바이러스를 투여받은 마우스; CFU = 집락 형성 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 면역 세포 게이팅 전략. 폐를 채취하고, 면역 세포 유입을 유세포 분석에 의해 측정하였다. 상이한 세포 유형의 대표적인 게이팅 전략이 보여진다. (A) CD45+, 살아있는 단세포에 게이팅을 하고, (B) PMN(Ly6G+, CD11b+), 대식세포(Ly6G-, Ly6C-, F480+) 및 단핵구(Ly6G-, Ly6C+), (C) DC(Ly6G-, CD11c+) 및 NK 세포(NK1.1+, CD3-), (D) TCR-γΔ 및 CD8(CD8+, TCRβ+) 및 CD4(CD4+, TCRβ+ ) T 세포를 결정하였다. 약어: SSC-A = 측면 산란-피크 면적; FSC-A = 전방 산란-피크 면적; FSC-H = 전방 산란-피크 높이; SSC-W = 측면 산란 피크 폭; L/D = 살아 있는/죽은 것; FMO = 형광 마이너스 1; NK = 자연 살해; PMN = 다형핵 백혈구; DC = 수지상 세포; TCR = T 세포 수용체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 폐 면역 반응은 박테리아 균주에 따라 다릅니다. 어린(10-12주령) C57BL/6 수컷 마우스는 감염되지 않았거나, 표시된 폐렴구균 균 주(+sp)를 단독으로 접종하거나, IAV(IAV)로 단독으로 접종하거나, S. pneumoniae 와 IAV(Co-inf)에 동시 감염되었습니다. IAV 감염 후 48시간 후(그림 1의 실험 설계 참조), 폐를 채취하고, 면역 세포 유입을 그림 3의 게이팅 전략에 따라 유세포 분석에 의해 측정했습니다. (A) CD45 게이트 내에서 표시된 각 세포 유형의 평균 백분율은 히트 맵의 모든 치료 그룹에 대해 표시됩니다. (B) 처리 간에 유의한 차이를 보인 세포 유형의 대표적인 도트 플롯이 각 마우스 그룹에 대해 표시됩니다. (C) 표시된 면역 세포 유형의 백분율이 표시됩니다. 각 원은 하나의 마우스에 해당합니다. (ᄀ,ᄃ) 그룹당 n=5마리 마우스로부터의 풀링된 데이터가 도시되어 있다. *, Co-inf와 감염되지 않은 사람 사이에 유의한 차이(p < 0.05)를 나타내고; $는 IAV와 감염되지 않은 것 사이의 유의성을 나타내고; #는 Co-inf와 IAV 단독의 유의한 차이를 나타낸다. 각 세포 유형에 대한 챌린지 그룹 간의 유의미한 차이는 ANOVA에 이어 Tukey 테스트에 의해 결정되었습니다. 약어: NK = 자연 살해; PMN = 다형핵 백혈구; DC = 수지상 세포; TCR = T 세포 수용체; IAV = 인플루엔자 A 바이러스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 노화 및 IAV/Streptococcus pneumoniae 동시 감염에 대한 숙주 감수성 증가. 젊은(10-12주) 및 노화된(21-22개월) C57BL/6 수컷 마우스는 S. pneumoniae TIGR4 i.n. 및 IAV i.n. 및 i.t. (그림 1에서와 같이) 또는 IAV 단독으로 단독으로 챌린지되었습니다. (A) 바이러스 역가는 48시간 후에 결정되었습니다. 별표는 스튜던트 t-검정에 의해 결정된 통계적 유의성(p < 0.05)을 나타냅니다. 데이터는 그룹당 n = 4마리의 마우스에서 풀링됩니다. (B) 임상 점수 및 (C) 생존율을 시간 경과에 따라 모니터링하였다. (B) 그룹당 n=6 마우스로부터 풀링된 평균 SEM ± 나타내었다. 별표는 Mann-Whitney 테스트에 의해 결정된 바와 같이 표시된 시점에서 어린 마우스와 늙은 마우스 사이의 통계적 유의성(p < 0.05)을 나타냅니다. (C) 데이터는 그룹당 n=6마리의 마우스로부터 풀링된다. 별표는 로그-랭크(Mantel-Cox) 검정에 의해 결정된 바와 같이 어린 마우스와 늙은 마우스 사이의 통계적 유의성(p < 0.05)을 나타낸다. 약어: IAV = 인플루엔자 A 바이러스; i.n. = 비강내; i.t. = 기관내; SEM = 평균의 표준 오차. 그림 5A는 Joma et al.23의 허가를 받아 재인쇄되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: CDM에 대한 믹스 I, II, III 및 IV 주식. 약어: CDM = 화학적으로 정의된 매체.

표 2: CDM용 비타민 믹스 스톡. 약어: CDM = 화학적으로 정의된 매체.

표 3: CDM에 대한 아미노산 스톡. 약어: CDM = 화학적으로 정의된 매체.

표 4 : CDM에 대한 스타터 재고 및 최종 보충제. 약어: CDM = 화학적으로 정의된 매체.

표 5: 항체 패널 1.

표 6: 항체 패널 2.

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.