방법 논문

9 일 된 마우스 신생아의 간외 담관 및 담낭 박리

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DOI:

10.3791/64424

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2022년 8월 23일

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1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2Research Laboratory for Pediatric Surgery, 3Research Animal Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

이 논문에서

요약

쥐 신생아 담관 장애를 관찰하려면 손상되지 않은 담관과 효율적인 준비가 필요합니다. 따라서 쥐 신생아에서 전체 간외 담관 시스템을 분리하기위한 새로운 접근법이 담관의 완전성을 유지하면서 성공적으로 개발되었습니다.

초록

쥐 신생아 담관의 해부는 어려운 것으로 묘사되었습니다. 설명 된 표준 수술 절차의 주요 목적은 준비 중에 담관을 손상시키지 않고 마우스 신생아에서 간외 담관 (EBD)을 분리하는 것입니다. 담관 세포 세포주와 비교하여 예외적으로 가까운 준비 및 전체 간외 담관 시스템 (EBDS)의 수확으로 인해 설명 된 접근법은 담도 폐쇄증과 같은 신생아 담관 장애의 동물 모델을 연구하는 데 매우 유용합니다. 안락사 후 복강에 접근하고 담관 시스템, 십이지장 및 간을 독특한 En-bloc-Reclause (EbR)로 추출했습니다. 추출된 샘플을 폼 매트 위에 놓고 EBD를 오염된 세포에서 해부하여 필요한 접촉 없이 외상으로 제거합니다. 전체 EBDS의 해부는이 방법의 중요한 이점입니다. 담관 조직의 크기와 양이 작기 때문에주의를 기울여야합니다. 설명 된 기술을 사용하면 담관 세포에 손상이 없습니다. 또한, 기술의 순도는 재현 가능하다 (n = 10). 따라서 최적으로 비교 가능한 샘플을 수확 할 수 있습니다. 또한 담관 조직에는 담즙 조직이 손상되지 않는데, 이는 준비 중에 담관 시스템과의 접촉을 피할 수 있기 때문에 담낭 내부에 담액이 남습니다. 가장 중요한 것은 최종 담낭 및 담관 박리를 수행하는 동안 외상성 미세 도구를 압박하지 않고 담관의 약간 측면에서만 사용했습니다. 이것은 깨끗하고 손상되지 않은 샘플의 핵심이며 추가 조직 학적 조사 또는 담관 세포의 분리에 필수적입니다. 요약하자면, 설명된 혁신적인 해부 기술을 통해 필요한 장비를 갖춘 특히 경험이 없는 작업자가 EBDS를 가능한 한 깨끗하게 격리할 수 있습니다.

서론

담도 폐쇄증, 원발성 경화성 담관염(PSC) 및 원발성 담즙성 담관염(PBC)과 같은 담관병증의 기원과 진행은 알려지지않았거나 불완전합니다1,2. 이러한 질병의 기원과 진행에 대한 제한된 이해는 치료 옵션의 부족으로 이어집니다3. 신생아 담관 장애를 연구하는 데 가장 어려운 장애물은 병태생리학에 대한 분자적 이해를 얻는 것입니다. 분자 병리학을 더 잘 이해하기 위한 필수 열쇠 중 하나는 영향을 받은 조직을 최대한 관찰하는 것입니다. 담도 폐쇄증4의 잠재적 인 바이러스 병인을 관찰하는 것과 같은 연구 간의 비교 가능성 및 불일치 감소를 피하기 위해, 수행 된 해부 기술의 최상의 준비 및 공유가 필요합니다. 표적 조직의 순수한 준비는 나중에 현미경 조사 또는 세포 및 3D 오가노이드 배양 육종에 필요합니다. 그러나 쥐 신생아 장애에서 조직 샘플은 드물고 크기가 매우 작기 때문에 소량 만 발생합니다. 담관 장애와 관련하여 쥐 신생아에서 담관을 깨끗하게 준비하는 데 어려움이 설명되었습니다5. 신생아 발달 단계로 인해 조직 분화가 지나치게 진행되지 않아 성인 샘플 준비에 비해 준비가 복잡해지고 어려움이 증가합니다. 따라서 운영 작업 그룹은 신생아 마우스 모델에서 EBDS를 준비하기 위한 새로운 전략을 조사했습니다. 본 연구에서이 기술은 효율적입니다각 샘플의 해부.

담관 시스템은 간에서 발생하는 오른쪽 상복부에 복강 내 배치됩니다. 담낭은 간 우엽의 내장 표면 아래에 있습니다. 담관은 문맥 및 간동맥과 함께 간십이지장 인대에 내장되어 있습니다. 간과 십이지장을 직접 연결하고 담즙액을 십이지장6으로 배출합니다. 해부학 적으로 담관은 오른쪽 및 왼쪽 간관, 총 간관, 낭성 관 및 낭성 관과 총 간관의 합류에 의해 형성되는 담관7로 나뉩니다. 이것은 결국 담액과 타액을 췌관에서 Vater의 팽대부를 통해 십이지장으로 비웁니다.

담관 세포는 담관 내 및 간외로 늘어서 있으며 담즙 생성과 항상성을 돕는 복잡한 해부학 적 틈새에 거주합니다8. 담액은 이러한 특수 상피 세포를 매일 고농도로 통과합니다. 특히, HCO3-우산 유지는 담즙산 독성으로부터 보호하기 위해 매우중요하다9. 담관 세포는 예를 들어 내강 미생물10에 대한 간 담도계의 첫 번째 방어선입니다. 독성 공격에 대한 담관 세포의 방어 효능은 유전 적 소인에 의해 약화 될 수 있습니다. 독성 과부하는 손상과 파괴를 유발하므로 담관 병증을 유발할 수 있습니다. 더욱이, 발달중인 담관은 모든 자기 보호 메커니즘을 완전히 할 수 없으며, 신생아 담관11에서 환경 독소에 대한 더 높은 감수성을 유도합니다.

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프로토콜

윤리적 승인(N045/2021)에 따라 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스 신생아를 9일령까지 관찰했습니다. 동물들은 독일 함부르크의 함부르크-에펜도르프 대학 의료 센터의 동물 시설에서 실험 목적으로 태어나 제공되었습니다. 신생아는 부모 동물과 함께 새장에 수용되었습니다. 환경 조건은 온도 (20-24 ° C), 12:12 h 명암 사이클 및 40 % -70 %의 상대 습도로 제어되었습니다.

1. 실험 준비

  1. 가위, 집게 등을 포함하여 외과 수술에 필요한 장비를 준비하십시오 ( 재료 표 참조).
  2. 소독 및 오토클레이브된 기구를 수술 테이블 옆의 멸균 표면에 놓습니다.
  3. P9 세 신생아 마우스를 수술 가위로 참수하여 신속하게 안락사시킵니다. 안락사된 신생아 마우스의 시신을 멸균 수술장에 놓습니다. 생후 9일 된 마우스 신생아의 EBDS를 해부합니다(5단계).
    참고: 설명된 해부 절차는 모든 과학자에게 신생아 및 노령 마우스에서 EBDS를 제거할 수 있는 적절한 도구를 제공합니다. 마우스가 오래 될수록 준비가 더 쉽습니다.

2. 복강에 대한 접근

  1. 포셉으로 방광 위치 위의 피부를 잡으십시오. 복막과 기본 구조를 손상시키지 않고 가위를 사용하여 피부에 직경 2mm의 구멍을 절개하십시오. 왼쪽 앞 겨드랑이 선을 따라 참수 위치까지 절단을 확장합니다. 외상성 집게로 왼쪽에서 오른쪽으로 피부를 제거하십시오.
  2. 비장을 둘러싼 복막을 잡으십시오. 복막이 텐트와 같은 구조와 비슷해질 때까지 부드럽게 들어 올리고 중앙에 직경 1mm의 구멍을 자릅니다. "복막 텐트"가 공기로 채워질 때까지 기다리십시오. 이 단계와 다음 단계에 10x 현미경 배율을 사용합니다.
  3. 갈비뼈 아래쪽, 양쪽 측면 복부 및 아래쪽 방광 영역으로 둘러싸인 창에서 복막을 잘라 간, 담관 시스템, 위, 소장 및 결장에 완전히 접근 할 수 있도록합니다.
    알림: 간에 대한 접근성을 향상시키기 위해 추가 절개를 수행하여 검상돌기, 열판 인대, 간 및 담관 구조를 그대로 유지하면서 가장 낮은 세 개의 갈비뼈를 제거할 수 있습니다. 간장의 견해는 쉽게 얻을 수 있습니다.

3. 담낭 및 담관 검사

알림: 다음 모든 단계에서 정기적으로 샘플을 젖게 유지하십시오.

  1. 담즙 방광을 검사하기 위해 두개 복부 위치에서 xiphoid 과정을 조심스럽게 당깁니다.
    알림: 이 동작으로 열판 인대의 장력이 증가하고 부착된 담낭이 보입니다.
    1. 담관 시스템에서 담낭이 찢어질 수 있는 대열 인대의 통제할 수 없는 찢어짐을 피하기 위해 약간만 당기십시오. 다음 단계 전에 검상돌기의 당김을 해제합니다.
  2. 십이지장을 부드럽게 아래로 당겨 담관 시스템을 자유롭게합니다.
    알림: 간십이지장 인대의 긴장이 증가함에 따라 담관 조직이 보입니다.

4. 엔블록 절제술

  1. 아래 단계에 따라 하위 en-bloc-mobilization을 수행하십시오.
    1. 담관 시스템을 십이지장에 연결하는 십이지장 유두를 확인하십시오.
    2. 유두의 오른쪽 측면에서 약 2cm 떨어진 십이지장을 자릅니다.
    3. 유문 부위를 잘라냅니다. 위 내용물이 절단 위치와 십이지장 유두 사이의 유문 영역에 있는지 확인하십시오.
      알림: 이것은 나중에 구강 및 천하 십이지장 부분의 올바른 위치에 대한 방향을 확보하기 위한 중요한 단계입니다.
  2. 상위 블록 동원을 수행하십시오.
    1. 부드럽게 xiphoid 과정을 당기고 falciform 인대에 접근하십시오.
    2. 담낭과 검상돌기 사이에 가능한 한 검상돌기에 가까운 열판 인대를 통해 1cm 길이의 절단을 수행하십시오. 담즙 방광을 손상시키지 않도록하십시오.
    3. 간과 흉부 사이의 다음 연결 구조를 잘라냅니다 : 식도, 하대 정맥, 흉부 대동맥, 간장의 맨 부분을 둘러싸고있는 모든 인대 및 등쪽으로 남아있는 모든 조직 연결.
      참고: en-bloc 샘플은 완전히 해부됩니다. 그것은 간, 담관 시스템 및 위의 유문 영역과 연결된 십이지장 코퍼스를 포함합니다.

5. 최종 담낭 및 담관 박리

  1. 아래 단계에 따라 전체 준비를 수행하십시오.
    1. en-bloc 샘플을 일반적으로 탈수에 사용되는 폼 패드에 놓습니다. 이 단계와 다음 단계를 위해 최대 팁 크기가 6mm 인 20x 현미경 배율과 두 개의 미세 수술 무 외상성 겸자를 사용하십시오.
    2. 폼 패드에 샘플을 조립하십시오. 올바른 해부학 적 위치에서 샘플을 재구성하십시오. 십이지장의 구강 및 구강 부분을 평평하게하여 부드러운 움직임을 수행하십시오.
    3. 십이지장 유두에서 움직임을 시작하고 외상성 집게를 사용하여 절삭 날로 계속하십시오. 십이지장의 구강 부분에서만 발생하는 위장의 흰색 펄프 내용물을 부드럽게하십시오. 가능한 담관 회전을 배제하기 위해 십이지장의 구강 및 구강 부분을 식별해야합니다.
    4. 담관의 해부를 시작하기 위해 간 조직의 큰 잔해를 잘라냅니다.
  2. 최종 격리를 수행합니다.
    1. 남은 간 조직을 거품 매트의 모공에 부드럽게 누릅니다. 긁는 움직임이 담관 시스템에서 시작하여 간 경계로 이어지는지 확인하십시오.
    2. 다양한 방향으로 몇 번 긁은 후 샘플을 폼 매트의 더 깨끗한 위치로 옮깁니다. 백그라운드에서 덜 압착된 간 조직의 이점을 활용하여 EBDS와 원치 않는 세포 간의 최상의 분화를 위한 보기를 최적화합니다. 간 조직이 아무것도 또는 가능한 한 적게 남을 때까지 담관에서 간 조직을 긁어냅니다.
    3. 격리 된 EBDS가 남아있을 때까지 간십이지장 인대를 처리하십시오. 간동맥, 문맥 및 작은 잔해와 같은 인대 내 혈관을 제거합니다. 이 섬세한 필라멘트를 부드럽게 당기고 세심한주의를 기울여 왼쪽 측면으로 제거하십시오. 이 해부 단계는 간 조직을 이전에 제거하는 동안 의도하지 않게 또는 부분적으로 완료되어 결국 동일한 결과를 초래합니다.
      참고: 혈관은 십이지장 유두의 약 3-5mm 경구로 흰색의 매우 섬세한 필라멘트로 나오고 왼쪽 측면에서 간십이지장 인대에 합류하여 담관과 함께 글리소니아 트라이어드에 축적됩니다. 이 단계가 완료되면 최종 샘플이 완전히 분리됩니다. 기록이 필요한 경우 담관 구조를 해부학적 위치로 구성한 후 이미지를 캡처할 수 있습니다(그림 1). 폼 매트에서 마지막 준비 단계를 수행하는 것은 샘플이 작업 필드의 표면에 많이 달라붙지 않기 때문에 권장됩니다. 모공이 젖 으면 담관이 공중에 떠 있거나 떠 있습니다. 샘플을 이동할 때 작업 천에 준비할 때처럼 단단히 달라붙지 않아 샘플을 이동하는 동안 찢어지지 않습니다.

6. 조직 학적 분석을위한 준비

  1. 분리 된 샘플을 해부 후 가능한 한 빨리 완충 용액, 특수 배지 또는 포르말린 함유 정착액 ( 재료 표 참조)에 넣으십시오.
  2. 계획된 추가 처리 단계에 따라 적합한 스토리지 솔루션을 선택했습니다.
    주의 : 포르말린 함유 정착액은 급성 독성, 부식성 및 다양한 건강 위험 때문에 통풍구 아래에서만 사용하십시오.
    참고: 제시된 연구에서 EBDS 샘플은 파라포름알데히드에 삽입되고 탈수되고 파라핀에 매립되었습니다. 그들은 실온에서 보관되고 절단되기 전에 냉각되었습니다. 온난화 캐비닛에서, 2 μm 슬라이스를 밤새 보관하고, 통상적인 헤마톡실린 및 에오신4 를 사용하여 염색하였다( 재료 표 참조).

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결과

도 1A 는 뮤린 신생아의 EBDS를 보여주며, 이는 기술된 기술로 해부되었다. 현미경으로 볼 때 더 이상 간 조직이 보이지 않습니다. 간 조직은 프로토콜의 최종 분리 단계에서 제거되었으며 색상 및 일관성과 관련하여 담관 조직과 쉽게 구별 될 수 있습니다. 그림 1B 는 밀리미터 스케일과 비교하여 분리된 샘플을 보여줍니다. EBD의 길이(담낭에서 십이지장 유두까지 측정)는 10mm 미만입니다. 매우 섬세한 Ductus choledochus의 직경은 0.05-0.2 mm로 다양했습니다. 그림 2 는 열린 내강을 가진 EBDS의 세로 섹션의 헤 마톡실린-에오신 염색을 보여줍니다. 담관 세포는 내강을 단층으로 둘러싸고 더 어둡게 염색 될 수 있습니다. 현미경 검사는 20x 배율을 사용하여 수행하였다. 그림은 설명된 해부 프로토콜을 사용하면 작업자가 신생아 마우스에서도 덕트 가...

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토론

이 기사는 안락사된 신생아 마우스의 EBDS를 제거하기 위한 새로운 외과적 접근법의 생성 및 검증을 보고하고 논의했습니다. 현미경 및 조직학적 결과는 이 접근법이 EBD를 신속하게 감지하고 신생아 마우스에서도 덕트 가장자리 근처에서 해부한다는 것을 보여줍니다. 설명 된 프로토콜에는 수술 도구와 20 배 배율의 현미경 만 필요합니다. 또한 이 접근 방식을 통해 전체 EBDS를 격리할 수 있습니다. 이 기술은 매우 효율적이고 간단하며 복제가 간단합니다.

담도 폐쇄증, PSC 및 PBC와 같은 담관 질환의 연구를 위해 전체 담관 시스템의 기계적 추출이 자주 필요합니다. 크기가 작기 때문에, 특히 신생아의 경우 해부, 처리 및 분석이 어렵습니다. 생후 1일 된 신생아 마우스 EBD의 간외 유관 세포의 분리는 이미 확립되어 있지만, 이 방법은 어려운 것으로 설명되었습니다. 일반적으로이 절차를 처음 접하는 개인은 해부 기술과 작은 담관 5의 정화에 대한 기술적 문제로 인해 어려움을

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl 및 Magdalena Trochimiuk의 공헌을 인정합니다. Hans Christian Schmidt는 함부르크의 UKE에 있는 Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME 장학금(2021_EKPK.10)의 재정 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
탈수제로 사용되는2-프로판올CHEMSOLUTE11365000
30 G canulaB Braun/Sterican, Melsungen Germany4656300의 수화를 위한 캐뉼라
; 벨시스템 GmbH & Co. KG, Breidenbach, GermanyTec-Ononmic AZ 1200에어 벤트의 사용은 포르말린 함유 고정제의 흡입을 방지하는 데 도움이 됩니다
Aqua ad injectabilia BraunB Braun, Melsungen, Germany2351744식염수; 용기: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, 멸균
더 큰 미세 수술 겸자DIADUST von Aesculap, Trossingen DeutschlandFD253R스트레이트, 180 mm (7"), 플랫폼 팁, 원형 핸들, 너비: 0,800 mm, 다이아몬드 분진 코팅, 비멸균, 관찰을 위한 재사용 가능한 옵션 도구 및 최종 준비를 제외한 모든 준비 단계; 복막의 피부를 나누는
카메라 " 스마트캠 5"  Basler and Vision Engineering, Send, 영국EVC131A옵션 Lynx Exo 카메라 모듈: 센서 유형: CMOS, 해상도 2560 x 1920 픽셀, 센서 크기: 1/2"; 비디오 제작 및 기술 평가에 사용됩니다
수 기계/Citadel 2000 조직 처리기Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany12612613자동 탈수, 짧은 프로그램 (약 4.8시간)에 사용됩니다
수 스폰지 Carl Roth, Karlsruhe, GermanyTT56.1스폰지는 최종 해부 단계를 위한 것이며, 인치당 최소 기공 크기가 60 기공인 다른 스폰지/폼 패드도 적합합니다.   임베딩 카세트 당 두 개의 폼 패드를 사용하여 샘플을 아래와 위에서 커버하여 임베딩 카세트
Dulbecco´의 천공을 통해 미끄러지는 것을 방지하는 것이 권장됩니다. s 포스팟 완충 식염수(PBS)Gibco14190-144급성&급성; t 함유 칼듐 또는 마그네슘, 500 mL
임베딩 카세트Engelbrecht GmbH, Edermü nde, Germany17990
EosinMEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany41-6660-00염색 용액, 바로 사용 가능한
Fine Scissors CeramaCutFST, 하이델베르크 독일14959-09팁: Sharp-Sharp, 합금 / 재질: 세라믹 코팅 스테인리스강, 톱니 모양:, 예; 특징 : CeramaCut, 팁 모양 : 스트레이트, 절삭 날 : 22mm, 길이 : 9cm; 피부 절개, 복막 창 절개
Graefe ForcepsFST, 하이델베르크 독일11051-10길이 : 10cm, 팁 모양 : 곡선, 톱니 모양, 팁 너비 : 0.8mm, 팁 크기 : 0.8 x 0.7 mm, 합금 / 재질 : 스테인레스 스틸
HematoxylinMEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany41-5130-00염색 용액, 사용 준비 완료
Highresolotion microscopeVision Engineering, 영국 보내기에보503 최대 60배 확대 가능, 6배에서 20배 확대만 사용되었습니다 
현미경Olympus Optical CO, Ltd., 함부르크, 독일BX60F5
현미경 커버 유리Marienfeld, Lauda-Kö nigshofen, 독일101244폭 60mm, SCHOTT D 263 유리
현미경 슬라이드R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany03-0060
MicrotomeLeica, Nuß loch, 독일SM2010R절편용 도구(2 &마이크로; m-슬라이스) 
Omnifix-F 1 mL 주사기B Braun, Melsungen, Germany9161406V주사기(캐뉼라
SakuraFinetec, Torrance, USA4511Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, DMSO
파라핀 제외 임베딩 머신MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, GermanyTES 99이 연구에 사용된 임베딩 기계에는 TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600의 세 가지 개별 모듈이 포함되어 있습니다. 검체는 탈수 직후 파라핀에 삽입해야 하며, 냉장고의 수축 및 습기 가능성으로 인해 냉장고에 중간 보관해서는 안 됩니다.
파라포름알데히드(PFA)Morphisto1176201000검체의 경우 2 mL Eppendorf conical tube에 1 mL 부분 표본을 준비하고, 간외 담관 검체의 경우 1 mL Eppendorf conical Tube에 0.5 mL 부분 표본을 준비합니다. PBS ph 7.4 에서 4%;
작은 미세수술용 집게 EPM(Erich Pfitzer Medizintechnik), Bü tthard, 바이에른, 독일(00)165라운드 핸들, 스트레이트, 0.3mm 팁, 관찰 및 준비의 모든 단계용 도구, 최종 준비에 특히 유용
스테인레스 스틸 통치자Agntho의 AB, Lidingö, 스웨덴30085-15150mm 미터법 및 인치 졸업식
수술용 가위 – 참수를 위한 날카롭고 뭉툭FST, 하이델베르크 독일14001-14참수 장치
난화 캐비닛Haraeus, Hanau, GermanyT 6060얇게 썬 샘플은 현미경 슬라이드에 샘플의 부착을 보장하기 위해 보온 캐비닛에 보관해야 합니다
샘플 에어 벤트 C + P Mö. 탈. 탈로 제작 제외) 간 한 온.

참고문헌

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