벌크 및 단일 오가노이드 분석을 위한 광시야 라이브 셀 이미징을 사용한 다중 파라미터 종양 오가노이드 약물 스크리닝

최근 몇 년 동안 체외 암 약물 발견, 약물 스크리닝 및 기초 연구는 불멸화 된 세포주가있는 전통적인 2 차원 (2D) 암 모델의 사용에서보다 생리 학적으로 관련성이 높은 3 차원 (3D) 암 모델로 전환되고 있습니다. 이것은 고형 종양에 존재하는 더 복잡한 세포 간 상호 작용 및 구조를 재현하는 확립된 암 세포주를 가진 종양 스페로이드의 채택에 박차를 가했습니다. 현재 환자 유래 종양 오가노이드(PDTO)는 종양 스페로이드에 비해 추가적인 이점, 즉 암 환자¹에서 발견되는 이질성을 제공하기 때문에 시험관 내 암 연구에 사용할 수 있는 가장 진보되고 생리학적으로 관련된 3D 암 모델입니다. PDTO는 암 환자로부터 유래 한 종양 조직으로부터 확립되며, 따라서 종양 표현형과 유전자형을 모두 유지한다. 따라서 PDTO는 기초 및 중개 암 연구에 매우 중요해지고 있으며 정밀^종양학을 크게 개선할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다2.

유망한 잠재력에도 불구하고 이러한 정교한 3D 체외 암 모델은 고급 분석 방법이 부족하기 때문에 종종 활용도가 낮습니다. 가장 일반적으로 사용되는 분석은 세포내 ATP³의 정량화를 통해 PDTO에서 생존 가능한 세포의 수를 결정합니다. 이러한 분석은 일반적으로 단일 시점, 대량 분석이므로 중요한 시간 종속 반응을 간과하고 클론 반응을 무시합니다. 특히, PDTO의 성장 (성장률)과 특정 치료법에 대한 반응을 모니터링하는 능력은 높은 관심의 대상입니다 ^4,5. 양성(ctrl+) 및 음성 대조군(ctrl-) 상태로 정규화된 성장률을 기반으로 약물 반응에 점수를 매기는 정규화된 약물 반응(NDR)도 최근 세포 기반 스크리닝으로 항암제 민감도를 평가하는 중요한 지표로 보고되었지만 주로 2D 세포주⁶에 대해 수행되었습니다. 따라서 이러한 임상적으로 대표적이고 복잡한 3D 암 모델을 최대한 활용하기 위해서는 보다 정교한 분석 방법이 필요합니다. 현미경은 이러한 유기체 모델의 복잡성을 연구하는 강력한 접근 방식으로 간주됩니다⁷.

이 백서는 기존의 광시야 현미경 및 생세포 이미징 시스템을 사용하여 3D 암 모델에서 운동 약물 반응을 모니터링하는 방법을 설명합니다. Driehuis et ^al.4 에서 설명한 프로토콜은 피펫팅 로봇, 디지털 약물 디스펜서 및 생세포 이미징 시스템을 사용하는 자동화와 호환되도록 조정되어 재현성을 높이고 '실습' 노동 시간을 줄였습니다. 이 방법을 사용하면 384웰 마이크로플레이트 및 다중 오가노이드 형식으로 확립된 암 세포주(테스트된 세포주는 보충 표 S1 참조)와 PDTO가 있는 종양 스페로이드를 모두 중간에서 고처리량으로 약물 스크리닝할 수 있습니다. 컨볼루션 네트워크 머신 러닝 프로세스를 사용하면 형광 생세포 라벨링 염료를 사용하지 않고 명시야 이미징에서만 개별 종양 스페로이드 또는 PDTO의 자동 식별 및 추적을 수행할^{수 있습니다8}. 명시야 이미징을 사용한 대부분의 식별에는 수동 주석(힘들고 시간이 많이 소요됨)이 필요하거나 형광 염료를 추가해야 하므로 광독성 유도 산화 스트레스와 관련된 약물 반응을 혼동할 수 있기 때문에^이는 매우 유리합니다9.

그 결과 자체 개발한 이미지 분석 소프트웨어는 3D 이미지 분석 모듈을 사용할 수 없거나, 플랫폼이 제한되거나, 384웰 마이크로플레이트 및 홀웰 이미징과 호환되지 않기 때문에 기존 라이브 셀 이미징 시스템의 기능을 확장합니다. 또한 이러한 모듈은 종종 가격이 비싸고 제한된 벌크 오가노이드 판독값을 제공합니다. 따라서 이 방법은 널리 사용 가능한 생세포 이미징 시스템에 액세스할 수 있고 황금 표준이지만 기초적인 ATP 기반 분석에 비해 약물 반응에 대한 더 많은 정보를 추출하는 것을 목표로 하는 과학자에게 매우 적합합니다. 특정 세포 사멸 지표를 추가하면 세포 증식 억제 약물 반응을 세포 독성 반응과 구별 할 수 있으므로 현재 단일 시점 분석에서 달성 할 수없는 기계 론적 약물 작용에 대한 추가 통찰력을 제공합니다. 마지막으로, 라이브 셀 이미징을 통해 개별 오가노이드 추적을 통해 단일 오가노이드 약물 반응 메트릭을 획득하여 반응 이질성을 캡처하고 잠재적인 내성 서브클론을 식별할 수 있습니다.

이 방법 및 관련 이미지 분석 소프트웨어의 목표는 오가노이드 약물 스크리닝에서 저비용 자동화를 구현하여 사용자 개입을 제한하고 취급, 이미지 분석 및 데이터 분석의 변동성을 줄이는 것입니다. 연구원이 이 소프트웨어를 사용할 수 있도록 현미경 및 플랫폼에 구애받지 않으며 클라우드 기반 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다. 따라서 기존의 생세포 이미징 시스템을 지원함으로써 3D 배양 응용 분야 및 분석을 위한 기능을 개선하는 것도 목표로 합니다.

인간 췌장 관 선암 (PDAC) 환자 유래 오가노이드를 사용하였다. 조직 절제 단편은 앤트워프 대학 병원에서 치료 수술을받는 환자로부터 얻었습니다. 모든 환자로부터 서면 사전 동의를 얻었으며 연구는 UZA 윤리위원회의 승인을 받았습니다(참조 14/47/480). 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약, 장비 및 소프트웨어와 관련된 세부 정보는 재료 표에 나와 있습니다. 워크플로의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 예제 데이터는 프로토콜을 재현하기 위해 보충 자료에 제공됩니다.

1. 0일차: 생후 2일 또는 3일령 오가노이드의 제조

1. 마이크로플레이트를 37°C에서 밤새 예열하고 4°C에서 세포외 매트릭스(ECM)를 해동합니다.
2. 전체 PDAC 오가노이드 배양 배지 준비: 0.5nM WNT 대리모-Fc-융합 단백질, 4% Noggin-Fc 융합 단백질 조절 배지, 4% Rpso3-Fc 융합 단백질 조절 배지, 1x B27, 1mM N-아세틸 시스테인(NAC), 5mM 니코틴아미드, 500nM A83-01, 100ng/mL FGF10 및 10nM 가스트린으로 ADF+++(고급 DMEM/F12, 1% 글루타민 보충제, 1% HEPES 및 1% 페니실린/스트렙토마이신)를 보충합니다.
3. 선택 방법에 따라 PDTO를 설정합니다.
   참고 : 자세한 프로토콜은 Driehuis et al.에 의해 제공되며, ECM 돔⁴에서 PDTO를 설정, 배양 및 통과시키는 종래의 방법을 설명합니다.
4. ECM 돔에서 유기체를 효소적으로 해리합니다.
   1. 배지를 흡인하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 1x 세척합니다. 해리 효소(예: 6웰 마이크로플레이트에 2mL)를 추가하고 1mL 피펫으로 10배 위아래로 피펫하여 오가노이드와 ECM 돔을 기계적으로 해리합니다.
   2. 37°C에서 10분 동안 배양하고, 위아래로 피펫팅하고, 오가노이드가 단세포로 해리되는지 확인한다. 필요한 경우 이 단계를 반복합니다.
   3. 15mL 튜브에 세포 현탁액을 수집하고 ADF+++를 10mL의 부피에 추가하고 실온에서 450× g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 파스퇴르 피펫과 흡입 펌프로 상청액을 흡입합니다.
   4. 펠릿의 크기에 따라 100-200 μL의 전체 배지에 펠릿을 재현탁하고 선택한 방법을 사용하여 세포 수를 계산합니다. 예: 세포 현탁액 10μL + 트리판 블루 10μL를 혼합하고 자동 세포 카운터로 계수합니다.
5. ECM 돔에 단일 셀을 플레이트합니다.
   1. 세포 현탁액을 희석하고 표 1에 따라 2/3 ECM을 첨가한다. 예열된 6웰 플레이트에서 웰당 최대 10개의 20μL 액적을 피펫팅합니다. 플레이트를 뒤집고 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.
   2. 10 μM Y-27632가 보충 된 전체 배지로 오버레이하고 인큐베이터에서 2-3 일 동안 배양합니다.
      참고: 각각 75,000개의 세포를 포함하는 10개의 돔은 일반적으로 가장자리의 웰을 제외하고 200개의 오가노이드/웰 농도로 384웰 마이크로플레이트 1개를 채우기에 충분합니다.

2. 2-3일: 2일 또는 3일령 오가노이드 수확 및 파종

1. ECM 돔에서 손상되지 않은 유기체를 수집하십시오.
   참고: 오가노이드는 플라스틱 표면(예: 튜브, 피펫 팁)에 달라붙는 경향이 있습니다. 이를 방지하기 위해 플라스틱 제품은 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA) / PBS 용액으로 미리 헹굴 수 있습니다.
   1. 배지를 흡인하고 PBS로 1x 세척합니다. ECM 돔 수에 따라 6웰 플레이트에 1-2mL의 냉(4°C) 오가노이드 수확 용액을 추가하고 진탕 플랫폼의 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.
   2. 1mL 피펫으로 위아래로 피펫하여 ECM 돔을 해리하고 얼음 위에서 10분 더 배양한 다음 ECM이 해리되었는지 현미경으로 육안으로 확인합니다.
   3. 선택 사항: 보다 균일한 크기 분포가 선호되는 경우 원심분리 전에 70μm 세포 스트레이너를 통해 현탁액을 여과합니다.
   4. 0.1% BSA/PBS로 사전 코팅된 15mL 튜브에 오가노이드를 수집하고 최대 10mL까지 ADF+++를 추가하고 4°C에서 200× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 펠릿의 크기에 따라 최대 1,000μL의 전체 PDAC 오가노이드 배지에 펠릿을 재현탁하여 >6,000 오가노이드/mL의 농도를 얻습니다.
   5. 선택한 계수 방법, 바람직하게는 이미지 기반 방법을 사용하여 오가노이드를 계수하십시오.
2. 유기체를 시드하십시오.
   참고: 이 프로토콜에 사용되는 두 가지 유형의 384웰 마이크로플레이트에 대한 최소 부피/웰에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
   1. ECM의 응고를 방지하기 위해 사용하기 전에 모든 플라스틱 제품을 -20 ° C 또는 얼음에서 최소 20 분 동안 사전 냉각하십시오.
   2. 전체 배지를 사용하여 1mL의 오가노이드 원액(단계 2.1.6)에서 파종 용액을 준비하여 웰을 채우는 데 사용되는 최소 부피인 50μL의 웰당 ~200개의 오가노이드를 시드합니다. 보충 파일 1 을 사용하여 오가노이드 파종 용액의 양을 계산합니다. 25mL 저장소와 멀티채널 피펫 또는 피펫팅 로봇을 사용할 경우 1,500μL의 잔류 부피를 추가하십시오.
   3. 피펫팅 로봇을 사용하여 오가노이드를 시드합니다.
      참고: ECM의 응고를 방지하기 위해 피펫팅 중에 파종 용액과 마이크로플레이트 모두 4°C에서 냉각해야 합니다. 따라서 25mL 저장소와 마이크로플레이트 홀더를 3D 프린팅하여 재료 표에 나열된 냉각 요소를 담을 수 있는 피펫팅 로봇과 함께 사용했습니다. 맞춤형 실험기구(보충 파일 2 및 보충 파일 3)를 3D 프린팅하기 위한 STL 파일과 피펫팅 로봇을 위한 맞춤형 실험기구 JSON 파일(보충 파일 4 및 보충 파일 5)이 제공됩니다.
      1. 온라인 프로토콜 디자이너 도구를 사용하여 분배 프로토콜을 설계합니다. 예제 JSON 파일(보충 파일 6)이 제공되며, 여기에는 맞춤형 실험기구가 이미 로드되어 있고 해당 파이펫 팁이 있는 8채널 p300(Gen2) 피펫이 사용됩니다.
      2. 피펫팅 로봇 제어 앱을 열고 프로토콜을 선택한 다음 가져오기를 클릭하고 보조 파일 6 을 지정된 필드로 끌어다 놓습니다.
      3. 가져온 프로토콜을 선택하고 냉각 요소와 플라스틱 제품을 포함한 모든 실험기구를 데크 설정 필드에 표시된 레이아웃에 따라 데크 에 배치합니다. 보충 파일 7에 표시된 대로 25mL 저장소 및 냉각 요소에 왼쪽 슬롯을 사용합니다.
      4. 프로토콜 실행을 클릭하고 설정을 진행합니다. 실험기구 설정 탭을 열고 실험기구 위치 확인 실행을 클릭한 다음 지침에 따라 피펫팅 로봇을 새 하드웨어에 맞게 교정합니다.
         참고: 실험기구 오프셋 데이터는 나중을 위해 저장할 수 있지만 각 실행 전에 실험기구 위치 검사를 실행하는 것이 좋습니다.
      5. 25mL 저장소(냉각 요소 상단에 위치)를 냉각된 오가노이드 파종 용액으로 채우고 실행 시작을 클릭합니다.
         참고: 상단 및 하단 웰도 8채널 피펫의 사용으로 인해 오가노이드 현탁액으로 채워집니다.
      6. 마이크로플레이트를 4°C에서 100 × g에서 1 분 동안 원심분리한다.
      7. 37°C에서 최소 30분 동안 배양합니다.
      8. 증발을 피하기 위해 외부 블랭크 웰을 최소 50μL의_H2O로 채웁니다.
      9. 37°C에서 밤새 배양하여 이미지 분석을 방해할 수 있는 웰 내의 모든 기포를 제거한다.

3. 4일차: 디지털 약물 디스펜서를 사용한 약물 치료 및 시약 분주

1. 디지털 약물 디스펜서 제어 소프트웨어를 사용하여 약물 디스펜싱 프로토콜을 생성합니다.
   1. 플레이트 레이아웃 위의 플레이트 1 위에 마우스를 놓고 플레이트 속성 편집을 선택하고 플레이트 유형: 384웰, 추가 볼륨(μL): 50 및 DMSO 제한(%): 1을 채웁니다.
   2. 유체 옆에 있는 + 버튼을 클릭하여 유체 를 추가합니다. 새로 생성 된 유체를 두 번 클릭하고 이름을 지정하십시오. 클래스 (DMSO 기반 또는 수성 + 트윈 20) 및 농도를 선택하십시오.
      알림: 모든 약물과 시약은 100% DMSO 또는 0.3% 트윈-20에 용해되어야 합니다. 최대 DMSO 농도 <1 %를 고려하여 1-10mM 스톡 용액을 사용할 수 있습니다. 표 2 는 일반적인 형광 시약 및 치료법에 필요한 희석액의 예를 제공합니다.
   3. 플레이트 레이아웃
      1. 약물 적정의 경우, 웰을 선택하고 적정을 클릭하십시오. 유체의 경우, 관심 약물을 선택하고, 최고 농도 (예를 들어, 2,000 nM) 및 최저 농도 (예를 들어, 10 nM)를 선택하고; 반복실험의 경우 최소 2개를 선택하고 원하는 적정 패턴을 선택합니다.
         참고: 적정 패턴은 단일 플레이트에 얼마나 많은 화합물을 맞출 것인지, 웰을 무작위화할지 여부, 반복실험 및 대조군의 수를 포함한 많은 요인에 따라 달라집니다.
      2. 양성 대조군의 경우 3개의 웰을 선택하고 Set Value를 클릭한 다음 DMSO의 10mM 스톡에서 2μM 스타우로스포린을 채우면 최대 세포 사멸을 유도합니다.
      3. 사이토톡스 그린의 경우 사용된 모든 웰을 선택하고 설정 값을 클릭한 다음 60nM/웰을 입력합니다.
         참고: Cytotox Green 형광 염색은 죽은 세포를 나타내므로 약물 반응 모니터링을 방해하지 않습니다. 여기에서는 살아있는 세포에 대한 형광 마커가 필요하지 않습니다.
      4. 음성 대조군 및 DMSO 정규화의 경우, 비히클 제어를 위해 추가로 4개의 웰이 있는 모든 웰을 선택하고, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고, 정규화를 선택하고, 유체 클래스 정규화: DMSO 기반을 선택하고, 최고 클래스 부피로 정규화하여 각 웰에서 동일한 DMSO 농도를 얻습니다.
         알림: DMSO 농도는 <1%여야 합니다. 예시적인 TDD 약물 적정 파일(보충 파일 8)이 제공된다.
      5. 왼쪽 상단 모서리에 있는 실행 아래의 화살표를 클릭하고 항상 시뮬레이션을 선택한 다음 시뮬레이션을 클릭하여 오류를 식별하고 준비할 각 약물의 양을 얻습니다.
         알림: 초기 분주 용량이 너무 낮을 때 경고를 극복하려면 "각 플레이트의 각 유체에 대해 30nL 이상의 분주 경고 웰 권장", 가장자리에서 물이 채워진 두 개의 웰을 선택하고 값 설정을 선택한 다음 경고가 발생하는 약물의 10μM 을 입력합니다. 이것은 약물 카트리지를 30nL보다 높은 부피로 프라이밍합니다. 이러한 동일한 웰을 사용하여 정규화를 총 부피 값의 %( 예: 0.5%)로 설정하여 DMSO 카트리지를 프라이밍할 수 있습니다.
2. 선택 취소 항상 시뮬레이션 아래의 실행 단추; 실행을 클릭하여 약물 분배 프로토콜을 시작하고 지침을 따릅니다.
3. 증발을 방지하기 위해 밀봉 멤브레인을 마이크로 플레이트에 적용하십시오.
4. Cytotox Green 염료를 인큐베이터에서 37°C에서 1-2시간 동안 배양하고 4단계로 진행합니다.

4. 라이브 셀 이미저로 이미지 수집

알림: 성장률 및 NDR의 경우 Cytotox Green을 추가한 후 1-2시간 후에 시점 0(T0 = 치료 시작)에서 스캔을 받아야 합니다.

1. 라이브 셀 이미저 제어 소프트웨어를 열고 메서드 편집기 새로 만들기를 선택한 다음 가져올 파일로 이동하여 예제 메서드 XML 파일(보조 파일 9)> 선택합니다. 또는 새 파일을 만들고 플레이트: (CORE384fb_OpticalImaging) - Corning 384 플랫 블랙(Corning #4588), 뚜껑 없음 및 습도 카세트 없음; 응용 프로그램: 이미지 전용; 목표: 4x; 패턴 : 중앙; 채널 확인 명시야 및 녹색(LED 강도(%) = 40; 노출 시간 (ms) = 200).
   알림: 녹색 채널 설정은 60nM 사이토톡스 그린 농도에서 잘 작동합니다. 라이브 뷰어 옵션을 사용하여 초점 오프셋 및/또는 LED 설정을 실시간으로 조정할 수 있습니다.
2. 시작을 클릭하여 T0에서 스캔을 시작합니다.
3. 동일한 방법을 사용하여 최대 5일 동안 24시간마다 스캔을 반복합니다. 또는 타임랩스 측정을 자동으로 실행하려면 라이브 셀 이미저 제어 소프트웨어에서 키네틱 루프 탭을 클릭하고 메서드 필드로 드래그하여 키네틱 실험으로 방법을 조정합니다. 마찬가지로, 온도 및 가스 탭을 방법 필드로 드래그하여 시스템을 37 ° C 및 5 % CO₂로 설정하여 실험 중에 라이브 셀 이미 저 내에서 올바른 조건을 보장해야합니다.

5. 이미지 및 데이터 분석

1. 데이터 병합 및 압축
   1. 라이브 셀 이미저 제어 소프트웨어는 각 시점에서 각 스캔에 대한 폴더를 생성합니다. 새 폴더를 만들고 개별 실험 폴더를 이 새 상위 폴더에 복사한 다음 _0h, _24h, _48h, _72h, _96h 및 _120h 해당 실험 폴더 이름에 추가합니다.
   2. 디지털 약물 디스펜서 제어 소프트웨어에서 XLSX 플레이트 맵을 준비하고 약물 디스펜싱 프로토콜에서 플레이트 맵 레이아웃을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 모든 웰을 복사합니다. XLSX 파일에 데이터를 붙여넣습니다. Cytotox Green 및 스타우로스포린 데이터를 제거하고 세포주 및 복제를 위한 매트릭스를 추가합니다. Ctrl- 및 Ctrl+를 입력합니다. 예제 플레이트 맵에 대해서는 보충 파일 10 을 참조하십시오.
   3. 데이터 압축 도구를 열고 찾아보기를 클릭하고 상위 폴더를 선택한 다음 실행을 클릭하여 이미지 데이터 압축을 시작합니다. 서로 다른 타임 포인트에 대한 모든 TIFF 이미지 파일은 상위 폴더 내의 새 데이터 세트 폴더에있는 각 웰에 대해 단일 HDF5로 압축됩니다.
2. 이미지 분석
   1. 이미지 분석 웹앱 플랫폼으로 이동하여 로그인하고 홈 탭에서 새 프로젝트 추가를 클릭합니다. 프로젝트 이름을 입력하고, 계속하고, 새 실험 추가를 선택하고, HDF5 파일이 포함된 데이터 세트 폴더를 업로드합니다.
   2. 업로드 후 프로젝트 및 실험 폴더로 이동하여 플레이트맵 업로드 를 클릭하여 추가 기능을 확인합니다. 분석 실행을 클릭하고 다중 오가노이드 분석, 기본 파라미터를 선택한 다음 분석을 클릭하여 이미지 분석을 시작합니다.
   3. Download Results(결과 다운로드)를 클릭하여 각 웰에 대한 측정값(예: 총 명시야 영역, 총 형광 녹색 영역 등)이 포함된 원시 데이터 테이블과 분할된 이미지/비디오를 다운로드하여 분석 및 추가 데이터 처리의 정확성을 확인합니다.
3. 성장률 기반 약물 반응 지표 및 정상화된 약물 반응
   1. 결과 폴더(플레이트 맵 필요)(보조 파일 11)에서 Raw_NDR.xlsx 파일을 선택하고 Official_NDR_7point R-스크립트(보조 파일 12)에 로드하여 GR(ctrl-로 정규화됨) 및 NDR(ctrl- 및 ctrl+로 정규화됨) 값 테이블(보조 파일 13, 보조 파일 14, 보조 파일 15 및 보조 파일 16)을 자동으로 생성합니다. ). GR 및 NDR 값은 R-스크립트(보충 파일 12)를 사용하여 방정식 (1)과 같이 매개 변수에서 계산됩니다.
      총 생존 면적 = 총 명시야 면적 - 총 녹지 면적 (1)
      여기서 0은 NDR <1 = 세포 증식 억제 효과 (성장 정지), 및 NDR < 0 = 세포 독성 반응 (세포 사멸)을 <.
      참고 : R- 스크립트는 Gupta et ^al.6에서 채택되었습니다.
   2. clonal_data.xlsx 표에서 단일 오가노이드 반응 데이터를 가져와 버블 플롯으로 플로팅합니다.
   3. Z-인자¹⁰ 을 사용하여 실행의 약물 스크리닝 품질을 평가합니다(방정식 (2) 참조). Z 계수가 0.5< 실험은 폐기합니다.
      (2)

자동 피펫팅 프로토콜은 384웰 마이크로플레이트의 모든 컬럼에서 PDAC_060 PDTO의 균일한 분포를 보장합니다(그림 2A). 예상대로 우물 사이에서 PDTO의 수와 평균 면적의 변화가 관찰되었습니다(그림 2A,B). 총 생존 면적(총 명시야 면적 - 총 녹색 영역)은 무표지 오가노이드 분할과 형광 기반 세포 사멸 신호를 결합하며, 경험상 시간 경과에 따른 약물 반응을 연구하는 데 가장 강력한 매개변수입니다(그림 2C)8. 세포 파종 및 오가노이드 크기의 변동을 설명하려면 성장률 기반 메트릭을 사용하여 그림 2D와 그림 2C의 오차 막대 감소와 약물 스크리닝 품질이 크게 향상되었음을 나타내는 더 높은 Z 인자에서 볼 수 있듯이 반복실험 간의 변동을 줄여야 합니다(그림 2E).

ctrl- 및 ctrl+로 정규화된 NDR 용량-반응 곡선(그림 2G)은 약물 반응 곡선의 분리를 증가시키고 세포독성 약물 반응을 보다 정확하게 나타내기 때문에 ctrl-로 정규화된 GR 용량-반응 곡선(그림 2F)보다 분명히 우수합니다. ctrl-, ctrl+ 및 400nM 젬시타빈/80nM 파클리탁셀 처리된 PDTO에 대한 관련 이미지의 예가 그림 3에 나와 있습니다. 흥미로운 관찰은 파클리탁셀의 부가가치가 관찰되지 않았기 때문에 젬시 타빈의 세포 독성 효과가 병용 요법에서 지배적이라는 것입니다.

다음으로 두 개의 추가 PDTO 라인 인 PDAC_052과 PDAC_087이 사용되었습니다. 이러한 라인 간의 성장률의 명확한 차이가 관찰되었으며(그림 4A), 이는 GR 메트릭의 사용을 뒷받침합니다. 다시, NDR 용량-반응 곡선(도 4C)은 GR 곡선(도 4B)에 비해 3명의 상이한 환자 사이의 증가된 동적 범위 및 분리를 초래하였다. 또한, 이 프로토콜은 시간 경과에 따른 NDR의 결정을 허용하고 PDAC_052 및 PDAC_060이 저용량의 gem-pac(그림 4D)에 대해 매우 유사한 세포증식 억제 약물 반응을 갖는 반면, gem-pac의 중간(그림 4E) 및 고용량(그림 4F)에 대해 명확한 차등 세포증식 억제 대 세포독성 반응이 관찰될 수 있음을 보여줍니다. 이러한 약물 반응은 환자에서 관찰된 임상 반응과 일치하였다(도 4G).

마지막으로, 접근 방식과 소프트웨어의 주요 이점은 단일 오가노이드 약물 반응을 정량화하여 반응 이질성을 연구하고 잠재적으로 내성이 있는 서브클론을 식별할 수 있다는 것입니다. 도 5 는 상이한 환자들의 클론 역학에 대한 명확한 개요를 제공하고, PDAC-087이 치료 후 가장 내성이 강한 서브클론을 가졌음을 보여주며, 이는 환자에서 관찰된 공격적이고 내성이 높은 질환과 일치한다. 흥미롭게도 이 환자는 ctrl+ 스타우로스포린에 가장 덜 민감했습니다.

그림 1: 워크플로 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 파종 정확도 및 약물 반응 지표 . (A) 피펫팅 로봇을 사용하여 384웰 마이크로플레이트에 시딩된 PDAC_060 PDTO의 오가노이드 수/웰. 각 점은 단일 웰의 카운트를 나타내며 플롯은 384웰 마이크로플레이트 컬럼으로 구분됩니다. (B) 평균 PDTO 영역 / 우물. (C) 젬시타빈/파클리탁셀의 5:1 비율로 처리된 PDAC_060 PDTO의 총 생존 면적(총 명시야 면적 - 총 녹색 면적) 및 (D) 성장률(T0 = 1로 정규화된 총 생존 면적). (E) 분석 품질에 대한 메트릭으로서의 Z 인자. (F) ctrl-로 정규화된 성장률-용량 반응 곡선 및 (G) ctrl- 및 ctrl+로 정규화된 정규화된 약물 반응 곡선. 오차 막대는 두 웰의 평균 ± SD를 나타냅니다. 약어 : PDAC = 췌장 관 선암; PDTO = 환자-유래 종양 오가노이드; GR = 성장률; NDR = 정상화 약물 반응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 예제 이미지. 비히클(ctrl-), 400nM 젬시타빈/80nM 파클리탁셀, 및 2μM 스타우로스포린(ctrl+)으로 처리된 PDAC_060 PDTO의 대표 이미지. 왼쪽 열은 명시야 이미지를, 가운데 열은 Cytotox Green 형광 신호를, 오른쪽 열은 오가노이드 분석 모듈을 사용하여 주석이 없는 비표지 명시야 이미지를 보여줍니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어 : PDAC = 췌장 관 선암; PDTO = 환자-유래 종양 오가노이드; GemPac = 젬시 타빈 / 파클리탁셀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4 : 환자 간 약물 반응 비교. (A) PDAC_052, PDAC_060 및 PDAC_087 PDTO 라인의 성장률 (총 생존 면적 기준) 비교. (B) ctrl-로 정규화된 성장률-용량 반응 곡선 및 (C) ctrl- 및 ctrl+로 정규화된 정규화된 약물 반응 곡선. (D) 저용량, (E) 중간 및 (F) 고용량의 젬시타빈/파클리탁셀(5:1 비율)의 키네틱 NDR. (g) PDAC 환자의 임상적 특성. 오차 막대는 두 웰의 평균 ± SD를 나타냅니다. 약어 : PDAC = 췌장 관 선암; PDTO = 환자-유래 종양 오가노이드; GR = 성장률; NDR = 정규화 된 약물 반응; FFX = 폴 피리 녹스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 단일 오가노이드 메트릭. 비히클(ctrl-), 400nM 젬시타빈/80nM 파클리탁셀 및 2μM 스타우로스포린(ctrl+)으로 처리된 PDAC_052, PDAC_060 및 PDAC_087 PDTO의 세포 사멸(녹색 영역/명시야 영역) 및 면적(명시야)을 기반으로 한 단일 오가노이드 용량 반응. 녹색 영역은 실행 가능한 유기체를 나타냅니다. 파란색 영역은 GemPac 및 ctrl+ 플롯의 x-as 범위를 나타냅니다. 약어 : PDAC = 췌장 관 선암; PDTO = 환자-유래 종양 오가노이드; GemPac = 젬시 타빈 / 파클리탁셀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: ECM 돔의 도금을 위한 희석. 약어 : ECM = 세포 외 기질.

표 2: 자주 사용되는 약물 및 형광 시약의 희석 예. 각 화합물은 100 % DMSO 또는 0.3 % 트윈 / PBS에 용해되어야합니다.

보충 표 S1: 호환 가능한 암 세포주의 개요. 정적: 스페로이드는 철새가 아닙니다. 병합: 스페로이드는 서로를 향해 이동하고 함께 병합됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 오가노이드 파종 용액 계산 도구. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: 3D 프린팅 맞춤형 실험기구 '마이크로플레이트 홀더'를 위한 STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 3: 3D 프린팅 맞춤형 실험기구용 STL 파일 '2 x 25 mL 리저버 홀더'. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 4: 맞춤형 실험기구 피펫팅 로봇 '마이크로플레이트 홀더'용 JSON 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 5: 맞춤형 실험기구 피펫팅 로봇용 JSON 파일 '2 x 25 mL 리저버 Holder_WithCooler'. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 6: 피펫팅 로봇 프로토콜 'Plating_ PDO_384well_Cooled_Row2-23'을 위한 JSON 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 7: 파이펫팅 로봇 책상 설정 개요. (A) 냉각 요소 및 (B) 저장소 및 마이크로 플레이트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 8: 디지털 약물 디스펜서의 프로토콜에 대한 TDD 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 9: 명시야 및 형광 이미징을 위한 라이브 셀 이미저의 프로토콜을 위한 XML 파일입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 10: 플레이트 맵 예. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 11: NDR R 스크립트에 대한 예제 입력 파일입니다. 약어 : NDR = 표준화 된 약물 반응. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 12: 정규화된 약물 반응 NDR R 스크립트. 약어 : NDR = 표준화 된 약물 반응. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보조 파일 13: NDR R 스크립트 GR 값의 예제 출력 파일입니다. 약어 : GR = 성장률; NDR = 정상화 약물 반응. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 14: GR 값이 전치된 NDR R 스크립트의 예제 출력 파일입니다. 약어 : GR = 성장률; NDR = 정상화 약물 반응. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

S보충 파일 15: NDR R 스크립트 NDR 값의 예제 출력 파일입니다. 약어 : NDR = 표준화 된 약물 반응. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보조 파일 16: NDR 값이 전치된 NDR R 스크립트의 예제 출력 파일입니다. 약어 : NDR = 표준화 된 약물 반응. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.