이 프로토콜은 유전자 발현 및 조직학적 분석을 위한 마우스 자궁내막 상피 오가노이드를 확립하는 방법론을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
자궁 내막 조직은 자궁의 내강을 따라 늘어서 있으며 에스트로겐과 프로게스테론의 주기적 통제하에 있습니다. 그것은 내강 및 선 상피, 간질 구획, 혈관 네트워크 및 복잡한 면역 세포 집단으로 구성된 조직입니다. 마우스 모델은 자궁 내막을 연구하는 강력한 도구였으며 이식, 태반 및 암을 제어하는 중요한 메커니즘을 밝혀 냈습니다. 최근 3D 자궁내막 오가노이드 배양의 개발은 자궁내막 생물학의 기초가 되는 신호 전달 경로를 해부하는 최첨단 모델을 제시합니다. 유전자 조작 마우스 모델에서 자궁내막 오가노이드를 확립하고, 전사체를 분석하고, 단일 세포 분해능으로 형태를 시각화하는 것은 자궁내막 질환 연구에 중요한 도구입니다. 이 논문은 마우스에서 자궁 내막 상피의 3D 배양을 확립하는 방법을 설명하고 유전자 발현을 정량화하고 오가노이드의 조직학을 분석하는 기술을 설명합니다. 목표는 자궁내막 상피 오가노이드의 유전자 발현 및 형태학적 특성을 확립, 배양 및 연구하는 데 사용할 수 있는 리소스를 제공하는 것입니다.
서론
자궁강의 내부 안감 점막 조직인 자궁내막은 여성의 생식 건강에 중요한 역할을 하는 독특하고 매우 역동적인 조직입니다. 생식 수명 동안 자궁 내막은 난소 호르몬 인 에스트로겐과 프로게스테론의 공동 작용에 의해 조정 된 수백 번의 증식, 분화 및 분해주기를 겪을 가능성이 있습니다. 유전자 조작 마우스에 대한 연구는 호르몬에 대한 자궁 내막 반응과 배아 이식, 기질 세포 탈락 및 임신 조절을 뒷받침하는 기본적인 생물학적 메커니즘을 밝혀 냈습니다1. 그러나 시험관 내 연구는 전통적인 2D 세포 배양 2,3에서 형질전환되지 않은 일차 마우스 자궁내막 조직을 유지하는 데 어려움이 있기 때문에 제한적이었습니다. 최근 3D 장기 시스템 또는 오가노이드와 같은 자궁내막 조직 배양의 발전은 자궁내막 세포 재생 및 분화를 제어하는 생물학적 경로를 조사할 수 있는 새로운 기회를 제공합니다. 마우스 및 인간 자궁내막 오가노이드 시스템은 다양한 매트릭스4,5에 캡슐화된 순수한 자궁내막 상피로부터 개발되었으며, 인간 자궁내막은 스....
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프로토콜
마우스 취급 및 실험 연구는 Baylor College of Medicine의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에서 승인 한 프로토콜과 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 NIH 가이드에서 수립 한 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 효소 및 기계적 방법을 사용한 마우스에서 자궁 상피 분리
참고: 이 섹션에서는 겔 매트릭스 스캐폴드를 사용하여 마우스로부터 상피 자궁내막 오가노이드를 확립, 계대, 동결 및 해동하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 이전 연구에서는 발정기4상 동안 마우스에서 마우스 자궁내막 오가노이드의 최적 배양이 확립되는 것으로 확인되었으며, 이는 질 면봉(15)의 세포학적 검사에 의해 결정될 수 있습니다. 성체 암컷 WT 마우스 (6-8주령, 하이브리드 C57BL/6J 및 129S5/SvEvBrd)를 모든 실험에 사용하였다. 마우스는 이소플루란 진정 작용과 자궁 경부 관절 분리를 사용하여 IACUC 승인 지침에 따라 인도적으로 안락사되었습니다. 마우스가 안락사되면 다음 단계를 따라야합니다. 이 프로토콜에 사용되는 재료 및 솔루션과 관련된 자세한 내용은
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결과
마우스 자궁내막 오가노이드의 위상차 이미지
첨부된 프로토콜에 설명된 대로 WT 마우스 자궁내막 상피에서 오가노이드를 확립했습니다( 그림 1의 다이어그램 참조). 마우스 자궁 내막 상피의 효소 해리에 이어, 상피 시트를 자궁 기질 세포로부터 기계적으로 분리하고 콜라게나제로 더 해리시켜 단일 세포 현탁액을 생성시켰다. 올바르게 수행되면 이 상피 및 기질 세포 분리 방법은 반대 세포 유형의 10%-15% 이하의 오염을 가진 샘플을 생성해야 합니다( 그림 2의 면역형광 이미지 참조). 이어서, 상피 세포 펠렛을 겔 매트릭스에 재현탁시키고, 실온에서 겔화시키고, 조직 배양 플레이트 상의 25 μL 돔으로 플레이팅하였다. 겔 매트릭스 돔이 응고 된 후, 이들은 유기체 배지로 겹쳐서 성장시켰다. 우리는 일반적으로 자궁 내막 상피 세포가 그림 3과 같이 3-4
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토론
여기에서는 마우스 자궁내막에서 자궁내막 상피 오가노이드를 생성하는 방법과 다운스트림 분석에 일상적으로 사용되는 프로토콜에 대해 설명합니다. 자궁내막 오가노이드는 자궁내막증, 자궁내막암 및 착상 실패와 같은 자궁내막 관련 질병을 제어하는 메커니즘을 연구하는 강력한 도구입니다. 2017년에 발표된 획기적인 연구에서는 마우스와 인간 상피 4,5에서 자궁내막 오가노이드의 장기 및 재생 가능한 배양 조건을 보고했습니다. 오가노이드가 다른 시스템에서 생물학적 경로를 연구하기 위해 널리 사용되었지만, 시험관 내 자궁내막 조직의 연구는 배양물에서 형질전환되지 않은 1차 상피를 연구하기에 적합한 모델의 부재로 인해 제한되었습니다26. 인간 및 마우스 자궁내막에서 유래한 자궁내막 오가노이드는 장, 신장 및 폐와 같은 다른 장기 조직의 오가노이드를 배양하는 데 일반적으로 사용되는 조건을.......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
스테파니 팡가스 박사와 마틴 M. 마추크 박사(M.M.M.)에게 우리 원고를 비판적으로 읽고 편집해 주신 데 대해 감사드립니다. 연구는 유니스 케네디 슈라이버 국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소 보조금 R00-HD096057 (DM), R01-HD105800 (DM), R01-HD032067 (M.M.M.) 및 R01-HD110038 (M.M.M.) 및 NCI-P30 암 센터 지원 보조금 (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. Burroughs Wellcome Fund에서 차세대 임신 상을 수상했습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Organoid Media Formulation | |||
| Name | Company | 카탈로그 번호 | 최종 농도 |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free | Corning | 354230 | 100% |
| 소 췌장에서 추출한 트립신 | 시그마 알드리치 | T1426-1G | 1% |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634010 | 1X |
| N2 보충제 | Life Technologies | 17502048 | 1X |
| B-27™ 보충제 (50X), 비타민 A 뺀 | 성분 Life Technologies | 12587010 | 1X |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µ g/mL |
| N-아세틸-L-시스테인 | 시그마 알드리치 | A9165-5G | 1.25mM |
| L-글루타민 | Life Technologies | 25030024 | 2mM |
| 니코틴아미드 | 시그마 알드리치 | N0636-100G | 10nM |
| ALK-4, -5, -7 억제제, A83-01 | 토크리스 | 2939 | 500nM |
| 재조합 인간 EGF | 페프로텍 | AF-100-15 | 50ng/mL |
| 재조합 인간 Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
| 재조합 인간 Rspondin-1 | Peprotech | 120-38 | 500 ng/mL |
| 재조합 인간 FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| 재조합 인간 HGF | Peprotech | 100-39 | 50 ng/mL |
| WNT3a | R& D systems | 5036-WN | 200 ng/mL |
| 기타 소모품 및 시약 | |||
| Name | Company | 카탈로그 번호 | 최종 농도 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1G | 5 mg/ |
| 소 췌장에서 나온 mL Deoxyribonuclease I | Sigma Aldrich | DN25-100MG | 2 mg/mL |
| DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음 | ThermoFisher | 14190-250 | 1X |
| HBSS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음 | ThermoFisher | 14170112 | 1X |
| Falcon 폴리스티렌 마이크로플레이트 (24-웰) | Fisher Scientific | #08-772-51 | |
| Falcon 폴리스티렌 마이크로플레이트(12-Well) | Fisher Scientific | #0877229 | |
| Falcon Cell Strainers, 40 µ m | Fisher Scientific | #08-771-1 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep (50 µ g) | Genesee Scientific | 11-331 | |
| Trizol 시약 | Invitrogen | 15596026 | |
| DMEM / F-12, HEPES, 페놀 레드 | 없음 ThermoFisher | 11039021 | |
| 소 태아 혈청, 숯 벗겨짐 | 시그마 Aldrich | F6765-500ML | 2 % |
| Estratiol (E2) | Sigma Aldrich | E1024-1G | 10 nM |
| 포름 알데히드 16 % 수성 솔루션, EM 등급 | VWR | 15710 | 4% |
| Epredia 카세트 1 슬롯 티슈 카세트 | Fisher Scientific | 1000961 | |
| Epredia 스테인리스 스틸 임베딩 베이스 몰드 | Fisher Scientific | 64-010-15 | |
| 에탄올, 200 proof (100%) | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
| Permount 마운팅 미디엄 | Fisher Scientific | 50-277-97 | |
| Epredia 나일론 생검 백 | Fisher Scientific | 6774010 | |
| HistoGel 표본 처리 젤 | VWR | 83009-992 | |
| Hematoxylin 용액 Premium | VWR | 95057-844 | |
| Eosin Y (노란빛) 용액 프리미엄 | VWR | 95057-848 | |
| TBS 버퍼, 20X, pH 7.4 | GenDEPORT | T8054 | 1X |
| TBST (10X), pH 7.4 | GenDEPORT | T8056 | 1X |
| 시트르산 | Sigma Aldrich | C0759-1KG | |
| 시트르산 나트륨 삼염기성 이수화물 | Sigma Aldrich | S4641-500G | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Sigma Aldrich | A2153-100G | 3% |
| DAPI 용액(1mg/mL) | ThermoFisher | 62248 | 1:1000 희석 |
| VECTASHIELD 안티페이드 마운팅 미디엄 | Vector Labs | H-1000-10 | |
| 투명 매니큐어 | Fisher Scientific | NC1849418 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드 | Fisher 과학적인 | 22037246 | |
| VWR 마이크로 커버 안경 | VWR | 48393-106 | |
| SuperScript VILO 마스터 믹스 | ThermoFisher | 11755050 | |
| SYBR Green PCR 마스터 믹스 | ThermoFisher | 4364346 | |
| Krt8 항체 (TROMA-I) | DSHB | 트로마-I | 1:50 희석 |
| Vimentin Antobody | Cell Signaling | 5741S | 1:200 dilution |
| 당나귀 anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsosorbed Secondary 항체, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-21209 | 1:250 dilution |
| Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsosbed Secondary 항체, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21206 | 1:250 dilution |
| ZEISS Stemi 508 Stereo 현미경 | ZEISS | ||
| ZEISS Axio Vert.A1 디지털 카메라가 있는 도립 일상 현미경 | ZEISS | ||
| strong>Primer Sequence | Forward (5'-3') | Reverse (5'-3') | _ |
| Lipocalin 2 (Lcn2) | GCAGGTGGTACGTTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC | |
| 락토페린(Ltf) | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTTCTCTCTCGTTC | |
| 프로게스테론(Pgr) | CCCACAGGAGTTTGTGTCAAGCTC, | TAACTTCAGACATCATTTCCGG | |
| 글리세르알데히드 3, 인산염 탈수소효소(Gapdh) | CAATGTGTCCGTCGTGGATCT, | GCCTGCTTCACCACCTTCTT |
참고문헌
- Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
- Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biol....
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재인쇄 및 허가
