방법 논문

In Vitro (시험관 ) 결막 잔 세포의 성별 기반 차이를 연구하는 방법

DOI:

10.3791/64456

⸱

2023년 7월 28일

 ,  , 
1Department of Ophthalmology Schepens Eye Research Institute, Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

이 논문에서

요약

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페놀 레드-프리/태아 무혈청 배지는 성별에 따른 차이 연구에서 결막 잔 세포의 정상적인 기능을 변경하지 않고 외인성 호르몬을 제거하기 위해 고급 RPMI보다 더 나은 옵션입니다.

초록

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안구건조증은 안구 표면 건강에 영향을 미치는 여러 요인으로 인한 질환으로, 여성의 유병률이 매우 높습니다. 결막 잔 세포(CGC)가 안구 표면으로 분비하는 겔 형성 점액의 파괴는 여러 안구 표면 질환의 원인이 됩니다. 외인성 성 호르몬의 제거는 CGC의 성별 차이에 대한 시험관 내 연구 중에 일관된 결과를 얻는 데 필수적입니다. 이 논문은 생리적 기능을 유지하면서 CGC의 성별 차이 연구에서 외인성 호르몬의 존재를 최소화하는 방법을 설명합니다. 남녀 모두의 사후 인간 기증자로부터 얻은 CGC는 10% 소 태아 혈청(FBS)(완전 배지라고 함)이 있는 RPMI 배지의 결막 조각에서 합류할 때까지 배양되었습니다. 실험이 시작되기 거의 48시간 전에 CGC를 페놀 레드 또는 FBS가 없지만 1% BSA(페놀-레드-프리 배지라고 함)가 있는 RPMI 배지로 옮겼습니다. 정상적인 세포 기능은 fura 2/acetoxymethyl(AM) 현미경을 사용하여 카르바콜(Cch, 1 x 10-4 M) 자극 후 세포 내 [Ca 2+]([Ca2+]i)의 증가를 측정하여 연구되었습니다. 결과는 CGC가 48시간 후에도 페놀-적색-프리 배지에서 정상적인 기능을 유지했음을 보여줍니다. Cch 자극 시 페놀 적색이 없는 RPMI 배지와 완전 배지 간에 [Ca2+]i 반응의 유의한 차이는 관찰되지 않았습니다. 따라서 성별 차이 연구에서 CGC의 정상적인 기능을 변경하지 않고 외인성 호르몬을 제거하기 위해 1% BSA가 함유된 페놀-레드 프리 RPMI 배지를 사용하는 것이 좋습니다.

서론

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성별에 따른 차이는 안구 표면의 여러 과정에 영향을 미친다 1,2,3. 이러한 성별에 따른 차이의 임상적 양상은 안구건조증 및 결막염과 같은 남성과 여성의 많은 안구 표면 질환의 유병률 차이입니다 4,5,6. 증거에 따르면 성별에 따른 차이는 X 염색체와 Y 염색체7의 유전자 프로필의 상이한 프로필과 호르몬8의 영향을 포함한 여러 생물학적 수준에서 발생한다. 성별에 따른 차이의 분자적 기초를 연구하면 질병에 대한 더 나은 이해를 제공할 수 있으며, 궁극적으로 맞춤형 의학을 개선할 수 있습니다.

안구 표면은 위에 놓인 눈물막, 각막 및 결막으로 구성됩니다. 눈물막(tear film)9,10, 각막(

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프로토콜

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모든 인체 조직은 과학 연구에 사용하기 위해 기증자의 사전 동의와 승인을 받아 안구 은행에 기증되었습니다. 인간 결막 조직의 사용은 매사추세츠 눈과 귀 인간 연구 위원회(Massachusetts Eye and Ear Human Studies Committee)에서 검토했으며 면제 대상이며 인간 피험자를 대상으로 한 연구의 정의에 부합하지 않는 것으로 결정되었습니다.

1. 1차 인간 잔 세포 배양

  1. 안구 은행에서 인체 결막 조직16을 얻습니다.
  2. 10% 소 태아 혈청(FBS), 2mM 글루타민, 2mM 비필수 아미노산(NEAA), 2mM 피루브산 나트륨, 100μg/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 2mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진술폰산(HEPES)이 보충된 배양 배지인 RPMI-1640 배양 배지를 준비합니다.
  3. 아래 설명된 대로 1차 세포 배양을 수행합니다.
    1. 멸균 메스로 조직을 1mm3 조각으로 다지고 배양 후드의 배양 플레이트에 씨를 뿌립니다. 6웰 플레이트의 각 웰에 4개를 1mL의 완전한 RPMI 배지에 파종합니다. 조직 조각의 방향은 세포 성장에 영향을 미치지 않지만 메스 ....

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결과

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1차 배양에서 인간 CGC는 약 14일 만에 80%의 밀도로 성장합니다. 세포 유형은 잔 세포 마커 CK7 및 HPA-125 에 대한 항체로 면역형광 염색을 통해 확인되었습니다(그림 1). 배지에서 FBS를 제거하면 성 호르몬을 제거할 수 있지만, FBS가 부족하면 세포 반응에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있습니다. 호르몬 제거 방법을 검증하기 위해, 콜린성 작용제(carbachol, Cch 1 × 10-4 M)를 자극제로서 잔 세포를 둘러싼 상이한 신경 말단에 의해 매개되는 생리적 잔 세포 분비를 모방하는 자극으로 사용하였다(26). 대조군 완전 RPMI 배지에서 칼슘 변화의 크기에 차이가 관찰되지 않았으며, 이는 이 방법이 세포 반응의 성별 기반 차이를 연구하는 데 적용될 수 있음을 나타냅니다.

프로토콜 섹션에 설명된 F.......

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토론

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안구 조직의 성별에 따른 차이를 조사하는 것은 질병, 특히 안구건조증과 알레르기성 결막염의 진행 과정을 이해하는 데 도움이 되며, 이는 한쪽 성별에 불균형적으로 영향을 미친다 4,5,6. 이러한 연구에는 동물 모델을 사용할 수 있지만 생체 내 인간 세포와의 유사성이 가장 높기 때문에 인간 조직에서 직접 얻은 데이터가 필수적입니다. 현재 실험 환경에서 사용되는 결막 조직은 70-85세(폐경 후)의 연령 범위에서 사망한 기증자의 것이어서 사망 전 호르몬 효과를 더 쉽게 제어할 수 있습니다. 여기에서 우리는 인간 CGC의 성별 기반 차이를 연구하는 비용 효율적인 방법을 제시했습니다.

일관된 데이터를 얻기 위한 중요한 단계는 성호르몬의 영향을 제거하기 위한 실험 전에 48시간 동안 FBS와.......

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 미국 국립안과연구소(National Eye Institute) 보조금 EY019470(D.A.D)의 지원을 받습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.05% 트립신 1x EDTAGibco (Grand Island, NY)25300-054
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acidFisher Bioreagent (Pittsburgh, PA)BP310-500
Advanced RPMI mediaGibco (Grand Island, NY)12633020
carbacholCayman Chemical (Ann Arbor, MI)144.86
Fetal Bovin SerumR& D (미네소타주 미니애폴리스)S11150H
Fura-2- 아세톡시메틸 에스테르 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)F1221
Human conjunctival tissueEversight Eye Bank (Ann Arbor, MI)N/A
무기염 for KRB bufferSigma-Aldrich (St. Louis, MO)모든 브랜드는
L-glutamine을Lonza Group (Basel, Switzerland)17-605F
비필수 아미노산Gibco (Grand Island, NY)11140-050
페니실린/스트렙토마이신Gibco (Grand Island, NY)15140-122
페놀 레드-프리 RPMI 미디어 Gibco (Grand Island, NY)11835055
Pluronic acid F127MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)P2443-250G
RPMI-1640 배양 배지Gibco (Grand Island, NY)21875034
메스Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)12460451모든 멸균 수술용 메스는
피루브산 나트륨Gibco (Grand Island, NY)를11360-070
설핀피라존밀리포어시그마(미국 매사추세츠주 벌링턴)S9509-5G
작동시킬 것입니다. 작동시킬 수 있습니다.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
  2. Wang, S. B., et al.

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재인쇄 및 허가

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Conjunctival Goblet CellsSex Based DifferencesDry Eye DiseaseIntracellular Calcium MeasurementPrimary Cell CulturePhenol Red Free MediumMucin SecretionImmunofluorescent StainingCarbachol StimulationHuman Conjunctiva

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