여기에서는 일차 인간 뇌 미세 혈관 내피 세포, 성상 세포 및 혈관 주위 세포를 기반으로 혈액 뇌 장벽의 삼중 세포 배양 모델을 구축하는 방법을 설명합니다. 이 다세포 모델은 시험관 내 허혈성 뇌졸중 중 신경 혈관 단위 기능 장애의 연구 또는 약물 후보의 스크리닝에 적합합니다.
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이 논문에서
요약
초록
허혈성 뇌졸중은 치료 옵션이 제한된 전 세계적으로 사망 및 장애의 주요 원인입니다. 허혈성 뇌졸중의 신경 병리학은 뇌로의 혈액 공급 중단으로 세포 사멸 및인지 기능 장애를 일으키는 특징이 있습니다. 허혈성 뇌졸중 중 및 후에 혈액-뇌장벽(BBB) 기능 장애는 부상 진행을 촉진하고 환자 회복 불량에 기여합니다. 현재의 BBB 모델은 주로 내피 단일 배양 및 성상 세포 또는 pericytes와의 이중 공동 배양을 포함합니다.
이러한 모델은 세포 간 통신에 필수적인 동적 뇌 미세 환경을 완전히 모방하는 능력이 부족합니다. 또한 일반적으로 사용되는 BBB 모델에는 종종 불멸화 된 인간 내피 세포 또는 번역 제한이 있는 동물 유래(설치류, 돼지 또는 소) 세포 배양이 포함됩니다. 이 논문은 시험관 내에서 허혈성 뇌 손상의 조사를 가능하게 하는 일차 인간 세포(뇌 미세혈관 내피 세포, 성상세포 및 뇌 혈관 혈관주위세포)만 포함하는 새로운 웰 삽입 기반 BBB 모델을 설명합니다.
장벽 무결성에 대한 산소-포도당 박탈(OGD)의 효과는 수동 투과성, 경내피 전기 저항(TEER) 측정 및 저산소 세포의 직접 시각화에 의해 평가되었습니다. 제시된 프로토콜은 생체 내에서 BBB의 세포 간 환경을 모방하는 뚜렷한 이점을 제공하여 허혈성 뇌 손상 설정에서 새로운 치료 전략을 개발하기 위한 보다 현실적인 시험관 내 BBB 모델로서 작용합니다.
서론
뇌졸중은 전 세계적으로 사망 및 장기 장애의 주요 원인 중 하나입니다1. 뇌졸중 발병률은 나이가 들면서 급격히 증가하여 55 세 이후 10 년마다 두 배로 증가합니다2. 허혈성 뇌졸중은 혈전 및 색전성 사건으로 인한 뇌 혈류 장애의 결과로 발생하며, 이는 모든 뇌졸중 사례의 80 % 이상을 포함합니다3. 지금도 허혈성 뇌졸중 후 조직 사망을 최소화 할 수있는 치료 옵션은 상대적으로 적습니다. 존재하는 치료법은 시간에 민감하며 결과적으로 항상 좋은 임상 결과로 이어지는 것은 아닙니다. 따라서 뇌졸중 후 회복에 영향을 미치는 허혈성 뇌졸중의 복잡한 세포 메커니즘에 대한 연구가 시급합니다.
BBB는 혈액과 뇌 실질 사이의 분자 교환을위한 동적 인터페이스입니다. 구조적으로, BBB는 기저막, 혈관주위세포, 및 성상세포 말단발4에 의해 둘러싸인 접합 복합체에 의해 상호 연결된 뇌 미세혈관 내피 세포로 구성된다. Pericytes 및 성상 세포는 강하고 단단한 접합부 5,6의 형성....
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프로토콜
참고: 이 프로토콜에 사용된 모든 셀, 재료, 장비 및 솔루션과 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 삼중 세포 배양 BBB 모델 설정
- 심기 주위 세포
- 합류할 때까지 37°C에서 5%CO2 인큐베이터 내에서 세포 접착을 위한 활성화된 표면을 가진 T75 배양 플라스크에서 HBVP를 배양합니다. 합류점에 도달하면 오래된 혈관주위세포 배지를 흡인하고 따뜻한 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 5mL로 세포를 세척합니다. DPBS를 흡인하고 4mL의 따뜻한 트립신-EDTA 용액과 1mL의 DPBS를 조합하여 플라스크에서 세포를 분리합니다.
참고: P7 이후의 구절은 사용하지 마십시오. - 플라스크를CO2 인큐베이터에서 37°C에서 5분 동안 인큐베이션한다. 현미경으로 보고 세포가 플라스크에서 분리되었는지 확인합니다. 5mL의 따뜻한 혈관주위세포 배지(2% 소 태아 혈청[FBS] 함유)를 플라스크에 추가하고 분리된 세포를 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 세포 현탁액을 200 × g에서 3분 동안 원심분리하여 세포가 튜브 바닥에 펠릿을 ....
- 합류할 때까지 37°C에서 5%CO2 인큐베이터 내에서 세포 접착을 위한 활성화된 표면을 가진 T75 배양 플라스크에서 HBVP를 배양합니다. 합류점에 도달하면 오래된 혈관주위세포 배지를 흡인하고 따뜻한 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 5mL로 세포를 세척합니다. DPBS를 흡인하고 4mL의 따뜻한 트립신-EDTA 용액과 1mL의 DPBS를 조합하여 플라스크에서 세포를 분리합니다.
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결과
HBMEC의 장벽 기능에 대한 성상 세포 및 주변 세포의 영향을 조사하기 위해 HBMEC 단일 배양 및 대조군으로 두 개의 이중 공동 배양 모델 (그림 1B)과 함께 세포 배양 삽입물 (그림 1A)에 대한 삼중 세포 배양 BBB 모델을 구성했습니다. 이중 공동 배양 통제에는 HBMEC와 HA의 비접촉 공동 배양 및 HBMEC와 HBVP의 접촉 공동 배양이 포함되었습니다. 공동 배양에서 6일 후, 모든 실험 셋업을 4시간 동안 OGD에 적용하였다. 표시된 BBB 구성에서 내피 단층의 장벽 무결성은 OGD 전후와 24시간의 재산소화 후 TEER을 결정하여 평가되었습니다(그림 1C). 4 시간 동안 OGD는 HBMEC 단일 배양 및 HBMEC 및 HBVP와의 공동 배양 모델에서만 TEER 값을 크게 감소시켰다. 이러한 감소된 수준은 24시간의 재산소 공급 후 기준 수준에 도달.......
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토론
이 프로토콜에서, 우리는 시험관 내 허혈성 뇌졸중의 설정에서 BBB 기능 장애를 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 삼중 내피 세포-pericyte-성상세포 배양 BBB 모델을 설정하는 방법을 설명합니다. 혈관주위세포가 생체내에서 내피 세포의 가장 가까운 이웃이라는 것을 고려 하면, HBVP는 이 모델16에서 웰 삽입물의 밑면에 도금된다. 이러한 구성은 성상 세포와 내피 세포 사이의 직접적인 세포 간 통신이 부족하지만,이 배열은 분비 된 가용성 인자를 통해 세포 유형 간의 간접적 인 세포 간 통신을 허용합니다. 이 시스템에 성상 세포와 혈관 주위 세포가 존재하면 HBMEC 무결성이 크게 향상되어 단층의 세포 투과성을 작은 크기의 추적자로 제한합니다. 또한, 성상 세포 및 혈관 주위 세포는 OGD 조건에서 HBMEC에 대한 보호 효과가 있습니다.
개발된 프로토콜에서는 기저측 구획에 대한 세포 비율.......
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공개 사항
모든 저자는 이해 상충이 없다고 밝혔습니다.
감사의 글
이 작업은 국립 보건원 (NIH) 보조금 MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 및 DA047157의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 24mm 트랜스웰(0.4 &마이크로); m 기공 폴리 에스테르 멤브레인 인서트 | Corning | 3450 | |
| 35mm 유리 바닥 접시 | MatTek Life Sciences (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
| Astrocyte Medium | Science Cell | 1801 | |
| 부착 계수 | 세포 시스템 (Fisher Scientific) | 4Z0-201 | |
| BD 60 mL 주사기 | BD | 309653 | |
| BrainPhys 이미징 최적화된 매체 | STEMCELL Technologies | 5791 | |
| 완전한 클래식 매체 with serum and CultureBoost | 4Z0-500 | 세포 시스템 | |
| Corning 50 mL PP 원심분리기 튜브 (CentriStar Cap이 있는 원뿔형 바닥 | VWR | 430829 | |
| Corning 75cm² U-형 경사형 목 미처리 세포 배양 플라스크; | Corning | 431464U | |
| Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black 폴리스티렌 마이크로플레이트 | Corning | 3340 | |
| Countes 세포 계수 챔버 슬라이드 | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II FL 자동 세포 계수기 | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
| Decon CiDehol 70 이소프로필 알코올 용액 | 피셔 사이언티픽 | 04-355-71 | |
| 일회용 페트리 접시 | VWR | 25384-088 | |
| DMEM 매체 (포도당 없음, 글루타민 없음, 페놀 레드 없음) | ThermoFisher | A14430-01 | 무포도당 매체 |
| DPBS (칼슘 없음, 마그네슘 없음) | ThermoFisher | 14190250 | |
| EBM 내피 세포 성장 기초 배지, 페놀 레드 프리, 500 mL | Lonza | CC-3129 | |
| EVOM2 상피 볼트/옴 (TEER) 미터, STX2 전극이 있는 | 세계 정밀 기기 | NC9792051 | 상피 전압저항계 |
| 플루오레세인 이소티오시아네이트– dextran (wt 20,000) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
| 플루오레세인 이소티오시아네이트– Dextran (wt 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
| Fluorview FV3000 컨포칼 현미경 | Olympus | FV3000 | |
| 가스 탱크 (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
| HBSS (칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드 없음) | Thermofisher | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL 물 용액 | ThermoFisher | H3570 | |
| Human Astrocytes | Science Cell | 1800 | |
| Human Brain Vascular Pericytes | Science Cell | 1200 | |
| Hypoxia Incubator Chamber | STEMCELL Technologies | 27310 | |
| Image-iT Green Hypoxia Reagent | ThermoFisher | I14834 | |
| Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
| Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ACBRI 376 | Cell Systems | |
| Rocking Platform Shaker, Double | VWR | 10860-658 | |
| 단일 유량계 | STEMCELL Technologies | 27311 | |
| SpectraMax iD3 Microplate Reader | 분자 장치 | 75886-128 | |
| 주사기 필터, 25mm, 0.22 μ m, PVDF, 멸균 | NEST Scientific | 380121 | |
| TPP Mutli-well 플레이트(6웰) | MidSci | TP92406 | |
| TPP 조직 배양 플라스크 T-75 플라스크 | MidSci | TP90075 | 세포 접착을 위한 활성 표면이 있는 플라스크 |
| 트립신-EDTA(0.25%), 페놀 레드 | ThermoFisher | 25200056 | |
| UltraPure 증류수 | Invitrogen(Life Technologies) | 10977-015 | |
| 우노 스테이지 탑 인큐베이터- | 오코랩 | UNO-T-H-CO2-TTL |
참고문헌
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 133 (94), 38(2016).
- Yousufuddin, M., Young, N. Aging and ischemic stroke. Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).
- Donkor, E. S.
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재인쇄 및 허가
