CRISPR-Cas 시스템과 anti-CRISPR 단백질은 Saccharomyces cerevisiae의 부울 게이트 체계에 통합되었습니다. 새로운 소형 논리 회로는 우수한 성능을 보였으며 dCas9/dCas12a 기반 전사 인자와 항-CRISPR 단백질의 특성에 대한 이해를 심화시켰습니다.
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방법 논문
CRISPR-Cas 시스템 및 Anti-CRISPR 단백질을 기반으로 하는 유전자 디지털 회로
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
합성 유전자 부울 게이트 및 디지털 회로는 의료 진단에서 환경 보호에 이르기까지 광범위한 응용 분야를 가지고 있습니다. CRISPR-Cas 시스템과 천연 억제제인 항-CRISPR 단백질(Acrs)의 발견은 생체 내 유전자 디지털 회로를 설계하고 구현하기 위한 새로운 도구를 제공합니다. 여기에서는 "설계-구축-테스트-학습" 생물 공학 주기의 아이디어를 따르고 해당 Acrs와 함께 dCas9/dCas12a를 사용하여 Saccharomyces cerevisiae에서 일부는 부울 게이트처럼 작동하는 작은 전사 네트워크를 설정하는 프로토콜을 설명합니다. 이러한 결과는 전사 인자로서 dCas9/dCas12a의 특성을 지적합니다. 특히, 유전자 발현의 최대 활성화를 달성하기 위해 dSpCas9는 VP64 활성화 도메인(AD)의 여러 사본을 수집하는 조작된 스캐폴드 RNA와 상호 작용해야 합니다. 대조적으로, dCas12a는 C 말단에서 강력한 VP64-p65-Rta(VPR) AD와 융합되어야 합니다. 또한, 두 Cas 단백질의 활성은 세포에서 sgRNA/crRNA의 양을 증가시킨다고 해서 향상되지 않습니다. 이 기사에서는 CRISPR-dCas-Acr 상호 작용을 기반으로 부울 게이트를 구축하는 방법도 설명합니다. 인간 에스트로겐 수용체의 AcrIIA4 융합 호르몬 결합 도메인은 β-에스트라디올에 반응하는 NOT 게이트의 핵심인 반면, 유도성 GAL1 프로모터에 의해 합성된 AcrVA는 갈락토오스를 입력으로 사용하여 YES 및 NOT 게이트를 모두 모방할 수 있습니다. 후자의 회로에서 AcrVA5는 dLbCas12a와 함께 최상의 논리 동작을 보여주었습니다.
서론
2011년, 연구자들은 디지털 합성 유전자 회로의 자동 설계를 위한 계산 방법을 제안하고 해당 소프트웨어를 개발했다1. 사용자는 입력 수(3개 또는 4개)를 지정하고 회로 진리표를 채워야 했습니다. 이것은 전자 공학의 기술을 사용하여 회로 구조를 도출하는 데 필요한 모든 정보를 제공했습니다. 진리표는 Karnaugh 지도 방법2를 통해 두 개의 부울 공식으로 변환되었습니다. 각 부울 공식은 회로 입력(일부)과 그 부정(리터럴) 간의 논리 연산(합계 또는 곱셈)을 설명하는 절로 구성됩니다. 절은 차례로 합산(OR) 또는 곱하기(AND)하여 회로 출력을 계산합니다. 모든 회로는 POS(합계 곱) 형식으로 작성된 공식과 SOP(곱 합계) 표현으로 작성된 공식의 두 가지 공식에 따라 실현될 수 있습니다. 전자는 리터럴의 논리 합계를 포함하는 절(즉, 부울 게이트)의 곱으로 구성됩니다. 대조적으로, 후자는 리터럴이 곱해지는 절의 합계입니다.
전기 회로는 브레드보드에서 서로 다른 게이트를 물리적으로 배선하여 실현할 수 있습니다. 전류는 게이트 간의 신호 교환을 허용하여 출력을 계산합니다.
생물학에서는 상....
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프로토콜
1. sgRNA/crRNA 발현 카세트의 설계 및 구성
참고: sgRNA/crRNA 발현 카세트에는 두 가지 종류가 있습니다: 1로 명명된 SNR5210-은 RNA 중합효소 III-의존성 SNR52 프로모터, sgRNA/crRNA 서열 및 SUP4 터미네이터로 구성됩니다. RGR11로 약칭되는 또 다른 것은 RNA 중합효소 II 의존성 ADH1 프로모터, 두 개의 리보자임(귀상어 리보자임-HH 및 간염 델타 바이러스 리보자임-HDV)을 포함하는 RGR(리보자임-가이드 RNA-리보자임) 구조와 그 사이에 있는 sgRNA/crRNA의 서열 및 ADH1 터미네이터로 구성됩니다. Cas9 상동체를 안내하는 sgRNA는 스페이서 서열과 특징적인 직접 반복12로 구성되는 반면, Cas12a 단백질에 대한 crRNA는 스페이서 서열13,14에 이어 직접 반복으로 구성됩니다(이 연구에 사용된 모든 DNA 서열에 대한 보충 ....
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결과
RNA 중합효소 III형 프로모터에 의한 sgRNA/crRNA 발현
먼저, 이 작업은 그림 1A에 표시된 전사 활성화 회로(회로 1)의 엔지니어링을 다루었습니다. 그것은 세 가지 기본 구성 요소를 포함했다 : 1) yEGFP (리포터)를 암호화하는 유전자, dCas9 / dCas12a-AD에 대한 표적 부위를 제공하는 일련의 다른 합성 프로모터가 선행되었다. 2) 활성화 도메인 (각각 VP64 및 VPR)에 융합되고 하나 또는 두 개의 핵 국소화 서열 (NLS)을 함유하는 dCas9 또는 dCas12a의 효모 코돈 최적화 버전. 두 dCas 단백질 모두 강력한 구성 프로모터-pGPD에 의해 생성되었습니다. 및 3) dCas9/dCas12a-AD를 표적 부위로 유도하는 sgRNA/crRNA 서열. dCas9/dCas12a 기반 활성제의 활성화 효율을 리포터의 형광 강도(FACS 실험을 통해 측정)에 의해 시각화하고 반영했습니다.......
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토론
이 프로토콜은 "DBTL(Design-Build-Test-Learn)" 생물 공학 주기에 따라 건식 실험실 및 습식 실험실 실험 모두에 대해 합성 유전자 디지털 회로에 대한 완전한 워크플로를 보여주었습니다. 여기서는 S. cerevisiae 의 작은 전사 네트워크를 설계하고 구축하여 CRISPR-Cas 시스템, 주로 dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a 및 해당 항-CRISPR 단백질에 초점을 맞췄습니다. 그들 중 일부는 디지털 회로의 기본 구성 요소인 부울 게이트를 모방했습니다. 여기에 설명된 모든 회로를 통해 S. cerevisiae에서 CRISPR 관련 및 항-CRISPR 단백질의 특성과 특징을 묘사할 수 있었습니다. 이러한 결과는 유전자 디지털 회로의 계획에 이러한 단백질을 포함시키는 데 필수적입니다.
DBTL 개념은 합성 생물학의 프레임워크를 제공하는 반면, 새로운 아티팩트를 테스트한 후 많은 최적화와 개선이 이루어져야.......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
FACS 실험에 도움을 준 Zhi Li 및 Xiangyang Zhang과 함께 일반적인 도움을 주신 합성 생물학 연구소 SPST, TJU의 모든 학생들에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.1 mL PCR 8-스트립 튜브 | NEST | 403112 | |
| 0.2 mL PCR 튜브 | Axygen | PCR-02-C | |
| 1.5 mL 마이크로튜브 | Axygen | MCT-150-C | |
| 15 mL 원심분리기 튜브 | BIOFIL | CFT011150 | |
| 2 mL 마이크로튜브 | Axygen | MCT-200-C | |
| 50 mL 원심분리기 튜브 | BIOFIL | CFT011500 | |
| 아가로스-분자 생물학 등급 | Invitrogen | 75510-019 | |
| 암피실린 나트륨 염 | Solarbio | 69-52-3 | |
| Applied biosystems veriti 96-well thermal cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375786 | |
| AxyPrep DNA 젤 추출 키트 Axygen | AP-GX-250 | ||
| BD FACSuite CS& 앰프; T 연구 구슬 | BD | 650621 | 형광 구슬 |
| BD FACS전기 유세포 분석기 | BD-Centrifuge | ||
| Eppendorf | 5424 | ||
| Centrifuge Sorvall ST 16R | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | |
| E. coli competent cells (Strain DH5α) | Life Technologies | 18263-012 | |
| ECL 선택 웨스턴 블로팅 검출 시약 | GE 헬스케어 | RPN2235 | |
| 전기영동 장치 | Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd | JY300C | |
| 플랫 8-스트립 캡 | NEST | 406012 | |
| 유전자 합성 회사 | Azenta Life Sciences | https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences | |
| 염소 안티 마우스 IgG (H+L) 교차 흡착 2차 항체 Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11004 | |
| HiFiScript cDNA 합성 키트 | CWBIO | CW2569M | 6.2.2.1단계에서 사용 |
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| Pipet 팁— 10 &뮤; L | Axygen | T-300-R-S | |
| 피펫 팁— 1000 &뮤; L | Axygen | T-1000-B-R-S | |
| 피펫 팁— 200 &뮤; L | Axygen | T-200-Y-R-S | |
| pRSII403 | Addgene | 35436 | |
| pRSII404 | Addgene | 35438 | |
| pRSII405 | Addgene | 35440 | |
| pRSII406 | Addgene | 35442 | |
| pRSII424 | Addgene | 35466 | |
| pTPGI_dSpCas9_VP64 | Addgene | 49013 | |
| Q5 High-fidelity DNApolymerase | New England Biolabs | M0491 | |
| 제한 효소-Acc65I | New England Biolabs | R0599 | |
| 제한 효소-BamHI | New England Biolabs | R0136 | |
| 제한 효소-SacI-HF | New England Biolabs | R3156 | |
| 제한 효소-XhoI | New England Biolabs | R0146 | |
| Roche LightCycler 96 | Roche-Real-Time PCR 기기 | ||
| S. cerevisiae CEN. PK2-1C | - | - | 부모 변형률. 유전자형은 다음과 같습니다 : MATa; 그의3D1; 레우2-3_112; 우라3-52; TRP1-289; MAL2-8C; SUC2 |
| 스템 루프 키트 | SparkJade | AG0502 | 6.2.1.3 |
| T100 Thermal Cycler | BIO-RAD | 186-1096 | |
| T4 DNA 리가제 | New England Biolabs | M0202 | |
| T5 Exonuclease | New England Biolabs | M0363 | |
| Taq DNA 리가제 | New England Biolabs | M0208 | |
| Taq DNA 중합효소 | New England Biolabs | M0495 | |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye) | Takara | RR820Q | |
| YeaStar RNA kit | Zymo Research | R1002 | |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E8875 |
참고문헌
- Marchisio, M. A., Stelling, J. Automatic design of digital synthetic gene circuits. PLOS Computational Biology. 7 (2), 1001083(2011).
- Karnaugh, M. The map method for synthesis of combinational logic circuits. Transactions of the Ameri....
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재인쇄 및 허가
