CRISPR-Cas 시스템 및 Anti-CRISPR 단백질을 기반으로 하는 유전자 디지털 회로

요약

CRISPR-Cas 시스템과 anti-CRISPR 단백질은 Saccharomyces cerevisiae의 부울 게이트 체계에 통합되었습니다. 새로운 소형 논리 회로는 우수한 성능을 보였으며 dCas9/dCas12a 기반 전사 인자와 항-CRISPR 단백질의 특성에 대한 이해를 심화시켰습니다.

초록

합성 유전자 부울 게이트 및 디지털 회로는 의료 진단에서 환경 보호에 이르기까지 광범위한 응용 분야를 가지고 있습니다. CRISPR-Cas 시스템과 천연 억제제인 항-CRISPR 단백질(Acrs)의 발견은 생체 내 유전자 디지털 회로를 설계하고 구현하기 위한 새로운 도구를 제공합니다. 여기에서는 "설계-구축-테스트-학습" 생물 공학 주기의 아이디어를 따르고 해당 Acrs와 함께 dCas9/dCas12a를 사용하여 Saccharomyces cerevisiae에서 일부는 부울 게이트처럼 작동하는 작은 전사 네트워크를 설정하는 프로토콜을 설명합니다. 이러한 결과는 전사 인자로서 dCas9/dCas12a의 특성을 지적합니다. 특히, 유전자 발현의 최대 활성화를 달성하기 위해 dSpCas9는 VP64 활성화 도메인(AD)의 여러 사본을 수집하는 조작된 스캐폴드 RNA와 상호 작용해야 합니다. 대조적으로, dCas12a는 C 말단에서 강력한 VP64-p65-Rta(VPR) AD와 융합되어야 합니다. 또한, 두 Cas 단백질의 활성은 세포에서 sgRNA/crRNA의 양을 증가시킨다고 해서 향상되지 않습니다. 이 기사에서는 CRISPR-dCas-Acr 상호 작용을 기반으로 부울 게이트를 구축하는 방법도 설명합니다. 인간 에스트로겐 수용체의 AcrIIA4 융합 호르몬 결합 도메인은 β-에스트라디올에 반응하는 NOT 게이트의 핵심인 반면, 유도성 GAL1 프로모터에 의해 합성된 AcrVA는 갈락토오스를 입력으로 사용하여 YES 및 NOT 게이트를 모두 모방할 수 있습니다. 후자의 회로에서 AcrVA5는 dLbCas12a와 함께 최상의 논리 동작을 보여주었습니다.

서론

2011년, 연구자들은 디지털 합성 유전자 회로의 자동 설계를 위한 계산 방법을 제안하고 해당 소프트웨어를 개발했다¹. 사용자는 입력 수(3개 또는 4개)를 지정하고 회로 진리표를 채워야 했습니다. 이것은 전자 공학의 기술을 사용하여 회로 구조를 도출하는 데 필요한 모든 정보를 제공했습니다. 진리표는 Karnaugh 지도 방법²를 통해 두 개의 부울 공식으로 변환되었습니다. 각 부울 공식은 회로 입력(일부)과 그 부정(리터럴) 간의 논리 연산(합계 또는 곱셈)을 설명하는 절로 구성됩니다. 절은 차례로 합산(OR) 또는 곱하기(AND)하여 회로 출력을 계산합니다. 모든 회로는 POS(합계 곱) 형식으로 작성된 공식과 SOP(곱 합계) 표현으로 작성된 공식의 두 가지 공식에 따라 실현될 수 있습니다. 전자는 리터럴의 논리 합계를 포함하는 절(즉, 부울 게이트)의 곱으로 구성됩니다. 대조적으로, 후자는 리터럴이 곱해지는 절의 합계입니다.

전기 회로는 브레드보드에서 서로 다른 게이트를 물리적으로 배선하여 실현할 수 있습니다. 전류는 게이트 간의 신호 교환을 허용하여 출력을 계산합니다.

생물학에서는 상황이 더 복잡합니다. 부울 게이트는 전사 또는 번역(또는 둘 다)이 조절되는 전사 단위(TU; 즉, 진핵 세포 내부의 서열 "프로모터-코딩 영역-터미네이터")로서 실현될 수 있다. 따라서, 적어도 두 종류의 분자는 생물학적 배선을 확립한다: 전사 인자 단백질과 비코딩, 안티센스 RNA¹.

유전자 디지털 회로는 2 개 또는 3 개의 게이트 층으로 구성됩니다 : 1) YES (버퍼) 및 NOT 게이트로 만들어지고 입력 화학 물질을 배선 분자로 변환하는 입력 층; 2) 해당 부울 공식에 절이 있는 만큼의 TU로 구성된 내부 계층. 회로가 SOP 공식에 따라 설계되면 내부 계층의 모든 절은 소위 분산 출력 아키텍처에서 회로 출력(예: 형광)을 생성합니다. 합계 곱 (POS) 공식을 사용하는 경우 3) 최종 층이 필요하며, 여기에는 내부 층에서 배선 분자를 수집하는 단일 곱셈 게이트가 포함됩니다.

전반적으로 합성 생물학에서는 동일한 회로에 대해 다양한 계획을 설계할 수 있습니다. TU와 배선 분자의 수와 종류가 다릅니다. 효모 세포에서 구현하기 가장 쉬운 솔루션을 선택하기 위해 각 회로 설계는 다음과 같이 정의되는 복잡성 점수 S와 연관됩니다.

여기서 A 는 활성제의 수를 나타내고, R 은 억제인자의 수를 나타내고, a 는 안티센스 RNA 분자의 양을 나타냅니다. 활성제 또는 억제자가 회로에 없으면 S에 대한 기여도는 0입니다. 따라서 많은 수의 직교 전사 계수가 필요한 경우 실험실에서 회로 방식(높은 S)을 실현하기가 더 어렵습니다. 이것은 디지털 회로 내부의 완전한 배선을 실현하기 위해 새로운 활성제와 억제기가 새로 설계되어야 함을 의미합니다. 원칙적으로, 새로운 DNA-결합 단백질은 징크 핑거 단백질(Zinc Finger protein)3 및 TAL 이펙터⁽ TAL effector)⁴ 를 주형으로 사용하여 조립할 수 있다. 그러나 이 옵션은 너무 힘들고 시간이 많이 걸리는 것처럼 보입니다. 따라서 복잡한 유전자 회로를 완성하기 위해 주로 작은 RNA와 번역 조절에 의존해야 합니다.

원래 이 방법은 박테리아의 디지털 회로를 제작하기 위해 개발되었습니다. 실제로, 진핵 세포에서는 안티센스 RNA 대신 마이크로RNA(miRNA) 또는 작은 간섭 RNA(siRNA)에 대해 이야기하는 것이 더 적합합니다.⁵. 그러나 RNAi 경로는 효모 S. cerevisiae에 존재하지 않습니다. 따라서 완전한 전사 네트워크를 선택해야 합니다. 회로에 5개의 활성기와 5개의 억제기가 필요하다고 가정합니다. 복잡성 점수는 S = 32입니다. 10개의 전사 인자를 활성화 도메인(AD)에 융합된 단일 dCas9⁶ (뉴클레아제 결핍 Cas9)으로 대체함으로써 회로 복잡성을 줄일 수 있습니다. ^{도 7}에서 보는 바와 같이, dCas9-AD는 TATA 박스와 TSS(transcription start site) 사이에 프로모터를 결합시킬 때 효모에서 억제인자로 작용하고, TATA 박스의 상류에 잘 결합할 때 활성화제로서 작용한다. 따라서 10개의 전사 인자를 단일 dCas9-AD 융합 단백질과 10개의 sgRNA(단일 가이드 RNA)로 대체하여 S = 11의 총 복잡성 점수를 얻을 수 있습니다. 10개의 sgRNA를 빠르고 쉽게 합성할 수 있는 반면, 앞서 언급했듯이 10개의 단백질을 조립하려면 훨씬 더 길고 복잡한 작업이 필요합니다.

대안적으로, 두 개의 직교 dCas 단백질(예: dCas9 및 dCas12a)을 사용할 수 있는데, 하나는 AD에 융합하기 위한 것이고, 다른 하나는 억제 도메인과 결합하기 위한 것입니다. 복잡성 점수는 한 단위(S = 12)만 증가합니다. 따라서 CRISPR-dCas 시스템은 S. cerevisiae에서 매우 복잡한 유전자 디지털 회로를 구성하는 열쇠입니다.

이 논문은 효모에서 dCas9 및 dCas12a 기반 억제인자 및 활성제의 효율성을 깊이 특성화합니다. 결과는 활성을 최적화하기 위해 많은 양의 sgRNA를 요구하지 않으므로 에피솜 플라스미드를 우선적으로 피하는 것으로 나타났습니다. 또한, dCas9 기반 활성제는 VP64 AD의 사본을 모집하는 스캐폴드 RNA(scRNA)를 사용할 때 훨씬 더 효과적입니다. 반면, dCas12a는 강력한 VPR AD에 직접 융합될 때 잘 작동합니다. 또한, 합성 활성화 프로모터는 활성화제의 구성에 따라 다양한 수의 표적 부위를 필요로 합니다(예: dCas12a-VPR을 사용할 때 3개, dCas9-VP64를 사용할 경우 6개, dCas9 및 scRNA를 사용하는 경우 1개만). 억제자로서, dCas12a는 프로모터보다는 코딩 영역을 결합할 때 더 예리하게 나타난다.

그러나 CRISPR-dCas9/dCas12a는 화학물질과 직접 상호 작용하지 않는다는 단점이 있습니다. 따라서 입력 계층에서는 아무 소용이 없을 수 있습니다. 이러한 이유로 항-CRISPR 단백질(Acrs)을 포함하는 대체 부울 게이트 설계가 조사되었습니다. Acrs는 (d)Cas 단백질에 작용하여 작용을 억제한다⁸. 따라서 CRISPR-(d)Cas 시스템의 활성을 조절하는 수단입니다. 이 논문은 S. cerevisiae에서 유형 II Acr과 (d)Cas9, 유형 V Acrs와 (d)Cas12a 사이의 상호 작용을 철저히 분석합니다. Acrs는 Cas 단백질보다 훨씬 작기 때문에 에스트로겐 β-에스트라디올에 반응하는 NOT 게이트는 인간 에스트로겐 수용체 9-HBD(hER)-를 AcrIIA4에 융합하여 구축되었습니다. 게다가, 갈락토오스 유도 시 dCas12a(-AD)와 AcrVA를 구성적으로 발현하는 소수의 YES 및 NOT 게이트가 실현되었습니다. 현재 이러한 게이트는 개념 증명으로만 사용됩니다. 그러나 그들은 또한 효모 세포에서 합성 유전자 디지털 회로의 계산 자동 설계를 수행하기 위한 알고리즘에 대한 심층적인 재고를 향한 첫 번째 단계를 나타냅니다.

프로토콜

1. sgRNA/crRNA 발현 카세트의 설계 및 구성

참고: sgRNA/crRNA 발현 카세트에는 두 가지 종류가 있습니다: 1로 명명된 SNR52¹⁰-은 RNA 중합효소 III-의존성 SNR52 프로모터, sgRNA/crRNA 서열 및 SUP4 터미네이터로 구성됩니다. RGR¹¹로 약칭되는 또 다른 것은 RNA 중합효소 II 의존성 ADH1 프로모터, 두 개의 리보자임(귀상어 리보자임-HH 및 간염 델타 바이러스 리보자임-HDV)을 포함하는 RGR(리보자임-가이드 RNA-리보자임) 구조와 그 사이에 있는 sgRNA/crRNA의 서열 및 ADH1 터미네이터로 구성됩니다. Cas9 상동체를 안내하는 sgRNA는 스페이서 서열과 특징적인 직접 반복¹²로 구성되는 반면, Cas12a 단백질에 대한 crRNA는 스페이서 서열^13,14에 이어 직접 반복으로 구성됩니다(이 연구에 사용된 모든 DNA 서열에 대한 보충 표 1 참조).

1. Cas9/Cas12a 매개 전사 활성화를 위한 스페이서 시퀀스를 설계합니다.
   1. 박테리아 렉스 연산자 서열(lexOp로 명명됨)을 표적 부위 ^15,16로 활용하고 효모 강화 녹색 형광 단백질(yEGFP)¹⁷의 발현을 유도하는 CYC1 프로모터에 삽입합니다. 따라서 스페이서 시퀀스는 삽입된 lexOp에 의해 정의되고 이를 보완합니다.
2. CRISPRDIRECT 도구¹⁸을 통해 스페이서 시퀀스의 직교성을 확인합니다.
   1. 텍스트 필드에 PAM 시퀀스 옆에 있는 lexOp 시퀀스를 붙여넣고, PAM 시퀀스를 dCas9의 경우 NRG로, dCas12a의 경우 TTTV로 정의하고, 드롭다운 목록에서 종을 신진 효모(Saccharomyces cerevisiae) S288C 게놈으로 지정합니다. 디자인을 클릭합니다. 20mer+PAM 또는 12mer+PAM 검색에 일치하는 대상 사이트가 없는지 확인합니다.
3. sgRNA/crRNA 발현 카세트를 구성합니다.
   1. 터치다운 PCR을 사용하여 프로모터, 코딩 서열 및 터미네이터와 같은 표준 생물학적 부분의 DNA 서열을 증폭합니다.
      1. 다음을 포함하는 반응 혼합물을 준비합니다: 20-40 ng의 DNA 주형, 10 μM 정방향 프라이머 1 μL (즉, ot25, sgRNA/crRNA 발현 플라스미드 구성), 1 μL의 10 μM 역방향 프라이머 (즉, ot26, sgRNA/crRNA 발현 플라스미드 구성), 5 μL의 2.5 mM dNTP 믹스, 0.5 μL의 DNA 중합효소, 10 μL의 5x DNA 중합효소 반응 완충액, 및 이중 증류수(_ddH2O)를 최대 50 μL의 총 부피로 처리한다.
         참고: 이 연구에 사용된 프라이머 목록은 보충 표 2 를 참조하십시오.
      2. 열순환기에서 터치다운 PCR 프로그램 실행:
         1단계: 98°C에서 30초 동안
         10 사이클의 2단계: 98 °C에서 10 초, 68 °C에서 20 초, 72 °C에서 15 초.
         25 사이클의 스테이지 3: 98 °C에서 10 초, 59 °C에서 20 초, 72 °C에서 15 초.
         4단계: 72°C에서 2분 동안
         마지막으로 후속 실험이 시작될 때까지 4°C에서 유지합니다.
         참고: 2단계의 68°C와 3단계의 59°C는 정방향 및 역방향 프라이머의 용융 온도에 따라 달라지며, 프라이머 쌍에 따라 다릅니다. 2단계와 3단계에서 72°C에서의 시간은 PCR 산물의 길이와 DNA 중합효소의 속도에 의해 결정됩니다.
   2. 겔 전기영동(100V, 30분)을 통해 PCR 산물을 분리합니다. DNA 겔 추출 키트를 통해 아가로스 겔로부터 DNA 서열을 용출시킨다 ( 재료 표 참조).
      참고: 500nt보다 긴 단편에는 0.8% 아가로스 겔, 100nt에서 500nt 사이의 단편에는 1.5% 아가로스 겔, 100nt보다 짧은 단편에는 2% 아가로스 겔이 필요합니다.
   3. sgRNA/crRNA를 발현하는 TU를 암피실린 내성 유전자 및 효모 선택 가능한 영양요구성 마커 유전자-TRP1을 포함하는 pRSII404/424 셔틀 벡터¹⁹에 삽입합니다.
      1. 셔틀 벡터를 37°C에서 1시간 동안 두 개의 제한 효소 SacI 및 Acc65I로 분해합니다. 5 μg의 셔틀 벡터, 권장량의 효소, 소화 완충액(효소 지침에 따름) 및_ddH2O를 총 부피 30 μL까지 첨가하여 반응 혼합물을 준비한다.
      2. 겔 전기영동을 통해 셔틀 벡터 분해를 확인합니다(하위 단계 1.3.2 참조). 그런 다음 65°C에서 20분 동안 두 효소를 비활성화합니다.
      3. 깁슨 조립 방법²⁰ 을 사용하여 등몰 DNA 혼합물을 50°C에서 1시간 동안 넣어줌으로써 정제된 PCR 산물을 절단된 개방 셔틀 벡터 내로 삽입하였다.
      4. 열충격 변환법²¹을 통해 대장균 DH5α 컴피턴트 세포를 상기 깁슨 반응 혼합물로 형질전환시킨다. 형질전환된 대장균 세포를 암피실린(0.1g/L)이 포함된 Luria-Bertani(LB) 한천 플레이트에 옮깁니다. 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 넣고 세포가 밤새 자라도록 합니다.
      5. LB 한천 플레이트에서 4개의 콜로니를 선택하고 암피실린(0.1g/L)이 포함된 LB 용액에서 37°C에서 하룻밤 동안 별도로 배양합니다. 이어서, 미니 준비 절차를 사용하여 대장균 세포로부터 플라스미드를 추출한다²².
      6. 프라이머 ot18 및 ot19(올리고 서열에 대한 보충 표 2 참조)를 사용하여 Sanger 방법²³을 통해 삽입된 전사 단위를 시퀀싱하고 확인합니다.
         참고: 이후 실험에서 구성되고 확인된 플라스미드는 PEG/LiAc 프로토콜²⁴를 통해 효모 게놈에 삽입됩니다.

2. 스캐폴드 RNA 발현 카세트의 설계 및 구성

참고: 스캐폴드 가이드 RNA(scRNA)는 sgRNA 서열과 MS2 헤어핀 구조²⁵로 구성됩니다. 이 작업에는 야생형 MS2 헤어핀-wt 및 f6 MS2 코트 단백질(MCP) 압타머-f6의 두 종류의 MS2 헤어핀 구조가 사용됩니다.

1. 서로 다른 스페이서 서열(즉, pSNR52-스페이서_DR(SpCas9)-2×MS2(wt+f6)-SUP4t)을 수용할 수 있는 scRNA 템플릿을 합성합니다.
   참고: 이 연구에서 scRNA 템플릿은 유전자 합성 회사에 의해 합성되었습니다( 재료 표 참조).
2. 필요한 스페이서 서열에서 PCR을 실행하기 위해 적절한 프라이머( 보충 표 2 참조)를 설계합니다.
3. 1.3단계의 절차에 따라 scRNA 발현 카세트를 구성합니다.

3. dSpCas9 엔지니어링 및 발현 플라스미드 구축

1. 플라스미드 pTPGI_dSpCas9_VP64 얻습니다( 재료 표 참조).
2. 터치다운 PCR 및 Gibson 조립 방법을 통해 pRSII406 셔틀 벡터를 기반으로 수용체 벡터 pRSII406-pGPD-ATG-XbaI-XhoI-CYC1t를 구성합니다(1.3단계 참조). 플라스미드는 강력한 구성적 프로모터-pGPD 및 터미네이터-CYC1t를 제공합니다.
3. pTPGI_dCas9_VP64 플라스미드 및 새로 구축된 수용체 벡터(1시간 동안 5 μg 또는 하룻밤 동안 10 μg-단계(참조로 1.3.3.1 단계 참조)를 37°C에서 XbaI 및 XhoI로 분해한다. 단계 1.3.2에서와 같이 삽입 단편 및 수용체 벡터를 분리하고 정제한다.
4. 정제된 삽입물 단편 및 수용체 벡터를 T4 DNA 리가아제로 16°C에서 8시간 동안 라이게이트한다. 정제된 수용체 벡터 50-100ng, 수용체 벡터와 등몰량의 정제된 표적 단편, T4 완충액 1.5μL, T4 리가제 0.5μL 및_ddH2O를 총 부피 15μL까지 첨가하여 결찰 용액을 준비합니다.
5. 1.3.3.3 및 1.3.3.4단계를 따릅니다. 이어서, XbaI 및 Xhol(37°C, 1시간)로 소화하고 겔 전기영동(단계 1.3.2 참조)하여 새로 구축된 플라스미드가 올바른지 확인합니다.

4. dCas12a 엔지니어링 및 플라스미드 제작

1. dCas12a-AD를 발현하는 플라스미드를 구축합니다.
   1. BamHI 및 Xhol 제한 효소 부위 옆에 있는 두 개의 효모 코돈 최적화 dCas12a 단백질(denAsCas12a 및 dLbCas12a)을 합성합니다.
      참고: 이 연구에서, 두 개의 효모 코돈 최적화된 dCas12a 단백질은 유전자 합성 회사에 의해 합성되었다( 재료 표 참조).
   2. 수용체 벡터 pRSII406-promoter-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-AD-NLS-TAA-mTGUO1을 터치다운 PCR 및 Gibson 조립 방법(단계 1.3 참조)을 통해 구성하며, 여기서 "프로모터"는 pGPD 또는 pGAL1이고, "sp"는 짧은 무작위 서열을 나타내고, "AD"는 VPR 또는 VP64입니다.
   3. BamHI 및 XhoI를 사용한 소화와 T4 DNA 리가아제를 사용한 결찰을 통해 각 dCas12a 단백질을 새로 구성된 두 개의 수용체 벡터에 삽입합니다(3.3 및 3.4단계 참조).
2. 베어 dCas12a를 발현하는 플라스미드를 구축합니다.
   1. 터치다운 PCR 및 Gibson 조립 방법을 사용하여 pRSII406-Acc651-pGAL1-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t로 dCas12a의 갈락토오스 유도성 발현 카세트에 대한 수용체 벡터를 구성합니다(1.3단계 참조).
   2. dCas12a 단백질과 위의 수용체 벡터를 포함하는 플라스미드를 BamHI 및 Xhol로 분해한 다음 T4 DNA 리가아제로 결찰하여 플라스미드 pRSII406-pGAL1-Acc651-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t를 얻습니다(3.3단계 및 3.4단계 참조).
   3. 4.2.2 단계에서 얻은 플라스미드를 Acc65I 및 BamHI로 분해한 다음 터치다운 PCR 및 Gibson 조립 방법을 통해 pGAL1을 pGPD로 대체하여 pRSII406-pGPD-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t를 구성합니다.

5. Anti-CRISPR 단백질 공학 및 플라스미드 구성

참고: Acrs 발현을 유도하기 위해 3가지 종류의 프로모터가 사용되었습니다: 유도성 프로모터-pGAL1, 4개의 효모 구성 프로모터-pGPD, pACT1, pTEF1 및 pTEF2 및 합성 구성 프로모터-genCYC1t_pCYC1noTATA²⁶.

1. 유전자 합성 회사로부터 유형 II Acrs(AcrIIA2, AcrIIA4²⁷ 및 AcrIIA5²⁸) 및 유형 V-A Acrs(AcrVA1, AcrVA4 및 AcrVA5²⁹)의 서열을 포함하는 플라스미드를 얻습니다.
2. Acrs를 발현하기 위해 pRSII403 셔틀 벡터를 기반으로 플라스미드를 구성합니다.
   1. AcrIIA 발현 카세트를 구성합니다.
      참고: 터치다운 PCR을 사용하여 4가지 다른 프로모터(즉, pGPD, pACT1, pTEF2 및 genCYC1t_pCYC1noTATA), 3가지 AcrIIA 및 2가지 터미네이터(ADH1t 및 CYC1t)를 증폭합니다. Gibson 어셈블리 방법을 통해 다른 프로모터 아래에서 AcrIIA를 발현하는 일련의 TU를 구축합니다(1.3단계 참조).
   2. AcrVA 표현식 카세트를 생성합니다.
      1. 수용체 서열을 합성합니다: ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, 여기서 "sp"는 나중에 AcrVA로 대체될 무작위 서열입니다.
         참고: 이 연구에서, 수용체 서열은 유전자 합성 회사에 의해 합성되었다 (재료 표).
      2. 수용체 벡터 pRSII403-promoter-ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6을 조립하며, 여기서 "프로모터"는 pGAL1, pTEF1 및 genCYC1t_pCYC1noTATA입니다. Gibson 조립 방법을 사용합니다(1.3단계 참조).
      3. 5.2.2.2단계(터치다운 PCR 및 Gibson 조립 방법[단계 1.3 참조]를 통해 )에 설명된 수용체 벡터에 3개의 AcrVA 각각을 삽입하여 AcrVA를 생성하는 플라스미드 세트를 구축합니다.
3. GS 링커 및 HBD(hER)의 서열로 서열을 확장하여 AcrIIA4를 추가로 엔지니어링합니다. 이를 통해 β-에스트라디올 반응 회로를 구축할 수 있습니다.
   1. 터치다운 PCR을 사용하여 GS-HBD 및 AcrIIA4 부품을 별도로 얻습니다(1.3.1단계 참조).
   2. AcrIIA4, GS-HBD 및 셔틀 벡터를 Gibson 혼합물에 넣고 Gibson 방법을 통해 완전한 플라스미드를 구성합니다(1.3.3단계 참조).

6. crRNA 검출 : RT-qPCR 및 프라이머 설계

참고: crRNA 검출은 3단계로 구성된 RT-qPCR을 통해 달성되었습니다.

1. RNA 키트를 통해 효모 세포에서 RNA 추출 및 정제를 수행합니다.
   1. 효모 세포를 2 mL의 합성 규정된 완전 배지(SDC, 1 L 부피: 20 g의 글루코스, 2 g의 AA 믹스, 6.7 g의 YNB, 396 mg의 류신, 79.2 mg의 트립토판, 79.2 mg의 히스티딘, 및 79.2 mg의 우라실)에서 밤새 24-웰 플레이트 (240 rpm, 30°C)를 이용하였다.
   2. 아침에 세포 배양액(1:100)을 신선한 SDC 2mL로 희석하고 효모 세포를 30°C, 240rpm에서 4시간 더 계속 성장시킵니다.
   3. 전체 2mL의 세포 용액을 수확하고 20,238 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. 세포 펠릿이 작기 때문에 상층액을 조심스럽게 제거하십시오.
   4. RNA 키트를 사용하여 효모 세포에서 RNA를 추출합니다.
   5. RNA 품질을 확인하십시오.
      1. 1% 아가로스 겔을 준비한다. 각 RNA 샘플 5μL를 DNA 로딩 염료 1μL와 혼합합니다. 그런 다음 혼합물을 젤에 넣고 실행하십시오.
      2. 리보솜 RNA(25S/18S)에 해당하는 ~4,000nt 및 ~2,000nt의 두 개의 투명 밴드가 겔에 존재하는지 확인합니다. tRNA의 경우 ~80nt에서 더 흐릿한 띠를 볼 수 있습니다.
   6. RNA 샘플을 cDNA 합성에 즉시 사용하거나 향후 사용을 위해 -80°C에 보관하십시오.
2. 역전사: 스템-루프 방법³⁰ 을 사용하여 crRNA(40nt)에 해당하는 cDNA의 첫 번째 가닥을 형성합니다. sgRNA(거의 100nt)의 역전사의 경우, 절차는 참조 유전자 ACT1의 cDNA 합성과 동일합니다.
   참고: crRNA의 역전사 방법은 sgRNA 및 ACT1 mRNA와 함께 사용되는 방법과 다릅니다. crRNA가 매우 짧기 때문에, microRNA로 처리하고, 상응하는 cDNA를 얻기 위해 microRNA 역전사법(stem-loop approach)을 사용하였다. 2개의 cDNA 합성 키트(crRNA를 위한 줄기-루프 키트 및 ACT1 유전자를 위한 일반적인 역전사 키트)를 crRNA 정량에 사용하였다. 실험 결과를 비교할 수 있도록 두 키트( 재료 표 참조)에 동일한 양의 RNA를 사용했습니다. 스템-루프 키트와 함께 사용된 프라이머는 스템-루프 서열 및 crRNA의 3' 말단에 있는 마지막 6개의 뉴클레오티드에 따라 설계되었다(스템-루프 및 프라이머 서열에 대해서는 보충 표 2 참조).
   1. crRNA 역전사를 위한 스템-루프 분석법
      1. RNA 주형, 프라이머 및 완충액을 냉동실에서 꺼내 얼음에 녹입니다.
      2. 게놈 DNA 제거: 먼저 키트 지침에 따라 반응 혼합물 10μL를 준비합니다. 혼합물을 42°C에서 2분 동안 열 순환기에 넣습니다. 마지막으로 얼음 위에 옮깁니다.
      3. 제1 cDNA 가닥의 합성: 6.2.1.2 단계로부터의 혼합물 10 μL, 줄기-루프 프라이머 1 μL (2 μM 농도), 10x RT 반응 완충액 2 μL, 역전사 효소 혼합물 2 μL (역전사효소 함유), 및 RNase-free_H2O5 μL를 첨가하여 20 μL의 반응 혼합물을 준비한다.
      4. 반응 혼합물을 열 사이클러에 넣고 다음 프로그램을 실행합니다: 25°C에서 5분, 50°C에서 15분, 85°C에서 5분. qPCR 반응에 즉시 제품을 사용하거나 -80°C에서 보관하십시오.
   2. sgRNA 및 ACT1 mRNA 역전사
      1. 첫 번째 반응: 키트 지침에 따라 프라이머 믹스, dNTP 믹스, RNA 템플릿(50pg-5μg) 및 RNase가 없는 물(RNA 템플릿은 제외, 모두 키트에서 제공)으로 구성된 13μL 혼합물을 준비합니다. 1 μg의 RNA 주형을 사용하십시오. 혼합물을 70°C에서 10분 동안 열 순환기에 넣습니다.
      2. 두 번째 반응(cDNA 합성): 첫 번째 반응 용액 13 μL에 시약(키트 설명서에 설명된 대로)을 최종 부피 20 μL까지 첨가하여 반응 혼합물을 준비합니다. 혼합물을 50°C에서 15분 동안 열 순환기에 넣은 다음 85°C에서 추가로 5분 동안 놓습니다. qPCR 반응에 즉시 제품을 사용하거나 -80°C에서 보관하십시오.
3. qPCR용 SYBR 키트: Ct 값 검출
   참고: crRNA의 qPCR에 사용되는 역방향 프라이머는 줄기-루프 서열의 역상 보체에 해당하기 때문에 고정되어 있습니다( 보충 표 2 참조). 대조적으로, 정방향 프라이머는 가변적이며 crRNA의 서열에 따라 달라집니다. sgRNA 및 ACT1 mRNA qPCR에 대한 정방향 및 역방향 프라이머는 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 에서 설계되었습니다. 이들의 용융 온도 사이의 차이가 2°C 이하일 때 2개의 프라이머가 선택된다( 보충 표 2 참조). 각 샘플은 3번의 반복실험으로 측정됩니다.
   1. SYBR 키트에 대한 제조업체의 지침에 따라 qPCR 반응 혼합물을 준비합니다.
   2. Real-Time PCR 기계에서 다음 qPCR 프로그램을 설정합니다.
      사전 배양: 95°C에서 10분.
      PCR 단계: 95°C에서 15초, 이어서 55°C에서 34초. PCR 단계의주기를 45 번으로 설정하십시오. 용융 단계: 95°C에서 10초, 65°C에서 60초, 마지막으로 97°C에서 1초.
   3. Pfaffl 식³¹을 통해 상대적인 mRNA 발현 값을 계산한다.

7. Cas 단백질 검출을 위한 면역형광

참고: Cas 단백질(CasP)은 His_tag에 융합됩니다.

1. 효모 세포 준비
   1. 멸균 루프를 사용하여 일부 효모 세포를 선택하고 30°C에서 240rpm으로 밤새 YPD가 풍부한 배지 5mL에서 배양합니다. 아침에 500 μL의 세포 용액을 20 mL의 신선한 YPD에 첨가하고 OD₆₀₀ 이 0.6에 도달 할 때까지 30 °C에서 240 rpm으로 성장시킨다.
   2. 배양액 5mL를 취하여 37% 포름알데히드 500μL와 혼합합니다. 혼합물을 실온(RT)에서 10분 동안 그대로 두십시오. 1,500 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다.
   3. 상층액을 제거하고 1 mL의 고정 완충액(0.1 M_KH2PO4, 0.5 M _MgCl2, 3.7% 포름알데히드, pH = 6.5)으로 세포를 재현탁시켰다. 세포 용액을 실온에서 20분 동안 유지합니다.
   4. 세포 용액을 1,500 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 4μL의 베타-메르캅토에탄올과 4μL의 용해물 용액(5mg/mL)이 보충된 1mL의 세척 완충액(0.1M KH_2PO4,_1.2M소르비톨, pH = 6.5)에 세포를 재현탁합니다. 세포 용액을 37°C에서 20분 동안 인큐베이터에 넣습니다.
   5. 세포 용액을 1,500 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 세포 펠릿을 원심분리에 의해 1mL의 PBS로 2회 세척한다(5분 동안 1,500 x g ).
   6. 100μL의 PBS와 0.05% 트윈 20에 세포를 재현탁하고 4μL의 BSA 용액(10mg/mL)을 추가합니다. 세포 용액을 실온에서 20분 동안 유지합니다.
2. 1차 항체를 사용한 배양
   1. 단계 7.1.6에서 혼합물에 항-His 태그 1차 항체를 1:400 희석으로 첨가한다. 용액을 RT에서 2시간 동안 유지합니다.
   2. 단계 7.2.1의 혼합물을 1,500 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 제거한다. PBST 1mL와 원심분리기(1,500 x g)를 5분 동안 첨가하여 세포 펠릿을 세척합니다. 이 작업을 두 번 반복합니다. 마지막으로, 상층액을 버리고 1x PBST의 100 μL에 세포를 현탁시킨다.
3. 현미경 세포 검출
   1. 슬라이드에 셀을 장착합니다. 7.2.2 단계에서 세포 용액 2 μL를 취하여 유리 슬라이드에 놓습니다. 커버슬립으로 덮으십시오.
   2. 형광 현미경으로 세포를 관찰합니다. 형광등, 현미경 및 컴퓨터를 켭니다. 형광등 번호를 기록하고 컴퓨터에서 현미경 소프트웨어를 엽니다.
   3. 슬라이드를 현미경 무대에 올려 놓습니다. 40x 대물 렌즈를 선택하고 녹색 빛(550nm) 아래에서 세포를 관찰합니다. 효모 세포의 윤곽이 나타날 때까지 거친 초점 손잡이를 움직입니다. 미세 초점 노브를 움직여 셀에 초점을 맞춥니다.
   4. 현미경 소프트웨어로 세포를 검출합니다. 현미경 시야를 닫습니다 view 컴퓨터 화면으로 전환합니다. 라이브를 클릭하고 3-5초 동안 기다린 다음 캡처 를 클릭하여 사진을 찍습니다. 사진을 저장합니다.
   5. 컴퓨터, 현미경 및 형광등을 끕니다.

8. 데이터 수집: FACS

참고: 녹색 형광은 유세포 분석(즉, 형광 활성화 세포 분류[FACS] 측정)을 통해 검출됩니다. 효모 세포는 일반적으로 30°C 및 240 rpm에서 배양하여 FACS 실험을 실행한다. 그러나 세포는 유전적 내용에 따라 몇 가지 예방 조치가 필요할 수 있습니다. dCas12a-VPR 유전자( GPD 구성 프로모터에 의해 제어됨)를 포함하는 세포는 SDC 용액에서 24시간 동안 성장해야 합니다. 그 후, 세포를 신선한 SDC에서 1:100의 비율로 희석하고 형광 강도를 측정하기 전에 12시간 더 성장시킵니다. AcrIIA4-HBD(hER) 유전자로 변형된 세포도 희석이 필요합니다. 또한 OD₆₀₀ 을 제어해야 합니다. 첫째, 세포는 하룻밤 동안(14시간 이상) SDC에서 성장하도록 합니다. 아침에는 OD₆₀₀ 이 측정됩니다. 그런 다음 배양 물을 SDC로 희석하여 다양한 농도의 β- 에스트라 디올을 OD₆₀₀ = 0.1까지 공급합니다. FACS 실험 전에, 세포는 OD₆₀₀ 이 0.8-1.0에 도달하도록 또 다른 7 시간 동안 성장한다. dCas9-VP64 또는 dCas12a-VP64를 발현하는 세포는 FACS 기계에서 측정하기 전에 희석 및 추가 성장 없이 20-24시간 동안 SDC에서 성장합니다.

1. 레이저를 예열하기 위해 측정 20분 전에 FACS 기계를 켭니다.
2. 20 μL의 세포 배양물을 300 μL의_ddH2O와 혼합하여 샘플을 준비(희석)한다.
3. FACS 컴퓨터에 연결된 컴퓨터에서 FACS 소프트웨어를 실행하고 새 실험을 만듭니다. 측정 매개변수(예: FSC(SSC)-A/H/W 및 히스토그램)를 설정합니다.
4. 샘플의 여기 및 방출 파장에 따라 필터를 선택합니다. 예를 들어, 여기서 표적 단백질은 여기 및 방출 파장이 각각 488nm 및 507nm인 yEGFP입니다. 따라서 FITC 또는 GFP 필터(여기 파장: 488nm, 방출 파장: 527/32nm)를 선택합니다. 획득 셀 번호를 10,000으로 설정합니다.
5. 형광 비드의 강도를 측정하여 FITC 필터 전압을 조정합니다. 두 개의 연속적인 실험 사이의 비드 강도의 상대적 차이가 5%를 초과하지 않는지 확인하십시오.
6. ddH₂O로 기계를 몇 초 동안 세척하여 가능한 여분의 비드를 제거합니다.
7. 샘플 형광 강도를 측정합니다. 미리보기 를 클릭하고 시료 주입 안정성을 위해 3-5초 동안 기다립니다. 마지막으로 Acquire를 클릭합니다.
8. 실험이 끝나면 비드를 다시 측정합니다. 전압은 초기 비드 측정 중에 사용된 전압입니다(8.4단계, 438-441V 참조). 두 구슬 측정값의 상대적 차이가 5%를 초과하는지 확인하십시오.
9. FACS 데이터를 FCS 파일로 내보냅니다.
10. R Studio 소프트웨어로 FCS 파일을 분석합니다.

9. 데이터 분석

알림: R 스튜디오 내에서 Flowcore R Bioconductor 패키지³² 를 사용하십시오. FCS 파일은 R 언어로 작성된 스크립트를 사용하여 분석되었습니다.

1. R Studio를 열고 Bdverse 분석 스크립트를 로드합니다. R 을 사용하여 FCS 파일을 분석합니다.
2. 실험 이름(ename), FCS 파일이 있는 디렉터리(경로)를 설정합니다
   저장됨(dir_d) 및 결과 파일이 생성될 위치(dir_r).
3. 형광 채널을 설정합니다. 예를 들어, 녹색 형광이 측정된 경우 select_ch = "GPA-A"입니다.
4. 측정된 샘플 수(s_num)를 설정합니다.
5. 각 점도표(sxlim, sylim)의 차원을 설정합니다. 막대 플롯과 상자 플롯에 대한 x축과 y축의 최대 길이(xlimit, ylimit)를 설정합니다. xlimit는 s_num보다 크거나 같아야 합니다.
6. 해당 줄에서 # 을 제거하여 게이팅 방법을 선택합니다.
   참고 : morphGate는 스크립트에 의해 수행되는 자동 게이팅 방법입니다 (즉, 셀이 더 조밀 한 도트 플롯 영역이 프로그램에 의해 인식되고 선택됩니다). polygonGate 및 rectangleGate는 도트 플롯을 보고 다각형의 꼭짓점 또는 대부분의 셀이 있는 영역을 포함하는 사각형의 측면을 정의해야 합니다.
7. 선택한 게이팅 방법에 해당하는 flowSet 객체 gated를 선택합니다. 도트 플롯 해상도(해상도, 최소 256 이상이어야 함)를 선택합니다.
8. flt_low <- filter_low(sp)의 주석 처리를 제거하여 형광이 음수인 측정값을 제거합니다. flt_sp <- filter(flt_lw)의 주석 처리를 제거하여 다른 실험으로 인한 이상값을 제거합니다.
9. Source(소스)를 누르고 스크립트를 실행합니다. 분석 결과가 포함된 모든 파일이 dir_r로 작성됩니다.

결과

RNA 중합효소 III형 프로모터에 의한 sgRNA/crRNA 발현
먼저, 이 작업은 그림 1A에 표시된 전사 활성화 회로(회로 1)의 엔지니어링을 다루었습니다. 그것은 세 가지 기본 구성 요소를 포함했다 : 1) yEGFP (리포터)를 암호화하는 유전자, dCas9 / dCas12a-AD에 대한 표적 부위를 제공하는 일련의 다른 합성 프로모터가 선행되었다. 2) 활성화 도메인 (각각 VP64 및 VPR)에 융합되고 하나 또는 두 개의 핵 국소화 서열 (NLS)을 함유하는 dCas9 또는 dCas12a의 효모 코돈 최적화 버전. 두 dCas 단백질 모두 강력한 구성 프로모터-pGPD에 의해 생성되었습니다. 및 3) dCas9/dCas12a-AD를 표적 부위로 유도하는 sgRNA/crRNA 서열. dCas9/dCas12a 기반 활성제의 활성화 효율을 리포터의 형광 강도(FACS 실험을 통해 측정)에 의해 시각화하고 반영했습니다...

토론

이 프로토콜은 "DBTL(Design-Build-Test-Learn)" 생물 공학 주기에 따라 건식 실험실 및 습식 실험실 실험 모두에 대해 합성 유전자 디지털 회로에 대한 완전한 워크플로를 보여주었습니다. 여기서는 S. cerevisiae 의 작은 전사 네트워크를 설계하고 구축하여 CRISPR-Cas 시스템, 주로 dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a 및 해당 항-CRISPR 단백질에 초점을 맞췄습니다. 그들 중 일부는 디지털 회로의 기본 구성 요소인 부울 게이트를 모방했습니다. 여기에 설명된 모든 회로를 통해 S. cerevisiae에서 CRISPR 관련 및 항-CRISPR 단백질의 특성과 특징을 묘사할 수 있었습니다. 이러한 결과는 유전자 디지털 회로의 계획에 이러한 단백질을 포함시키는 데 필수적입니다.

DBTL 개념은 합성 생물학의 프레임워크를 제공하는 반면, 새로운 아티팩트를 테스트한 후 많은 최적화와 개선이 이루어져야...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.1 mL PCR 8-스트립 튜브	NEST	403112
0.2 mL PCR 튜브	Axygen	PCR-02-C
1.5 mL 마이크로튜브	Axygen	MCT-150-C
15 mL 원심분리기 튜브	BIOFIL	CFT011150
2 mL 마이크로튜브	Axygen	MCT-200-C
50 mL 원심분리기 튜브	BIOFIL	CFT011500
아가로스-분자 생물학 등급	Invitrogen	75510-019
암피실린 나트륨 염	Solarbio	69-52-3
Applied biosystems veriti 96-well thermal cycler	Thermo Fisher Scientific	4375786
AxyPrep DNA 젤 추출 키트 Axygen		AP-GX-250
BD FACSuite CS& 앰프; T 연구 구슬	BD	650621	형광 구슬
BD FACS전기 유세포 분석기			BD-Centrifuge
	Eppendorf	5424
Centrifuge Sorvall ST 16R	Thermo Fisher Scientific	75004380
E. coli competent cells (Strain DH5α)	Life Technologies	18263-012
ECL 선택 웨스턴 블로팅 검출 시약	GE 헬스케어	RPN2235
전기영동 장치	Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd	JY300C
플랫 8-스트립 캡	NEST	406012
유전자 합성 회사	Azenta Life Sciences		https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences
염소 안티 마우스 IgG (H+L) 교차 흡착 2차 항체 Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11004
HiFiScript cDNA 합성 키트	CWBIO	CW2569M	6.2.2.1단계에서 사용
용액(Zymolyase)	zymoresearch	E1004-A
Nikon Eclipse 80i 형광 현미경	Nikon	-	형광 현미경
Pipet 팁— 10 &뮤; L	Axygen	T-300-R-S
피펫 팁— 1000 &뮤; L	Axygen	T-1000-B-R-S
피펫 팁— 200 &뮤; L	Axygen	T-200-Y-R-S
pRSII403	Addgene	35436
pRSII404	Addgene	35438
pRSII405	Addgene	35440
pRSII406	Addgene	35442
pRSII424	Addgene	35466
pTPGI_dSpCas9_VP64	Addgene	49013
Q5 High-fidelity DNApolymerase	New England Biolabs	M0491
제한 효소-Acc65I	New England Biolabs	R0599
제한 효소-BamHI	New England Biolabs	R0136
제한 효소-SacI-HF	New England Biolabs	R3156
제한 효소-XhoI	New England Biolabs	R0146
Roche LightCycler 96		Roche-Real-Time PCR 기기
S. cerevisiae CEN. PK2-1C	-	-	부모 변형률. 유전자형은 다음과 같습니다 : MATa; 그의3D1; 레우2-3_112; 우라3-52; TRP1-289; MAL2-8C; SUC2
스템 루프 키트	SparkJade	AG0502	6.2.1.3
T100 Thermal Cycler	BIO-RAD	186-1096
T4 DNA 리가제	New England Biolabs	M0202
T5 Exonuclease	New England Biolabs	M0363
Taq DNA 리가제	New England Biolabs	M0208
Taq DNA 중합효소	New England Biolabs	M0495
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye)	Takara	RR820Q
YeaStar RNA kit	Zymo Research	R1002
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E8875