까다로운 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위한 시간 효율적인 도구로서 박테리아 세포의 공동 발현과 결합된 풀다운 분석

기존의 풀다운은 단백질-단백질 상호작용을 연구하는 데 널리 사용된다¹. 그러나, 정제된 단백질은 종종 시험관 내에서 효과적으로 상호작용하지 않으며^2,3, 이들 중 일부는 그들의 결합 파트너 없이는 불용성이다 ^4,5. 이러한 단백질은 공동 번역 조립 또는 분자 샤페론 5,6,7,8,9의 존재를 필요로 할 수 있습니다. 종래의 풀다운의 또 다른 한계는 많은 도메인이 배양 시간 동안 시험관 내에서 해리 및 재결합할 수 없기 때문에, 이들 중 다수가 동시번역적으로 조립된 안정한 호모올리고머로서 존재할 수 있는 도메인 간의 가능한 헤테로멀티머화 활성을 시험하는 것이다 ^8,10. 동시발현은 이러한 문제를 극복하는데 유용한 것으로 밝혀졌다 ^3,11. 박테리아에서 호환 가능한 벡터를 사용한 공동 발현은 폴리콤 억제 복합체 PRC2¹², RNA 중합효소 II 중재자 헤드 모듈¹³, 박테리오파지 T4 베이스플레이트 14, SAGA 복합체 데비퀴티닐라제 모듈 15,16 및 페리틴 ¹⁷을 포함하는 대형 다중 서브유닛 거대분자 복합체를 정제하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 공동-발현에 통상적으로 사용되는 복제 기원은 ColE1, p15A18, CloDF13¹⁹ 및 RSF²⁰이다. 상업적으로 이용 가능한 Duet 발현 시스템에서, 이들 기원은 상이한 항생제 내성 유전자 및 편리한 다중 클로닝 부위와 결합되어 폴리시스트로닉 벡터를 생성하여, 최대 8개의 단백질의 발현을 허용한다. 이들 기원은 상이한 복제 수를 가지며, 표적 단백질의 균형 잡힌 발현 수준을 달성하기 위해 다양한 조합으로 사용될 수 있다²¹. 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위해 다양한 친화성 태그가 사용됩니다. 가장 흔한 것은 6x히스티딘, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 및 맥아당 결합 단백질(MBP)이며, 각각은 해당 수지에 특이적인 친화력을 가지고 있습니다. GST와 MBP는 또한 태그가 부착된 단백질의 용해도와 안정성을 향상시킨다²².

진핵 세포에서 단백질 공동 발현과 관련된 여러 방법도 개발되었으며, 그 중 가장 두드러진 것은 효모 2-하이브리드 분석(Y2H)²³입니다. Y2H 분석은 저렴하고 쉬우며 여러 상호 작용을 테스트할 수 있습니다. 그러나 워크플로를 완료하는 데 1주일 이상 걸립니다. 또한 형광 2-하이브리드 분석(F2H)²⁴ 및 세포 어레이 단백질-단백질 상호작용 분석(CAPPIA)²⁵과 같이 덜 자주 사용되는 포유류 세포 기반 분석법도 있습니다. F2H 분석은 비교적 빠르기 때문에 본래의 세포 환경에서 단백질 상호작용을 관찰할 수 있지만 고가의 이미징 장비를 사용해야 합니다. 이들 모든 방법은 천연 진핵생물 번역 및 접힘 환경을 제공하는 원핵생물 발현에 비해 이점을 갖는다; 그러나 그들은 전사 활성화 또는 형광 에너지 전달에 의해 간접적으로 상호 작용을 감지하며, 이는 종종 인공물을 생성합니다. 또한, 진핵 세포는 관심 단백질의 다른 상호작용 파트너를 포함할 수 있으며, 이는 고등 진핵생물의 단백질 간의 이진 상호작용 테스트를 방해할 수 있습니다.

본 연구는 기존의 풀다운 기술에 이어 차등적으로 태그된 단백질의 박테리아 공동 발현 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 공동 발현이 필요한 표적 단백질 간의 상호 작용을 연구 할 수 있습니다. 기존 풀다운에 비해 시간 효율성이 높아 여러 대상의 배치 테스트가 가능하므로 대부분의 경우 유리합니다. 호환 가능한 벡터를 사용한 공동-발현은 힘든 클로닝 단계를 필요로 하지 않기 때문에 폴리시스트로닉 공동-발현보다 더 편리하다.

Method Workflow의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 대장균의 공동 형질전환

1. 표준 클로닝 방법을 사용하여 표적 단백질에 대한 발현 벡터를 준비합니다.
   참고: 일반적으로 좋은 출발점은 GST/MBP 태그 단백질의 발현을 위해 암피실린 내성 유전자 및 ColE1 기원을 갖는 기존의 pGEX/pMAL 벡터와 p15A 또는 RSF 기원 및 카나마이신 내성을 갖는 호환 가능한 벡터를 사용하여 6xHis 태그 단백질을 발현하는 것이며, 경우에 따라 용해도를 증가시키기 위해 티오레독신 또는 SUMO-태그와 결합합니다. 일반적으로 실험 전에 여러 태그 조합을 테스트해야 합니다. 설명된 방법 자체는 표적 단백질의 발현 조건을 일괄 테스트하는 데 편리합니다. 대부분의 로제타 균주는 희귀 코돈에 대한 tRNA를 발현하기 위한 p15A 기원을 가진 플라스미드를 이미 함유하고 있으므로, 이러한 균주를 사용하는 것이 가능한 옵션인 경우, p15A 플라스미드는 피해야 한다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
   1. 37°C의 Luria-Bertani(LB) 배지에서 적절한 균주의 박테리아를 0.1-0.2의 광학 밀도(OD)로 성장시킵니다. BL21(DE3) 균주를 본 연구의 예로 사용하였다.
      참고: 두 벡터로 효율적인 공동 형질을 달성하기 위해 새로 준비된 유능한 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 두 개 이상의 벡터를 공동 변환해야 하는 경우 순차적으로 변환하는 것이 좋은 변환 효율성을 달성하는 것이 좋습니다. Electroporation은 좋은 대안입니다.
   2. 박테리아 현탁액 중 1.0 mL를 4°C에서 9,000 x g 에서 1분 동안 원심분리하고, 상청액을 버린다.
   3. 0.5mL의 빙냉 완충액 형질전환 완충액(TB)(10mM MOPS[pH 6.7], 250mM KCl, 55mM_MnCl2 및 15mM_CaCl2)을 추가하고 얼음 상에서 10분 동안 인큐베이션합니다.
   4. 4°C에서 8,000 x g 에서 30초 동안 원심분리하고, 상층액을 버린다.
   5. TB 버퍼 100μL를 추가하고 각 벡터 100ng을 추가한 후 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 단일 벡터를 개별적으로 변환하여 공동 발현 없이 단백질 거동을 연구합니다. 또한 비특이적 바인딩 제어를 위해 빈 공동 발현 벡터와 쌍을 이루는 발현 벡터를 공동 변환합니다.
      참고: 이 연구에서 제공된 예에서, GST/MBP cDNA에 융합된 상응하는 cDNA를 갖는 pGEX/pMAL 벡터는 티오레독신 cDNA에 융합된 파트너 단백질 도메인을 인코딩하는 cDNA를 함유하는 호환 가능한 pACYC 유래 벡터와 함께 사용되었다.
   6. 42°C에서 150초 동안 가열한 다음 얼음에서 1분 동안 식힙니다.
   7. 항생제 없이 액체 LB 배지 1mL를 넣고 37°C에서 90분 동안 배양합니다. 0.5% 포도당과 해당 항생제(일반적인 농도는 50mg/L 암피실린, 20mg/L 카나마이신, 50mg/L 스트렙토마이신, 35mg/L 클로람페니콜)를 함유한 LB-한천 플레이트의 플레이트. 플레이트를 37°C에서 밤새 인큐베이션한다.

2. 표현

1. 2mL의 액체 LB 배지를 사용하여 플레이트에서 세포를 해당 항생제가 있는 50mL의 LB 배지로 플러시합니다(일반적인 농도는 50mg/L 암피실린, 20mg/L 카나마이신, 50mg/L 스트렙토마이신, 35mg/L 클로람페니콜). 금속 이온 또는 다른 공지된 보조인자를 첨가한다(본 연구에서 제공된 실시예에서, 0.2 mM ZnCl2가 매질에 첨가되었다). 실험의 후속 반복을 위해 -70°C에서 20% 글리세롤이 포함된 분취액을 보관합니다.
   참고: 두 플라스미드 사이의 간헐적인 재조합 사건으로 인해 분리된 단일 클론에서 불량 발현 가능성을 배제하기 위해 플레이트에서 직접 여러 콜로니를 플러시하는 것이 좋습니다.
2. 37°C에서 220rpm의 일정한 회전으로 세포를 0.5-0.7의 OD로 성장시키고, 실온(RT)으로 냉각하고, 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 1mM에 첨가합니다. 20 μL의 분취액을 비유도 샘플의 대조군으로 보관한다.
3. 세포를 하룻밤 동안 18°C에서 220rpm의 일정한 회전으로 배양합니다.
   참고: 최적의 배양 시간과 온도는 다를 수 있습니다. 하룻밤 동안 18°C는 대부분의 단백질에 가장 효과적이며 기본적으로 시도하는 것이 좋습니다. 강한 비특이적 결합이 관찰되는 경우 배양 시간을 2-3 시간으로 줄이십시오.
4. 박테리아 현탁액을 두 부분으로 나누고(또는 두 개 이상의 다른 태그를 사용한 경우 그 이상) 단백질 발현을 확인하기 위해 세포 현탁액의 20μL 분취량을 보관합니다. 4,000 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다.
   알림: 일시 중지 지점: 박테리아 펠릿은 -70 °C에서 최소 6개월 동안 보관할 수 있습니다.

3. 풀다운 분석

참고: 자세한 절차는 6xHis 또는 MBP/GST로 태그된 단백질에 대해 설명되어 있습니다. 모든 절차는 4°C에서 수행됩니다.

1. 실험 직전에 첨가된 프로테아제 억제제 및 환원제(아래 참조)가 있는 얼음처럼 차가운 용해 완충액 1mL에 박테리아 펠릿을 재현탁합니다. 디티오트레이톨(DTT)은 금속 이온을 제거하므로 금속 킬레이트 수지를 사용할 때 피하십시오. 테스트된 단백질에 대한 완충액 조성을 조정합니다. 대부분의 단백질에 적합한 용해 완충액의 일반적인 레시피는 다음과 같습니다.
   1. 6xHis-pulldown: 30mM HEPES(pH 7.5), 400mM NaCl, 10mM 이미다졸, 0.1% NP40, 10%[w/w] 글리세롤, 5mM 베타-메르캅토에탄올, 1mM 페닐메틸스풀포닐플루오라이드(PMSF) 및 프로테아제 억제제 칵테일의 1:1,000 희석( 재료 표 참조).
   2. GST- 또는 MBP-풀다운: 20 mM 트리스 (25 °C에서 pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0.1 mM_ZnCl2, 0.1% NP40, 10% [w/w] 글리세롤, 5 mM DTT, 1 mM PMSF 및 프로테아제 억제제 칵테일의 1:1,000 희석을 혼합한다(재료 표 참조).
2. 얼음에 초음파 처리하여 세포를 파괴하십시오. 전기영동을 위해 20 μl 분취량을 보관한다.
   알림: 일반적으로 20W 출력 전력으로 5초 간격으로 5초의 25-20펄스가 필요합니다.amp르. 과열을 방지하고 전체 세포 중단을 보장하기 위해 각 기기에 대해 적절한 초음파 처리 전력을 조정해야 합니다. 더 나은 성능을 얻으려면 고처리량 멀티 팁 초음파 처리기 프로브를 사용하는 것이 좋습니다.
3. 20,000 x g 에서 30분 동안 원심분리기 후속 SDS-PAGE 분석을 위해 정제된 용해물 20μL를 수집합니다.
4. 수지(각 샘플당 50μL)를 1mL의 얼음처럼 차가운 용해 완충액으로 10분 동안 평형을 이루고 2,000 x g 에서 30초 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
5. 세포 용해물(총 단백질 농도: 20-50mg/mL)을 수지에 넣고 15rpm의 일정한 회전으로 10분 동안 배양하고 2,000 x g 에서 30초 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다. 후속 SDS-PAGE 분석을 위해 결합되지 않은 분획 20μL를 수집합니다.
6. 얼음처럼 차가운 세척 버퍼 1mL를 넣고 1분 동안 배양합니다. 2,000 x g 에서 30초 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 세척 버퍼의 일반적인 레시피는 다음과 같습니다.
   1. 6xHis-pulldown: 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 30 mM 이미다졸, 0.1% NP40, 10% [w/w] 글리세롤 및 5 mM 베타-메르캅토에탄올을 혼합합니다.
   2. GST- 또는 MBP-풀다운: 20 mM 트리스 (25 °C에서 pH 7.5), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0.1 mM ZnCl₂, 0.1 % NP40, 10 % [w / w] 글리세롤 및 5 mM DTT를 혼합하십시오.
7. 두 번의 긴 세척을 수행하십시오 : 1mL의 얼음 차가운 세척 버퍼를 추가하고, 15rpm의 일정한 회전으로 10-30 분 동안 배양하고, 2,000 x g 에서 30 초 동안 원심 분리하고, 상청액을 버립니다.
8. 1mL의 얼음 차가운 세척 완충액을 넣고 1분 동안 배양하고 2,000 x g 에서 30초 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
9. 결합된 단백질을 50μL의 용출 완충액으로 1,200rpm의 진탕기에서 10분 동안 용출합니다. 용출 완충액의 일반적인 방법은 다음과 같습니다.
   1. 6xHis-풀다운: 30mM HEPES(pH 7.5), 400mM NaCl, 300mM 이미다졸 및 5mM 베타-메르캅토에탄올을 혼합합니다.
   2. GST-풀다운: 20mM 트리스(25°C에서 pH 7.5), 150mM NaCl, 50mM 글루타티온(염기성 트리스로 pH 7.5로 조정) 및 5mM DTT.
   3. MBP-풀다운: 20 mM 트리스(25 °C에서 pH 7.5), 150 mM NaCl, 40 mM 말토오스 및 5 mM DTT를 혼합합니다.
10. 용출된 단백질을 SDS-PAGE로 분석합니다.
    참고: 아크릴아미드의 비율은 단백질의 크기에 맞게 조정해야 합니다. 본 연구에서 제공된 예에서, 180V의 정전압에서 트리스-글리신-SDS 완충액(2mM 트리스, 250mM 글리신, 0.1% SDS)에서 실행되는 12% 아크릴아미드 겔을 사용하였다. 겔은 0.2% 쿠마시 블루 R250, 10% 아세트산, 및 30% 이소프로판올에서 비등시킴으로써 염색하고, 10% 아세트산에서 비등시킴으로써 탈염색하였다. 로딩된 단백질의 양은 동일하지 않아야 하는데, 이는 다양한 양의 상호작용 단백질이 다른 실험에서 추출될 수 있기 때문입니다.

설명된 방법은 많은 다른 대상과 함께 일상적으로 사용되었습니다. 여기에 제시된 것은 기존의 풀다운 기술로는 얻을 수 없는 몇 가지 대표적인 결과입니다. 첫 번째는 특정 ZAD(Zinc-finger-associated domain) 이량체화에 대한 연구이다11. ZAD는 안정적이고 특이적인 이량체를 형성하며, 이종이량체는 paralogous 그룹 내에서 밀접하게 관련된 도메인 사이에서만 가능합니다. 이 도메인에 의해 형성된 이량체는 안정적이며 적어도 며칠 동안 해리되지 않습니다. 따라서, 정제된 ZAD를 혼합하는 것은 어떠한 검출가능한 결합도 생성하지 않는다. 동시에, MBP와 티오레독신-6xHis-융합된 ZAD의 공동 발현은 MBP-풀다운 분석의 SDS-PAGE 결과에서 추가 밴드로 나타나는 양호하고 재현 가능한 호모-이량체화 활성을 보여줍니다(그림 2A). 헤테로다이머의 작은 부분은 다른 도메인과 함께 발현되는 M1BP와 함께 볼 수 있습니다. 이 상호 작용은 Y2A에서 확인되지 않았으며 이러한 도메인은 시스테인이 풍부하고 응집되기 쉽기 때문에 높은 단백질 농도로 인한 비특이적 연관성의 결과일 가능성이 큽니다. 특히, 이 경우 ZAD는 금속 킬레이트 수지에 비특이적으로 결합하는 금속 배위 영역이기 때문에 6xHis-풀다운은 부적절합니다. 이러한 활동은 병렬 실험에서주의 깊게 검토해야합니다.

또 다른 예는 ENY2 단백질과 그의 결합 파트너 Sgf11 (1-83aa) 및 CTCF 단백질26의 징크-핑거 도메인 (460-631 aa) 사이의 경쟁 분석이다. 단독으로 발현될 때 ENY2 단백질은 천연 결합 파트너와 상호 작용하는 것을 방지하는 이량체를 형성합니다. 아마도 Sgf11과 CTCF 단백질은 모두 ENY2의 동일한 분자 표면에 결합하여 상호 작용을 상호 배타적으로 만듭니다. 동시 발현 분석에서 6xHis 태그 ENY2는 GST 태그 Sgf11 및 MBP-CTCF 모두와 상호 작용했지만 MBP 풀다운에는 GST-Sgf11이 존재하지 않았으며 그 반대의 경우도 마찬가지였습니다(그림 2B). 이러한 결과는 삼중 복합체가 형성될 수 없으며 상호 작용이 상호 배타적임을 시사합니다. 이러한 데이터는 다른 분석법으로 독립적으로 확인되었으며 이러한 복합체에서 ENY2의 다양한 기능적 역할을 지원합니다. 큰 친화력 태그는 그 자체로 입체 장애를 가하여 복잡한 형성을 방지할 수 있다는 사실에 주의해야 합니다. 따라서 결론은 공동 발현 데이터에만 근거해서는 안 됩니다.

기존 및 결합된 동시 발현 풀다운의 워크플로우에 대한 단계별 비교는 그림 3A에 나와 있습니다. Co-expression coupled pulldown은 적은 수의 샘플에서도 최소 2배 더 시간 효율적이며 우수한 확장성을 제공합니다. CP190 단백질(1-126aa)의 BTB 도메인과 초파리 CTCF 단백질(dCTCF)의 GST 태그가 부착된 C-말단 도메인(610-818aa) 사이의 동일한 상호작용을 연구하기 위해 두 기술을 모두 활용한 결과가 그림 3B에 나와 있습니다. 두 방법 모두 우수한 효율성과 재현성을 보여줍니다(분석은 3회 반복에서 수행됨). 이 경우, 동시-발현 결합 풀다운은 GST 단백질 단독을 사용한 대조군 샘플에서 볼 수 있는 바와 같이 더 낮은 비특이적 결합을 나타내었다.

그림 1: 프로토콜의 회로도. 회로도는 이 연구에 사용된 방법 워크플로를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 대표적인 결과 . (A) MBP 및 6xHis-풀다운 분석에서 징크-핑거 관련 도메인(ZAD) 동종이량체화에 대한 연구. MBP(40kDa) 또는 6xHis-티오레독신(20kDa)과 융합된 ZAD는 박테리아 세포에서 동시 발현되었으며 아밀로스 수지(MBP 태그 단백질 결합) 또는 Ni-NTA 수지(6xHis 태그 단백질 결합)로 친화성 정제되었습니다. 공동-정제된 단백질은 SDS-PAGE에 이어 쿠마시 염색으로 시각화하였다. MBP-풀다운 결과는 상부 패널에, 6xHis-풀다운 결과는 하부 패널에 표시됩니다(많은 ZAD가 Ni-NTA에 비특이적으로 결합하기 때문에 단백질 발현 제어로만 사용됨). (B) ENY2와 Sgf11/CTCF 단백질 사이의 상호 배타적인 상호작용에 대한 연구. GST-태깅된 Sgf11(1-81aa), MBP-태깅된 CTCF 징크-핑거 도메인(460-631aa) 및 6xHis-태깅된 ENY2 단백질은 다양한 조합으로 동시 발현되었고, 아밀로오스 레진, 글루타티온 레진(GST-태깅된 단백질에 결합), 또는 Ni-NTA 레진으로 친화도 정제되었다. 공동-정제된 단백질은 SDS-PAGE에 이어 쿠마시 염색으로 시각화하였다. 패널 A와 B의 그림은 Bonchuk et al.11 및 Bonchuk et al.26의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 기존 및 결합된 공동 발현 풀다운 분석의 워크플로 비교. (A) 동시 발현과 결합된 풀다운과 비교하여 기존 풀다운 분석의 워크플로에서 필요한 시간 간격의 단계별 비교. (B) GST-풀다운 분석에서 dCTCF C-말단 도메인(610-818aa)과 CP190 단백질의 BTB 도메인(1-126aa) 간의 상호작용을 연구할 때 두 가지 다른 풀다운 기술의 비교. GST(25kDa) 또는 GST 단독과 융합된 dCTCF(610-818aa)는 박테리아 세포에서 공동 발현되거나 티오레독신-6xHis-태그된 CP190 BTB와 함께 시험관 내에서 배양되고 글루타티온 수지로 친화성 정제되었습니다. 각 분석의 3개의 독립적인 반복이 표시됩니다. 공동-정제된 단백질은 SDS-PAGE에 이어 쿠마시 염색으로 시각화하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.