이 프로토콜은 마우스 모델에서 경미한 외상성 뇌 손상을 설명합니다. 특히, 경미한 정중선 폐쇄 두부 손상을 유도하기 위한 단계별 프로토콜 및 동물 모델의 특성화가 충분히 설명된다.
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이 프로토콜은 마우스 모델에서 경미한 외상성 뇌 손상을 설명합니다. 특히, 경미한 정중선 폐쇄 두부 손상을 유도하기 위한 단계별 프로토콜 및 동물 모델의 특성화가 충분히 설명된다.
잘 정의된 병리를 가진 외상성 뇌 손상(TBI)의 재현성이 높은 동물 모델은 치료적 개입을 테스트하고 TBI가 뇌 기능을 어떻게 변화시키는지에 대한 메커니즘을 이해하는 데 필요합니다. TBI의 여러 동물 모델의 가용성은 사람에게서 볼 수 있는 TBI의 다양한 측면과 중증도를 모델링하는 데 필요합니다. 이 원고는 경미한 TBI의 마우스 모델을 개발하기 위해 정중선 폐쇄 두부 손상(CHI)을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 모델은 신경 영상 또는 육안적 신경 손실을 기반으로 하는 구조적 뇌 병변을 생성하지 않기 때문에 경미한 것으로 간주됩니다. 그러나 한 번의 충격으로 부상 후 최소 1개월 후에 인지 장애를 측정할 수 있을 만큼 충분한 병리가 형성됩니다. 정위 유도 전자기 충격기를 사용하여 마우스에서 CHI를 유도하는 단계별 프로토콜이 논문에 정의되어 있습니다. 경미한 정중선 CHI 모델의 이점에는 낮은 사망률로 부상으로 인한 변화의 재현성이 포함됩니다. 이 모델은 신경 영상, 신경 화학적, 신경 병리학 적 및 행동 변화에 대해 손상 후 최대 1 년까지 시간적으로 특성화되었습니다. 이 모델은 동일한 임팩터 장치를 사용하여 제어된 피질 충격의 개방형 두개골 모델을 보완합니다. 따라서 실험실에서는 동일한 임팩터를 사용하여 경미한 확산 TBI와 초점 중등도에서 중증 TBI를 모두 모델링할 수 있습니다.
외상성 뇌 손상(TBI)은 종종 낙상, 스포츠 부상, 신체적 폭력 또는 교통사고와 관련된 뇌의 외력에 의해 발생합니다. 2014년 미국 질병통제예방센터(Centers for Disease Control and Prevention)는 253만 명의 미국인이 TBI 관련 사고에 대한 의료 도움을 받기 위해 응급실을 방문했다고 밝혔습니다 1. 경증 TBI(mTBI)가 TBI 사례의 대부분을 차지하기 때문에 지난 수십 년 동안 체중 감소, 피스톤 구동 폐쇄 두부 손상 및 제어된 피질 충격, 회전 손상, 경미한 유체 타격 손상 및 폭발 손상 모델 2,3을 포함하는 여러 mTBI 모델이 채택되었습니다. mTBI 모델의 이질성은 사람에게서 볼 수 있는 mTBI와 관련된 다양한 특징을 해결하고 뇌 손상과 관련된 세포 및 분자 메커니즘을 평가하는 데 유용합니다.
폐쇄 두부 손상의 일반적으로 사용되는 모델 중 최초이자 가장 널리 사용되는 모델 중 하나는 물체를 특정 높이에서 동물의 머리 위로 떨어 뜨리는 체중 낙하 방법입니다 (마취 또는 깨어 있음) 2,4. 체중 감량 방법에서, 부상의 중증도는 개두술 수행 여부, 머리 고정 또는 자유, 낙하물의 거리 및 무게 2,4를 포함한 여러 매개 변수에 따라 달라집니다. 이 모델의 한 가지 단점은 부상의 중증도가 다양하고 호흡 억제와 관련된 사망률이 높다는것입니다 5,6. 일반적인 대안은 공압 또는 전자기 장치를 사용하여 충격을 전달하는 것인데, 이는 노출된 경막(제어된 피질 충격: CCI) 또는 폐쇄된 두개골(폐쇄 두부 손상: CHI)에 직접 수행할 수 있습니다. 피스톤 구동 부상의 장점 중 하나는 높은 재현성과 낮은 사망률입니다. 그러나 CCI는 개두술7,8을 필요로 하며, 개두술 자체는 염증을 유발한다9. 대신 CHI 모델에서는 개두술이 필요하지 않습니다. 이미 언급했듯이 각 모델에는 한계가 있습니다. 본 논문에서 기술한 CHI 모델의 한계 중 하나는 수술이 정위 프레임을 이용하여 수행되고, 동물의 머리가 고정되어 있다는 점이다. 전체 머리 고정은 재현성을 보장하지만 mTBI와 관련된 부상에 기여할 수 있는 충격 후의 움직임을 설명하지 않습니다.
이 프로토콜은 마우스에서 시판되는 전자기 충격기 장치(10)를 사용하여 CHI 충격을 수행하는 기본 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 재현성이 높은 부상을 달성하기 위해 관련된 정확한 매개 변수를 자세히 설명합니다. 특히, 조사자는 부상 심각도를 정확하게 정의하기 위해 매개변수(부상 깊이, 체류 시간 및 충격 속도)를 정밀하게 제어할 수 있습니다. 설명된 바와 같이, 이 CHI 모델은 미만성 및 현미경적 양측 병리(즉, 신경교의 만성 활성화, 축삭 및 혈관 손상) 및 행동 표현형 11,12,13,14,15를 초래하는 손상을 생성합니다. 또한, 기술된 모델은 손상 후 1년이 지나도 MRI에 기초한 구조적 뇌 병변 또는 병리학상의 육안적 병변을 유도하지 않기 때문에 경미한 것으로 간주된다16,17.
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수행된 실험은 켄터키 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며 연구 기간 동안 ARRIVE와 실험실 동물 관리 및 사용 가이드라인을 모두 따랐습니다.
1. 외과적 설정
참고: 마우스는 4-5/케이지 그룹으로 사육되며 주거실의 습도는 43%-47%로 유지되며 온도는 22-23°C로 유지됩니다. 생쥐는 음식과 물에 임의로 접근할 수 있으며 12시간/12시간 명암 주기(오전 7시/오후 7시)에 노출됩니다.
2. 수술 전 절차
3. 수술 절차
4. 수술 후 관리
5. 청소
6. 제외 기준
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이 입체 전자기 충격기 장치는 다재다능합니다. 개방 두개골 제어 피질 충격(CCI) 또는 폐쇄성 두부 손상(CHI) 수술 모두에 사용됩니다. 또한 충격 속도, 체류 시간, 충격 깊이, 충격기 팁 및 부상 목표와 같은 부상 매개변수를 변경하여 부상 심각도를 조절할 수 있습니다. 본원은 5.0 mm 강철 팁 임팩터를 사용한 CHI 수술을 설명한다. 이 부상은 구조적 뇌 병변이 없기 때문에 경미한 것으로 간주됩니다. 성체 생쥐의 폐사율은 0.9% 미만이며11,14 나이가 많은 생쥐(>8개월령)에서 ~2.5%에 도달하기 위해 약간 증가합니다11. 사망은 무호흡으로 인해 처음 2분 동안 발생하며, 이는 충격 전 몇 초 동안 마취 깊이를 주의 깊게 모니터링하여 크게 예방할 수 있습니다.
이 CHI 모델의 장점은 충격이 피질 경막 표면을 노...
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설명된 모델을 사용하여 일관된 부상 모델을 재현하는 데는 몇 가지 단계가 포함됩니다. 첫째, 동물을 입체 프레임에 올바르게 고정시키는 것이 중요합니다. 동물의 머리는 옆으로 움직일 수 없어야하며, 두개골은 브레그마와 람다가 같은 좌표를 읽는 완전히 평평해야합니다. 이어바를 올바르게 배치하는 것은 이 수술에서 가장 어려운 부분이며, 이는 연습을 통해서만 배울 수 있습니다. 두개골이 수평이 아닌 경우 CHI를 유도하기 전에 머리를 조정해야 합니다. 머리 위치를 조정하지 않으면 두개골 골절이 발생합니다. 두개골이 평평한지 평가하려면 끝 주변의 모든 각도에서 두개골과 충격 끝 사이의 간격을 살펴봐야 합니다. 두개골 골절이 있는 쥐는 두개골 골절을 겪지 않은 쥐에 비해 염증 반응이 훨씬 강하고 부상이 더 심하기 때문에 실험에서 제외해야 한다19. 또한 두개골 골절이 있는 마우스는 외상 후 호흡 억제, 2차 반동 손상, 결국 사망과 같은 더 심각한 TBI 결과를 보인다
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저자는 공개 할 것이 없습니다.
이 작업은 수상 번호 R01NS120882, RF1NS119165 및 R01NS103785 및 국방부 수상 번호 AZ190017로 국립 보건원(National Institutes of Health)에서 부분적으로 지원했습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 국립 보건원 또는 국방부의 공식 견해를 나타내지 않습니다.
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| 9mm Autoclip Applier | Braintree scientific | ACS- APL | 수술 |
| 9mm Autoclip Remover | Braintree scientific | ACS- RMV | 수술 |
| 9mm Autoclip, 1,000개의 클립 케이스 | Braintree scientific | ACS- CS | 수술 (스테이플) |
| Aperio ImageScope 소프트웨어 | 라이카 바이오시스템즈 | NA | IHC (국제식품협회) |
| BladeFLASK 블레이드 리무버 | Fisher Scientific | 22-444-275 | 수술 |
| 코튼 팁 애플리케이터 | VWR | 89031-270 | 수술 |
| 디지털 마우스 입체 프레임 | 스톨팅 | 51730D | 수술 |
| Dumont #7 집게 | Roboz | RS-5047 | 수술 |
| 이어바 | 스톨팅 | 51649 | 수술 |
| EthoVision XT 11.0 | Noldus 정보 기술 | NA | RAWM |
| Fiber-Lite | Dolan-Jeffer Industries | UN16103-DG | 수술 |
| Fisherbrand 전구 소형 피펫 | Fisher Scientific | 03-448-21 | 머리 지원 장치 |
| Gemini 회피 시스템 | San Diego Instruments | NA | Active |
| 회피 가열 패드 | 햇빛 | 732500000U | 수술 준비 |
| HRP 접합 염소 항토끼 IgG | 잭슨 면역 연구소 | 111-065-144 | IHC (국제식품협회) |
| 유도 챔버 | Kent Scientific | VetFlo-0530XS | 수술 준비 |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC: 11695-6777-2 | 수술 |
| 마우스 가스 마취 헤드 홀더 | Stoelting | 51609M | 수술 |
| 신경학계 입체 충격기 | 신경과학 도구 | n/a | 수술: Lecia에서 임팩트 원 |
| NexGen Mouse 500으로 공식 배포 | 앨런타운 | n/a | 수술 후, 홀딩 케이지 |
| Parafilm | Bemis | PM992 | 머리 지원 장치 |
| Peanut - Professional Hair Clipper | Whal | 8655-200 | 수술 준비 |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) 사용 가능한 요오드, 실험실용 | Ricca | 3955-16 | 수술 |
| Puralube Vet Oinment, petrolatum ophthalmic 연고, 멸균 안구 윤활제 | Dechra | 17033-211-38 | 수술 |
| 토끼 anti-GFAP | Dako | Z0334 | IHC |
| 토끼 안티 IBA1 | Wako | 019-19741 | IHC |
| 8-arm 방사형 팔 Water Maze | MazeEngineers | n/a | RAWM |
| 스케일 | OHAUS CS 시리즈 | BAL-101 | 수술 준비 |
| 메스 핸들 #7 솔리드 6.25" | Roboz | RS-9847 | 수술 |
| 멸균 알코올 준비 패드 (이소 프로필 알코올 70 % V / V) | Fisher Brand | 22-363-750 | 수술 준비 |
| SumnoSuite 저 유량 마취 시스템 | Kent Scientific | SS-01 | 수술 |
| 10 mL 주사기 Luer-Lok Tip | BD Bard-Parker | 302995 | 머리 지지 장치 |
| 타이머 | Fisher Scientific | 6KED8 | 수술 |
| 국소 마취 크림 | LMX 4 | NDC 0496-0882-15 | 수술 준비 |
| 삼중 항생제 연고 | 주요 | NDC 0904-0734-31 | 수술 후 |
| 튜브 | MasterFlex | 96410-16 | 머리 지지 장치 |
| 기화기 단일 채널 마취 시스템 | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 수술 준비 |
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