방법 논문

S. cerevisiae에서 감수 분열을 연구하기 위해 타임 랩스 현미경 및 단백질의 단계 별 핵 고갈 사용

DOI:

10.3791/64580

⸱

2022년 10월 11일

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Indiana University, 2Stowers Institute for Biomedical Research

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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타임 랩스 현미경은 신진 효모에서 감수 분열을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 프로토콜은 세포 주기 동기화, 타임랩스 현미경 검사 및 표적 단백질의 조건부 고갈을 결합하여 감수 분열 염색체 분리 동안 특정 단백질의 기능을 연구하는 방법을 설명하는 방법을 설명합니다.

초록

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타임랩스 형광 현미경은 고정된 세포를 이미징하는 방법으로는 종종 볼 수 없는 시간적 및 공간적 데이터를 제공함으로써 감수 분열 세포 주기 이벤트에 대한 이해에 혁명을 일으켰습니다. 신진 효모는 많은 감수 분열 유전자가 고도로 보존되어 있기 때문에 감수 분열 염색체 분리를 연구하는 중요한 모델 유기체임이 입증되었습니다. 신진 효모에서 감수 분열의 타임 랩스 현미경 검사를 통해 다양한 감수 분열 돌연변이를 모니터링하여 돌연변이가 감수 분열 과정을 어떻게 방해하는지 보여줄 수 있습니다. 그러나 많은 단백질이 감수 분열의 여러 지점에서 기능합니다. 따라서 기능 상실 또는 감수 분열 null 돌연변이의 사용은 초기 과정을 방해하여 이후 과정을 차단하거나 방해하고 각 개별 역할과 관련된 표현형을 결정하기 어렵게 만들 수 있습니다. 이 문제를 피하기 위해 이 프로토콜은 감수 분열의 특정 단계에서 단백질이 핵에서 조건부로 고갈되는 동시에 타임랩스 현미경을 사용하여 감수 분열 사건을 모니터링하는 방법을 설명합니다. 특히, 이 프로토콜은 세포가 I 단계에서 동기화되는 방법, 앵커 어웨이 기술을 사용하여 특정 감수 분열 단계에서 핵에서 단백질을 고갈시키는 방법, 감수 분열 염색체 분리를 모니터링하기 위해 타임 랩스 이미징을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 유용성의 예로서, 키네토코어 단백질 Ctf19는 감수 분열 동안 다른 시점에서 핵으로부터 고갈되었고, 감수 분열 II의 말기에 염색질 질량의 수를 분석하였다. 전반적으로, 이 프로토콜은 감수 분열을 모니터링하면서 핵에서 다른 핵 단백질을 고갈시키도록 조정할 수 있습니다.

서론

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타임랩스 형광 현미경은 신진 효모 1,2에서 감수 분열 염색체 분리의 역학을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 신진 효모 세포는 주요 영양소의 기아를 통해 감수 분열을 겪도록 유도 될 수 있습니다3. 감수 분열 동안 세포는 한 번의 염색체 분리 후 두 번의 분열을 거쳐 포자로 포장되는 4 개의 감수 분열 생성물을 만듭니다 (그림 1). 감수 분열의 각 단계에서 개별 세포를 시각화 할 수 있으며, 이는 고정 세포 이미징으로 쉽게 놓칠 수있는 공간 및 시간 데이터를 생성합니다. 이 프로토콜은 타임 랩스 형광 현미경을 이전에 확립된 두 가지 방법인 유도성 NDT80 시스템(NDT80-in) 및 앵커 어웨이 기법과 결합하여 별개의 감수 분열 단계에서 특정 단백질의 기능을 연구하는 방법을 보여줍니다.

NDT80-in 시스템은 중간 감수 분열 전사 인자 NDT80 4,5의 유도 가능한 발현....

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프로토콜

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1. 필요한 재료의 준비

  1. 효모 세포의 성장과 포자 형성을위한 시약을 준비하십시오.
    참고: 신진 효모 균주가 ade2 - 및 trp1-인 경우 1.1.1-1.1.3 단계의 모든 배지를 1 % 주식에서 0.01 % 아데닌 및 0.01 % 트립토판의 최종 농도로 보충하십시오. 오토클레이브로 배지를 멸균하는 경우 시약을 고압멸균하고 실온으로 냉각시킨 후에만 이러한 아미노산을 추가합니다.
    1. 식물 성장을 위해 아미노산이 없는 효모 질소 염기 6.7g, 완전 아미노산 혼합물 2g 및 덱스트로스 20g을 물 500mL에 용해시켜 2x 합성 완전 + 덱스트로스 배지(2XSC)를 준비합니다. 121°C에서 20분 동안 오토클레이빙하거나 0.2μm 필터를 통해 여과하여 혼합물을 멸균합니다.
    2. 포자 형성의 첫 번째 단계를 위해, 아미노산이없는 효모 질소 염기 6.7g, 완전 아미노산 혼합물 2g 및 아세트산 칼륨 20g을 물 500mL에 용해시켜 2x 합성 완전 + 아세테이트 배지 (2XSCA)를 준비합니다. 121°C에서 20분 동안 오토클레이빙하거나 0.2μm 필터를 통해 여과하여 혼합물을 멸균합니다.
    3. 포자 형성의 마지막 단계를 위해, 5g의 KAc를 500mL의 물에 용해시켜....

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결과

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염색질 분리를 모니터링하기 위해, 히스톤 단백질 Htb2에 mCherry로 태그를 지정하였다. 전립선 I 단계에서 염색질은 단일 Htb2 덩어리로 나타납니다. 상동 염색체가 첫 번째 감수 분열에서 분리 된 후, 염색질은 두 개의 별개의 덩어리로 나타납니다 (그림 3A). 자매 염색분체가 분리된 후 염색질은 4개의 덩어리로 나타납니다. 일부 염색체가 스핀들 미세 소관에 부착되지 않으면 감수 분열 I 또는 감수 분열 II 후에 추가 덩어리가 보일 수 있습니다.

위에서 설명한 방법은 신진 효모 감수 분열에서 적절한 염색체 분리를 보장하는 키네토코어 성분 Ctf19의 역할을 연구하는 데 사용되었습니다. FRB로 태그된 Ctf19를 발현하는 앵커 떨어져 효모 균주를 NDT80-in 시스템을 사용하여 프로페이즈 I에서 동기화하였다 (tor1-1; fpr1Δ; RPL13A-FKBP12; CTF19-FRB; .......

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토론

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이 프로토콜은 세포를 동기화하는 NDT80-in 시스템, 핵에서 단백질을 고갈시키는 앵커 어웨이 기술, 감수 분열 동안 신진 효모 세포를 이미지화하는 형광 타임 랩스 현미경을 결합합니다. NDT80-in 시스템은 전상 I 정지 및 방출 4,8을 이용하는 감수 분열 세포주기 동기화를위한 방법입니다. 개별 세포는 각각의 후속 감수 분열 단계에서 소요되는 시간이 약간 다르지만 대부분의 세포는 감수 분열 전반에 걸쳐 높은 수준의 동기화를 유지합니다.

앵커 어웨이 기술은 유사분열 및 감수 분열 연구에 적응할 수 있는 도구입니다. 라파마이신의 앵커 떨어져 표적 단백질 및 시간을 추가로 변경함으로써, 이 방법은 출아성 효모 감수 분열의 임의의 단계 동안 다양한 단백질을 연구하는데 적응될 수 있다. 신진 효모 유사 분열을 연구하기 위해 조건부 돌연변이를 만드.......

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

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인디애나 대학교의 광학 현미경 이미징 센터에 감사드립니다. 이 작업은 국립 보건원 (GM105755)의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
β-estradiolMillipore SigmaE887595% EtOH
0.22 uM 스레드 보틀탑 필터1mM 재고 만들기 Millipore SigmaS2GPT02RE
100% EtOHFisher Scientific22-032-601
10X PBSFisher ScientificBP399500의 용매로 사용하기 위해 1:10 희석
북미48393241
25 mm x 75 mm 현미경 슬라이드VWR 북미48300-026
아데닌 헤미설페이트 염MilliporeSigma A9126SC, SCA 및 1% Kac
Bacto AgarBD214030
Concanavialin AMllipore SigmaC2010Make as 1mg/mL in 1X PBS
CoolSNAP HQ2 CCD camera섹션 4.3
https://fiji.sc/
GE 개인용 DeltaVision 현미경적용 정밀도다운로드 섹션 4.3
L-Tryptophan Millipore SigmaT0254SC, SCA 및 1% Kac
모델링 클레크레욜라  2302880000커버 슬립을 슬라이드 홀더에 고정하려면
NIS-Elements AR 5.30.04 이미징 소프트웨어Nikon섹션 4.4에서 사용
ORCA-Fustion BT 카메라HamamatsuC15440-20UP섹션 4.4에서 사용
플라스틱 피펫 팁 홀더Dot ScientificLTS1000-HR이 제품의 랙 부분의 4 제곱 x 4 스퀘어 섹션을 자릅니다.
Pottassium 아세테이피셔 사이언티픽BP264
라파마이신피셔 사이언티픽BP29631DMSO
실리콘 실란트Aqueon100165001수족관 접착제로도 알려져 있습니다.
소프트웍스7.0.0  섹션4.3이미징 소프트웨어 응용 정밀도
 FormediumDSCK2500
타입 N 이멀젼 오일 니콘MXA22166
로 ConA 24 mm x 50 mm 커버슬립 No. 1.5 VWRD-glucose Fisher Scientific D16-10 Difco 효모 질소 염기 w/o 아미노산 BD 291920 Dimethyl sulfoxide (DMSO)Millipore Sigma D5879 Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope Nikon에서 사용되는 광도측정 섹션 4.4 Fiji NIH 에서 이 를 보충하기 위해트 Kaiser(Synthetic Complete Mixture)에 사용된

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).
  2. Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S.

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재인쇄 및 허가

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태그

Anchor Awaykinetochore Ctf19

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