이 기사에서는 태아 심 초음파, 부검 및 episcopic confocal 현미경 (ECM)을 사용한 episcopic 형광 이미지 캡처 (EFIC)를 사용한 쥐 선천성 심장병 (CHD) 진단 방법에 대해 자세히 설명합니다.
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방법 논문
태아 마우스의 구조적 심장 결함을 특성화하는 파이프라인
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
선천성 심장병 (CHD)은 미국에서 유아 사망의 주요 원인입니다. 1980 년대와 그 이전에 중등도 또는 중증 CHD 환자는 성인이되기 전에 사망했으며 생후 첫 주 동안 최대 사망률을 보였습니다. 수술 기술, 진단 접근법 및 의료 관리의 놀라운 발전으로 결과가 크게 개선되었습니다. 선천성 심장 결함을 이해하는 중요한 연구 요구를 해결하기 위해 쥐 모델은 인간과 심장 해부학이 매우 유사하고 임신 속도가 짧기 때문에 이상적인 연구 플랫폼을 제공했습니다. 유전 공학과 고 처리량 표현형 도구의 결합은 구조적 심장 결함의 복제 및 진단을 통해 CHD 뒤에있는 분자 경로를 더 자세히 설명 할 수있었습니다. 3차원(3D) 재구성을 통해 에피스코프 컨포칼 현미경(ECM) 조직병리학을 사용한 고충실도의 에피스코픽 형광 이미지 캡처(EFIC)와 결합된 마우스 모델의 심장 표현형을 스크리닝하기 위한 비침습적 태아 심초음파를 사용하면 다양한 선천성 심장 결함의 해부학에 대한 자세한 보기가 가능합니다. 이 프로토콜은 쥐 선천성 심장 결함의 정확한 진단을 얻기 위해 이러한 방법의 완전한 워크 플로우를 설명합니다. 이 표현형 프로토콜을 모델 유기체에 적용하면 정확한 CHD 진단이 가능하여 CHD 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. CHD의 기본 메커니즘을 확인하는 것은 잠재적인 치료법과 개입의 기회를 제공합니다.
서론
선천성 심장 질환(CHD)은 가장 흔한 신생아 선천적 결함1,2으로 신생아의 약 0.8%-1.7%에 영향을 미치고 상당한 신생아 사망률과 이환율3을 초래합니다. 유전 적 병인은 CHD 4,5로 강력하게 나타납니다. 유전자 변형 마우스 모델은 CHD의 복잡성과 마우스와 인간 태아에서 4 개의 챔버 심장과 유사한 심장 발달 DNA 서열을 갖는 마우스로 인해 CHD를 유발하는 메커니즘을 이해하기 위해 널리 사용되었습니다6. 마우스 돌연변이체의 표현형을 확인하는 것은 표적 유전자의 기능을 특성화하는 기본적인 첫 번째 단계입니다. 단일 유전자 돌연변이가 인간 CHD를 모방하는 심장 결함의 스펙트럼을 초래할 수있는 유전자 투여 효과를 나타내는 마우스 모델은 CHD의 복잡성과이를 유발하는 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다.
이 문서에서는 마우스 모델에서 심장 표현형을 특성화하는 파이프라인을 간략하게 설명합니다. 적용된 방법은 태아 심 초음파 7, 부검 및 ECM ....
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프로토콜
마우스는 인간 CHD를 모방 할 수있는 4 개의 챔버가있는 심장을 가지고 있기 때문에 이러한 연구를 위해 마우스를 사용하는 것이 필요합니다. 마우스는 수의학 치료를 받았으며 기관의 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회 (AAALAC) 인증 동물 관리 시설에 수용되었습니다. 마우스의 불편 함, 스트레스, 통증 및 부상을 최소화하기 위해 엄격한 프로토콜을 따랐습니다. 마우스를CO2 가스를 사용하여 안락사시켰으며, 이는 안락사에 관한 미국 수의학 협회 지침에 따라 작은 설치류에 대해 허용된다. 이 원고의 마우스에 대한 연구는 피츠버그 대학에서 승인 된 IACUC 프로토콜로 수행되었습니다.
1. 태아 심 초음파
알림: 심초음파는 생쥐의 심혈관 기형과 심장외 결함을 식별하는 강력한 도구입니다. 마우스 배아의 크기가 작기 때문에 (임신 중기에 약 1-2mm, 출생시 3.5mm) 초음파 생체 현미경 검사 (UBM)가있는 초고주파 심 초음파 장비가 필요합니다. UBM은 한 번에 하나의 마우스 태아를 시각화할 수 있는 해상도(30μm 축 x 측면 68μm)를 제공하는 작은 이미징 창(15mm x 14mm)이 있는 다양한 고주파(30-50MHz) 프로브를 제공합니다....
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결과
현저한 혈역학적 결함을 가진 마우스 배아는 배아 치명적인 것으로 나타났다. 다양한 CHD는 다양한 보기를 사용하여 고출력, 비침습적 태아 심초음파를 통해 식별할 수 있습니다(그림 1).
중격 결손: 가장 흔한 CHD는 심실 중격 결손(VSD), 방실 중격 결손(AVSD) 및 심방 중격 결손(ASD)1과 같은 중격 결손입니다. VSD 또는 AVSD는 2D 이미지와 컬러 플로우 이미지를 사용하여 쉽게 시각화할 수 있습니다. 심실을 가로질러 또는 심방과 심실 사이의 혈류를 쉽게 식별할 수 있습니다(그림 3). ASD는 태아에서 난소 공과 구별하기가 어렵습니다.
유출로 이상 : 그림 3
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토론
유전자 변형 마우스는 선천성 심장 결함의 병리 메커니즘을 이해하는 데 사용되었습니다. 이 연구에서 우리가 제공하는 프로토콜은 쥐 태아 심장 결함을 평가하는 과정을 간소화하고 표준화하려고 시도합니다. 그러나 프로토콜 중에 주의해야 할 중요한 단계가 있습니다. 마우스 배아는 임신 기간 동안 크게 자라며 태아 심 초음파를 정확하게 수행하여 마우스를 수확하는 정확한 시간을 결정할 수 있습니다. 태아 심초음파는 태아 심혈관 병리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 2D 이미지를 사용하면 컬러 도플러의 도움으로 혈류를 검사하고 심장의 챔버 또는 비정상적인 유출 및 유입로 간의 통신을 감지하여 비정상적인 해부학 및 심장 기능을 식별 할 수 있습니다. CHD 진단을 결정하기 위해 태아는 유출로 중격 및 심장 챔버 형성이 완료된 배아 일 E14.5부터 스캔됩니다. 초기 단계의 스캔은 발달 지연을 반영 할 수 있습니다.
조직 병리학은 마이크로톰과 광학 현미경 시각화를 사용하여 CHD
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공개 사항
저자는 이 원고에 대한 이해 상충이 없음을 선언합니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1x 인산염 완충 식염수(PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5mL Eppendorf 튜브(또는 조직 보관에 선호되는 바이알) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% 완충 포르말린 인산염 용액 | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% 에탄올 | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% 파라포름알데히드(PFA) 정착제 | ThermoScientific | 28908 | 4% 작업 농도를 4°C에서 1x PBS로 신선하게 준비; C |
| 50 mL 튜브 | Falcon | 352070 | |
| 6– 12웰 플레이트 또는 20mL 바이알 배아 보관용 | Falcon | 353046 | |
| 해부 현미경 | Leica | MDG36 | |
| 해부 핀 (A1 또는 A2 등급) | F.S.T | 26002-15 | |
| 해부 플레이트 | F.S.T | FB0875713 | 페트리 접시와 파라핀 베이스 |
| 임베딩 몰 | Sakura | 4133 | |
| 매우 좁은 가위 (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1– 2 쌍 |
| 피지 응용 프로그램/이미지 J | NIH | Fiji.sc | |
| 파인 팁 (0.05 mm x 0.01 mm) 절개 집게 (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 |
| 쌍 핫 집게 | F.S.T | 11252-00 | 배아 방향용 |
| 왁스 블록용 산업용 마커 | 실험실용으로 포맷된 | Sharpie | |
| 2003898 Jenoptik ProgRes C14plus 현미경 카메라 | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro 획득 소프트웨어 | Jenoptik | jenoptik.com | |
| 대형 유리 비커 | Fisher Scientific | S111053 | 파라핀 용융용 |
| Leica M165 FC 쌍안 현미경 (16.5:1 줌 광학) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD 버전 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| 파라플라스트 임베딩 파라핀 왁스 | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| 작은 유리 비커 | Fisher Scientific | S111045 | |
| 작은 펀칭 스푼 (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| 스트레이트 바나스 가위 (4– 8mm) | F.S.T | 15018-10 | A 페어 |
| Vevo2100 초고주파 초음파 생물 현미경 | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| 크실렌 | 피셔 케미칼 | UN1307 |
참고문헌
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593(2020).
- vander Linde, D., et al.
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재인쇄 및 허가
