Saccharomyces cerevisiae에서 반수체의 짝짓기 효율 측정

Summary

이 연구에서는 효모 Saccharomyces cerevisiae 의 짝짓기 효율을 정량화하는 강력한 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 종 분화 연구에서 접합 전 장벽의 정량화에 특히 유용합니다.

Abstract

사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)는 유전학, 진화 및 분자 생물학에서 널리 사용되는 모델 유기체입니다. 최근 몇 년 동안, 그것은 또한 종 분화와 관련된 문제를 연구하는 인기있는 모델 유기체가되었습니다. 효모의 수명주기는 무성 생식 단계와 유성 생식 단계를 모두 포함합니다. 진화 실험을 수행하기 쉽고 유기체의 짧은 생성 시간은 생식 장벽의 진화에 대한 연구를 가능하게합니다. 두 가지 짝짓기 유형(a 및 α)이 짝을 이루어 a/α 이배체를 형성하는 효율을 짝짓기 효율이라고 합니다. 반수체 사이의 짝짓기 효율의 감소는 접합 전 장벽을 나타냅니다. 따라서, 두 반수체 사이의 생식 격리 정도를 정량화하기 위해서는 짝짓기 효율을 정량화하는 강력한 방법이 필요합니다. 이를 위해 간단하고 재현성이 높은 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 이 프로토콜에는 YPD 플레이트에 반수체를 패치하고, 동일한 수의 반수체를 혼합하고, 단일 콜로니에 대해 희석 및 도금하고, 마지막으로 드롭아웃 플레이트의 콜로니 수를 기반으로 효율성을 계산하는 등 4가지 주요 단계가 포함됩니다. Auxotrophic 마커는 반수체와 이배체를 명확하게 구별하기 위해 사용됩니다.

Introduction

일반적으로 신진 효모라고 불리는 Saccharomyces cerevisiae는 단세포 진핵생물입니다. a와 α의 두 가지 짝짓기 유형이 있으며 무성 생식 주기와 유성 생식 주기를 모두 나타냅니다. a 및 α 짝짓기 유형은 반수체이며 주변 환경에 다른 짝짓기 유형이 없을 때 유사분열할 수 있으며, 이는 효모의 무성 주기를 나타냅니다. 두 짝짓기 유형이 가까이 있으면 유사 분열을 멈추고 융합하여 이배체 세포를 형성합니다. 이배체 효모는 영양소가 존재할 때 유사분열을 일으키거나 아세테이트¹과 같이 발효되지 않는 열악한 탄소원이 있는 상태에서 질소 결핍 조건에서 감수분열을 겪을 수 있습니다. 그 결과 포자가 형성되어 유리한 성장 조건이 될 때까지 휴면 상태로 유지됩니다. 이 포자가 발아하고 두 가지 반수체 유형이 반수체 풀 ^2,3으로 다시 방출되면 수명주기가 완료됩니다 (그림 1).

Protocol

참고: 프로토콜은 광범위하게 다음 단계를 포함합니다: (1) YPD 플레이트의 짝짓기 효율 그리드에 있는 반수체를 패치하고, (2) 24시간 배양 후 동일한 수의 반수체를 혼합하고 혼합된 반수체를 몇 시간 동안 짝짓기(이 연구에서 7시간), (3) 30°C에서 7시간 후 단일 콜로니를 분리하기 위해 혼합 세포를 YPD에 플레이팅하고, 마지막으로, (4) 영양요구성 마커를 사용하여 형성된 이배체의 수를 결정합니다. 이러한 단계는 아래에 자세히 설명되어 있습니다( 그림 2 참조).

1. 짝짓기 효율 그리드에서 반수체 패치

1. YPD 한천 플레이트(2% 한천, 2% 덱스트로스, 1% 펩톤, 0.5% 효모 추출물)에 줄무늬를 넣어 냉동고 스톡에서 반수체 a 및 α 을 되살리고 30°C에서 48시간 동안 성장시켜 분리된 단일 콜로니를 얻습니다.
2. YPD 플레이트의 단일 콜로니를 5mL의 YPD 배지(2% 덱스트로스, 1% 펩톤, 0.5% 효모 추출물)에 접종하고 30°C에서 250rpm 진탕으로 48시간 동안 배양합니다. 세포는이 잠복기 후에 성장의 정지 단계에 있습니다.

Results

두 가지 결합 유형의 결합 효율 정량화
여기에 설명된 프로토콜은 SK1AM a와 SK1AMα 사이 및 ScAMa와 ScAMα 사이의 두 효모 균주 사이의 짝짓기 효율을 정량화하는 데 사용되었습니다(그림 3A). 이 실험에서, 두 반수체 사이의 교배를 적어도 12회 반복하였다. 실험의 각 반복에서, 적어도 100 콜로니가 이중 드롭 아웃 배지에 줄무늬가 있었다. 프로토콜의 견고성으로 인해 SK1AM과 ScAM의 두 균주 간의 결합 효율을 쉽게 구별할 수 있었습니다. SK1 균주는 매우 높은 효율로 교배된 반면, ScAM 균주는 상대적으로 낮은 효율로 교배되었습니다(그림 3A). ScAM 균주는 S. cerevisiae와 S. carlsbergens.......

Discussion

S. cerevisiae의 짝짓기 효율 정량화는 짝짓기 경로에 관여하는 유전자와 관련된 연구를 수행하거나 짝짓기 행동에 대한 외부 환경의 영향을 연구하는 데 필수적입니다. 지난 20년 동안 S. cerevisiae는 종분화 14,36,37,38과 관련된 질문을 해결하는 인기 있는 모델이 되었습니다. 두 가지 짝짓기 유형의 존재와 실험실 환경에서의 유전자 조작 및 유지 관리의 용이성으로 인해 생식 장벽의 진화를 실시간으로 연구하기에 적합한 유기체가 되었습니다. 짝짓기 효율의 정량화는 접합 전 생식 장벽의 척도를 제공하기 때문에 필수적입니다. 따라서 재현성이 높은 편리한 프로토콜이 필요합니다.

상기 프로토콜을 사용하여, 완전.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
아데닌	시그마 생명과학	A8626
아가르 파우더 세균학 SRL		19661 (0140186)
암모늄 황산염, Hi-AR	HiMedia	GRM1273
D-(+)-글루코스	시그마 생명과학	G8270
유리 페트리 플레이트	HiMedia	PW008	90mm x 15mm 치수
L-아르기닌	시그마 생명 과학	A8094
L-아스파르트산	시그마 생명 과학	A7219
L-히스티딘 일염화물 일수화물	시그마 생명 과학	H5659
L-이소류신	시그마 알드리치	I2752
L-류신	시그마 생명 과학	L8912
L-라이신	Aldrich	62840
L-메티오닌	시그마 생명 과학	M5308
L-페닐알라닌	시그마 생명 과학	P5482
L-트레오닌	시그마 Aldrich	T8625
L-티로신	시그마 생명 과학	T8566
L-발린	시그마 생명 과학	V0513
짝짓기 효율 그리드			페트리 플레이트에 그려진 1cm x 1.5cm 직사각형 그리드,
미세 원심분리기 튜브	Tarsons	, 500010
펩톤	HiMedia	, RM001
Uracil	, Sigma, Life Science	U0750
효모 추출물 분말,	HiMedia	, RM027
효모 질소 베이스, 아미노산 및 황산	암모늄 제외BD 디프코	233520