지방세포는 갓 태어난 마우스의 견갑골 간 갈색 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 분리하여 지질 방울을 축적하고 분자 마커를 발현하며 성숙한 갈색 지방세포의 미토콘드리아 형태를 보여주는 세포로 분화합니다. 이러한 세포는 면역 형광 및 투과 전자 현미경으로 추가로 분석됩니다.
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방법 논문
Differentiation and Imaging of brown adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice(신생아 마우스의 견갑간 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 갈색 지방세포의 분화 및 이미징)
이 논문에서
요약
초록
갈색 지방 조직(BAT)은 포유류에만 존재하며 발열 기능이 있습니다. 갈색 지방세포는 여러 개의 지질 방울이 있는 다엽 세포질, 중심핵, 높은 미토콘드리아 함량 및 결합 해제 단백질 1(UCP1)의 발현을 특징으로 합니다. BAT는 대사 에너지를 열로 발산하는 능력으로 인해 비만 및 관련 대사 장애에 대한 잠재적인 치료 대상으로 제안되었습니다. BAT 기능 및 조절을 연구하기 위해서는 갈색 지방세포 배양이 필수적입니다. 본 프로토콜은 신생아 마우스에서 갈색 지방 세포를 배양하기 위해 조직 처리 및 세포 분화를 최적화합니다. 또한 confocal immunofluorescence 및 transmission electron microscopy를 사용하여 분화된 지방세포를 이미징하는 절차를 보여줍니다. 본 명세서에 기술된 기법으로 분화된 갈색 지방세포에서는 높은 UCP1 수준, 미토콘드리아 질량 증가, 지질 방울과 미토콘드리아 사이의 매우 밀접한 물리적 접촉을 포함하여 기존 BAT의 주요 특징이 보존되어 이 방법을 BAT 연구에 유용한 도구로 만듭니다.
서론
백색과 갈색 지방 조직은 해부학적 위치, 세포 기원, 기능, 형태 및 총 질량이 다릅니다. 백색 지방 조직(WAT)은 신체의 주요 생리적 에너지 저장소이며, 세포 부피의 대부분을 차지하는 단일 거대 지질 방울이 있는 고도로 전문화된 세포에 다량의 트리아실글리세롤(TAG)을 저장합니다1. TAG 지방 분해는 유리 지방산을 방출하여 단식 또는 기타 음의 에너지 균형 상태에서 에너지 수요를 충족시키기 위해 전신 순환에 들어갑니다. 또한 WAT는 대사, 면역 및 생식 조절 기능을 가진 아디포카인과 리포카인이라고 하는 단백질 및 지질 제품을 각각 분비하므로 WAT는 신체에서 가장 큰 내분비 조직입니다2.
갈색 지방 조직(BAT)은 저체온증을 예방하기 위해 떨리지 않는 열발생을 주요 생리적 기능으로 하는 훨씬 작은 장기입니다. 생쥐와 신생아에서 BAT는 견갑간 공간에 위치한 잘 정의된 장기입니다. 성인은 견갑간 BAT(iBAT)가 없습니다. 그럼에도 불구하고, 그들은 대부분 WAT를 구성하는 저장소에 통합된 갈색 지방세포와 같은 세포의 클러스터를 발달시킵니다. 이러한 "갈색-백색"(brite) 지방세포는 기존의 iBAT 지방세포와 형태학적 및 분자적 특징을 공유하지만 ....
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프로토콜
동물 시술은 Pontificia Universidad Católica de Chile의 Institutional Animal Care and Use Committee에서 승인했습니다. C57BL/6J 및 129J 균주의 혼합 배경에서 파생된 남녀 모두의 P0.5 신생아 마우스가 이 연구에 사용되었습니다.
1. 조직 추출
- 70% 에탄올 용액으로 작업대를 청소 및 소독하고 멸균 수술 재료를 사용하십시오.
- P0.5 갓 태어난 새끼를 기관적으로 승인된 프로토콜에 따라 수술용 가위로 참수하여 안락사시킵니다.
- 마우스를 엎드린 자세(아래를 향함)에 놓고 날카로운 가위를 사용하여 동물의 등 중간 수준 피부를 1cm 길이로 절개합니다. 피부를 조심스럽게 제거하십시오.
알림: 피부가 잘 제거되지 않으면 iBAT가 찢어지고 손상되어 SVF의 최적 준비를 방해할 수 있기 때문에 이 단계가 중요합니다. - 작은 가위를 사용하여 사체에서 iBAT를 외과적으로 분리합니다.
참고: iBAT는 독립적으로 제거할 수 있는 두 개의 지방소엽으로 시각화됩니다. - 곡선형 팁 플라이어를 사용하여 두 iBAT 로브를 모두 수확하여 로브를 독립적으로 제거합니다.....
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결과
지방 형성은 갈색 지방 세포 형성을 유도하고 기능하는 주요 단백질의 발현을 담당하는 전사 인자 네트워크에 의해 조절됩니다22 PPARγ 및 C/EBPα 23,24,25와 같은 고전적인 지방 생성 조절제와 성숙한 지방 세포의 마커를 포함합니다 26,27. 열발생 갈색 지방 표현형의 획득을 허용하는 로시글리타존의 다양한 농도를 테스트함으로써, 본원에 기술된 방법은 신생아 P0.5 마우스의 iBAT의 SVF에 존재하는 지방세포를 성숙한 갈색 지방세포로 분화할 수 있도록 한다. 유도 및 유지 배지에 5μM 로시글리타존을 첨가하면 이 PPARγ 작용제(1nM)의 농도가 더 낮았던 것에 비해 분화 7일째에 지방 형성 조절제와 U.......
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토론
본 프로토콜은 성숙한 갈색 지방세포의 분자 및 형태학적 특성을 가진 세포를 생성하기 위한 간단하고 복제 가능한 2상 분화 절차(그림 2)입니다. 조직 파괴는 시작 물질의 생존력을 심각하게 제한하기 때문에 iBAT의 외과적 채취는 첫 번째 중요한 단계입니다. 조직 처리도 중요한데, 이물질이 없는 균질한 세포 현탁액은 배양할 수 있는 SVF의 양을 크게 증가시키기 때문입니다. 현재 연구에서는 100μm 세포 여과기만 사용하는 다른 프로토콜과 달리 100μm 및 40μm 세포 여과기를 사용하여 여과를 두 번 수행했습니다 11,12,13,14.
기질 혈관 분획 배양의 경우, 실험에 사용할 수 있는 세포의 수.......
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공개 사항
저자는 밝힐 것이 없습니다.
감사의 글
자금은 FONDECYT (1181214 및 1221146)와 Anillos (ACT210039)가 VC 및 박사 장학금, ANID 21171743는 AMF에, ANID는 FS에 21150665 제공했습니다. Alejandro Munizaga에게 샘플 처리에 도움을 주고 투과 전자 현미경에 대한 기술적 조언을 해준 것에 대해 감사드립니다. 일러스트레이션은 BioRender를 사용하여 제작되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10x Tris/Glycine Buffer | BioRad | 1610734 | |
| 16% 파라포름알데히드 수용액 | 전자 현미경 과학 | 15710 | |
| 35mm TC 처리 Easy-Grip Style Cell Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Calbiochem | 410957 | |
| 40% 아크릴아미드/비스 용액, 37.5:1 | BioRad | 1610148 | |
| 6웰 플레이트 | SPL 생명과학 | - | |
| 96 웰 광학 블랙 w/뚜껑 세포 배양 멸균 | Thermo Scientific | 165305 | |
| AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder | Maestrogen | 02102-250 | |
| ACK 용해 버퍼 | Gibco | A10492-01 | |
| 과황산암모늄 | BioRad | 1610700 | |
| 항생제-항진균제 | Gibco | ||
| 항-마우스 IgG, HRP 연계 항체 | 세포 신호 | 7076 | |
| 항-토끼 IgG, HRP 연계 항체 | Cell Signaling | 7074 | |
| 블로팅 등급 차단제 | BioRad | 170-6404 | |
| 보디피 493/503 | Invitrogen | D3922 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| C/EBPα 항체 | 세포 신호 | 2295 | |
| CaCl2 | Calbiochem | ||
| CD36 항체 | Invitrogen | PA1-16813 | |
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| 셀 스트레이너 40 &마이크로; m, 나일론 | Falcon | 352340 | |
| Collagenase type II | Gibco | 17101-015 | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | ||
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DMEM/F-12, 분말 | Gibco | 12500062 | |
| EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon) | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| 에탄올 절대 | Merck | 100983 | |
| 태아 소 혈청 | Gibco | 16000-044 | |
| 젤라틴, 차가운 물 물고기 피부에서 추출한 Sigma | G7041 | ||
| Glucose | Gibco | 15023-021 | |
| 글루타르알데히드 25% 수용액 | 전자 현미경 과학 | 16210 | |
| 염소 항-토끼 IgG (H+L) 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11012 | |
| Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X | Thermo Scientific | 78427 | |
| Halt Protease 억제제 칵테일 100X | Thermo Scientific | 78429 | |
| Hoechst 33258 | Invitrogen | H1398 | |
| Immun-Blot PVDF 멤브레인 | BioRad | 1620177 | |
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| MilliQ 물 살균 | - | - | |
| Mitoprofile Total OXPHOS Rodent WB 항체 칵테일 | Abcam | MS604 | |
| NaCl | 머크 | ||
| 옴니퍼 10x PBS 액체 콘센트레이트 | Calbiochem | 6505-OP | |
| 오스뮴 테트록사이드 | 전자 현미경 과학 | 19100 | |
| 페리리핀 1 항체 | 세포 신호 | 9349 | |
| PPARγ (81B8) 항체 | 세포 신호 | 2443 | |
| RIPA 완충액 용해 | Thermo Scientific | 89901 | |
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| 소듐 카프딜레이트 | 전자 현미경 과학 | 12300 | |
| 소듐 도데실 설페이트 | BioRad | 1610301 | |
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| Talos F200C G2 | Thermo Scientific | ||
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| TOM20 항체 | 세포 신호 | 42406 | |
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| Tween 20, 분자 생물학 등급 | Promega | H5152 | |
| UCP1 항체 | 세포 신호 | 14670 | |
| Ultracut R | Leica | ||
| Uranyl 아세테이 | 트 전자 현미경 과학 | 22400 | |
| Westar Sun | 시아너젠 | XLS063 | |
| 웨스타 초신성 | 시아나겐 | XLS3 |
참고문헌
- Luo, L., Liu, M. Adipose tissue in control of metabolism. Journal of Endocrinology. 231 (3), 77-99 (2016).
- Gaspar, R. C., Pauli, J. R., Shulman, G. I., Muñoz, V. R. An update on brown adipose tissue biology: A discussion of recent findings.
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