Differentiation and Imaging of brown adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice(신생아 마우스의 견갑간 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 갈색 지방세포의 분화 및 이미징)

백색과 갈색 지방 조직은 해부학적 위치, 세포 기원, 기능, 형태 및 총 질량이 다릅니다. 백색 지방 조직(WAT)은 신체의 주요 생리적 에너지 저장소이며, 세포 부피의 대부분을 차지하는 단일 거대 지질 방울이 있는 고도로 전문화된 세포에 다량의 트리아실글리세롤(TAG)을 저장합니다¹. TAG 지방 분해는 유리 지방산을 방출하여 단식 또는 기타 음의 에너지 균형 상태에서 에너지 수요를 충족시키기 위해 전신 순환에 들어갑니다. 또한 WAT는 대사, 면역 및 생식 조절 기능을 가진 아디포카인과 리포카인이라고 하는 단백질 및 지질 제품을 각각 분비하므로 WAT는 신체에서 가장 큰 내분비 조직입니다².

갈색 지방 조직(BAT)은 저체온증을 예방하기 위해 떨리지 않는 열발생을 주요 생리적 기능으로 하는 훨씬 작은 장기입니다. 생쥐와 신생아에서 BAT는 견갑간 공간에 위치한 잘 정의된 장기입니다. 성인은 견갑간 BAT(iBAT)가 없습니다. 그럼에도 불구하고, 그들은 대부분 WAT를 구성하는 저장소에 통합된 갈색 지방세포와 같은 세포의 클러스터를 발달시킵니다. 이러한 "갈색-백색"(brite) 지방세포는 기존의 iBAT 지방세포와 형태학적 및 분자적 특징을 공유하지만 세포 기원은 다릅니다 ^3,4.

백색 지방세포와 대조적으로, 갈색 지방세포는 여러 개의 작은 지질 방울과 풍부한 미토콘드리아를 가지고^{있다 5}. 분리 단백질 1(UCP1, 열원소라고도 함)은 갈색 및 영국산 지방 세포에 의해 고유하게 발현되며 내부 미토콘드리아 막(IMM)에서 양성자 누출을 매개하여 ATP 합성에서 전자 수송을 분리하고 열을 생성합니다. BAT에서 떨리지 않는 열발생은 노르에피네프린(NE)에 의해 활성화되며, 노르에피네프린은 차가운 자극에 대한 반응으로 BAT의 교감신경 말단에서 방출된다⁶. NE는 갈색 지방세포 표면의 베타 아드레날린 수용체(대부분 베타 3)에 결합하여 세포 내 cAMP 매개 신호 전달 캐스케이드를 유발합니다. 그 결과 TAG 지방 분해, 미토콘드리아 지방산의 베타 산화 및 UCP1 활성화시 열 생성이 발생합니다³. 갈색 지방세포에서 지질 방울과 미토콘드리아 사이의 밀접한 기능적 관계는 크고 매우 밀접한 물리적 접촉을 갖는 영역에서 이러한 소기관 간의 상호 작용과 같은 구조적 유사성을 가지고 있습니다 ^7,8.

아이밧은 풍부한 혈관과 교감신경 말단을 가지고 있다⁹. 이러한 구조는 지방세포, 면역세포, 섬유아세포 및 세포외 기질 분자와 함께 지방이 풍부한 기질 혈관 분획(SVF)을 구성합니다¹⁰. 많은 프로토콜이 지방세포(preadipocyte) 11,12,13,14,15로부터 성숙한 지방세포를 생성하는 것으로 보고되었다(보충 표 1); 그럼에도 불구하고, 그들은 조직 처리 및 분화 배양 배지의 구성에서 극단적인 변화를 나타냅니다. 본원에 기술된 프로토콜은 (1) 주요 지방생성 전사 인자인 과산화시좀 증식제 활성화 수용체 감마(PPARγ) 및 CCAAT/인핸서-결합 단백질 알파(C/EBPα)를 발현하고, (2) 성숙한 지방세포 마커인 페리리핀1(PLIN1) 및 클러스터 결정인자 36(CD36)을 발현하고, (3) 풍부한 지질 방울을 축적하고, (4) 높은 미토콘드리아 질량 및 높은 풍부의 OXPHOS 복합체를 갖는 갈색 지방세포의 효율적이고 재현 가능한 분화를 가능하게 하며, (5) 높은 수준의 UCP1에 의해 결정되는 열발생 전위가 있고 (6) 성숙한 갈색 지방세포의 표현형과 관련된 미토콘드리아 형태학적 변화가 있습니다. 이 방법론은 일반화된 지방이영양증 15,16,17의 기초가 되는 분자 메커니즘을 연구하는 데 사용됩니다.

동물 시술은 Pontificia Universidad Católica de Chile의 Institutional Animal Care and Use Committee에서 승인했습니다. C57BL/6J 및 129J 균주의 혼합 배경에서 파생된 남녀 모두의 P0.5 신생아 마우스가 이 연구에 사용되었습니다.

1. 조직 추출

1. 70% 에탄올 용액으로 작업대를 청소 및 소독하고 멸균 수술 재료를 사용하십시오.
2. P0.5 갓 태어난 새끼를 기관적으로 승인된 프로토콜에 따라 수술용 가위로 참수하여 안락사시킵니다.
3. 마우스를 엎드린 자세(아래를 향함)에 놓고 날카로운 가위를 사용하여 동물의 등 중간 수준 피부를 1cm 길이로 절개합니다. 피부를 조심스럽게 제거하십시오.
   알림: 피부가 잘 제거되지 않으면 iBAT가 찢어지고 손상되어 SVF의 최적 준비를 방해할 수 있기 때문에 이 단계가 중요합니다.
4. 작은 가위를 사용하여 사체에서 iBAT를 외과적으로 분리합니다.
   참고: iBAT는 독립적으로 제거할 수 있는 두 개의 지방소엽으로 시각화됩니다.
5. 곡선형 팁 플라이어를 사용하여 두 iBAT 로브를 모두 수확하여 로브를 독립적으로 제거합니다.
6. 실온에서 1.5mL의 멸균 PBS가 있는 플라스틱 튜브에 두 개의 로브를 넣습니다. 필요한 모든 새끼에 대해 조직 추출이 완료될 때까지 개별 튜브의 조직을 유지하십시오.

2. 조직 소화

1. 콜라겐 분해 효소 II형 소화 완충액 300μL(완충액 내 0.2% II형 콜라겐 분해 효소 [25mM KHCO₃, 1.2mM MgSO₄, 120mM NaCl, 5mM 포도당, 12mM KH₂PO₄, 4.8mM KCl, 1.2mM CaCl₂, 2.5% BSA 및 1% 페니실린/스트렙토마이신, pH 7.4에서]) (표 1) 생물안전 캐비닛의 1.5mL 튜브.
   알림: 추출할 개별 조직의 수에 충분한 튜브를 준비합니다. 본 연구에서는 7마리의 새끼에 해당하는 7개의 튜브가 사용되었습니다.
2. 벤치로 이동하여 iBAT 엽을 콜라겐분해효소 II형 분해 완충액에 넣어 세포외 기질을 분해합니다.
3. 37°C에서 45분 동안 800rpm에서 지속적으로 부드럽게 흔들면서 iBAT 조직을 배양합니다(그림 1).

3. 조직 가공

참고: 분해 후 클래스 II 층류 조직 배양 후드에서 다음 단계를 모두 수행하십시오.

1. 각 개별 샘플에 대해 1.5mL 플라스틱 튜브 두 세트를 준비하고 라벨링합니다.
2. P1,000 마이크로피펫과 여과된 팁을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 콜라겐분해효소 II형 소화 완충액의 조직 현탁액을 기계적으로 파괴합니다. 각 샘플에 대해 새 팁을 사용하십시오.
   참고: 이것은 중요한 단계입니다. 거시적 균질화가 완료될 때까지 팁과 피펫으로 조직을 위아래로 기계적으로 분해해야 합니다.
3. 분리된 조직을 개별 100μm 세포 여과기( 재료 표 참조)를 통해 새 1.5mL 튜브에 넣습니다.
4. 여과된 조직 샘플에 500μL의 ACK 완충액( 재료 표 참조)을 추가하고 튜브를 4-5회 반전시킨 다음 실온에서 4분 동안 배양합니다.
   참고: 관심 세포가 손상될 수 있으므로 배양 시간을 초과하지 마십시오.
5. 조직 샘플을 300 x g 에서 실온에서 5분 동안 원심분리합니다.
6. 튜브를 뒤집어 상층액을 버리고 펠릿을 1mL의 배양 배지(10% FBS, 1% 항생제 항진균제, pH 7.2의 DMEM-F12)에 재현탁시킵니다( 재료 표 참조).
7. P1,000 마이크로피펫과 여과된 팁을 사용하여 40μm 세포 여과기를 통해 현탁액을 새 1.5mL 튜브에 통과시킵니다.
8. 샘플을 300 x g 에서 실온에서 5분 동안 원심분리합니다.
   참고: 펠릿은 지방세포 함유 SVF에 해당합니다.
9. 튜브를 뒤집어 상층액을 버리고 피펫팅을 통해 펠릿을 1mL의 배양 배지에 재현탁시킵니다.
10. 배양 배지 5mL를 추가하여 각 샘플에 대해 15mL 튜브 1개를 준비합니다.
11. 각 재현탁 펠릿을 5mL의 배양 배지가 들어 있는 해당 15mL 튜브에 추가합니다. 튜브를 4-5번 뒤집어 세포 내용물을 혼합합니다.
12. 각 웰에 현탁액 1mL를 추가하여 각 샘플을 24웰 배양 플레이트의 6개 웰에 시드합니다(그림 1).

4. 기질 혈관 분획(SVF) 배양

1. 세포가 100% 합류할 때까지 이틀에 한 번씩 배양 배지를 교체합니다.
   참고: 이 기간 동안 비플라스틱 부착 세포가 제거되어 지방세포 함유 SVF가 강화된 1차 배양이 이루어집니다.
2. 세포가 100% 합류하면 배양 배지를 제거하고 800μL의 멸균 PBS로 세포를 세척합니다.
3. 모든 웰에 150μL의 0.25% 트립신-EDTA( 재료 표 참조)를 추가하고 세포 분리를 위해 배양 플레이트를 인큐베이터에 3분 동안 놓습니다.
   알림: 위상차 광학 현미경을 사용하여 셀이 분리되었는지 확인합니다.
4. 각 웰에 850μL의 배양 배지를 추가하여 트립신을 비활성화합니다.
5. 3.12단계에서 파종된 6개의 웰에서 세포를 수집하고 15mL 튜브에 옮깁니다.
6. 6mL의 배양 배지를 추가하여 총 부피를 최대 12mL까지 만듭니다. 내용물을 섞기 위해 튜브를 4-5번 뒤집습니다.
7. 시료 1mL를 12웰 플레이트의 각 웰에 파종합니다. 세포가 합류할 때까지 이틀에 한 번씩 배양 배지를 교체합니다.
8. 세포가 100% 합류하게 되면 단계 4.3과 동일한 배양 조건에 따라 0.25% 트립신-EDTA의 150μL로 세포를 분리하고 실험에 필요한 웰의 표면적에 따라 시드합니다.
9. 8단계에 따라 세포를 고정한 후 고해상도 이미징을 수행합니다.
   참고: 추가 실험에는 35,000 cells/cm²의 밀도가 권장됩니다(단백질 및 총 RNA 추출, 330,000개 세포[6웰 플레이트의 1웰], 면역형광[IF], 10,500개 세포[96웰 플레이트의 1웰]).

5. Adipogenic 분화

1. 유도 배지(10% FBS, 1% 항생제 항진균제가 함유된 DMEM-F12, pH 7.2, 500nM 덱사메타손, 125nM 인도메타신, 0.5mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴[IBMX], 5μM 로시글리타존, 1nM T3 및 20nM 인슐린)(표 1)로 72시간(0일에서 2일까지)(표 2)으로 세포를 배양합니다(그림 2).
   참고: 배양 매체는 이틀에 한 번씩 변경해야 합니다. 따라서 첫 번째 매체 변화는 초기 유도 후 2일째에 발생해야 합니다.
2. 3일째에 유지 배지(10% FBS, 1% 항생제 항진균제가 포함된 DMEM-F12, pH 7.2, 5μM 로시글리타존, 1nM T3 및 20nM 인슐린이 보충됨)(표 1)로 변경하고 7일까지 이 유지 배지를 유지합니다(그림 2).
   알림: 유지 관리 매체는 5일차와 7일차에 교체해야 합니다. 작은 지질 방울은 분화 3일차부터 위상차 현미경으로 시각화할 수 있습니다. 큰 지질 방울은 분화 7일째에 분명합니다. 7일 이상의 분화 절차는 지질이 많은 세포의 높은 부력으로 인해 박리에 의한 세포 손실을 초래할 수 있습니다.

6. 세포 균질액 제조

1. 분화 0일째 및 7일째에 배양액을 제거하고 멸균 PBS로 세포를 3회 세척합니다.
2. 마지막 세척 후 각 웰에 1.3mL의 멸균 PBS를 추가합니다.
   알림: 마지막 플레이트를 청소할 때까지 셀을 얼음으로 유지하십시오.
3. 세포 스크레이퍼를 사용하여 6-웰 플레이트(~330,000개 세포)의 한 웰에서 세포를 기계적으로 수확하고 세포 현탁액을 1.5mL 튜브에 넣습니다.
4. 2,800 x g 에서 4°C에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다.
5. 마이크로피펫으로 PBS를 제거하고 튜브를 얼음 위에 유지합니다.
6. 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제( 재료 표 참조)를 사용하여 RIPA 완충액에 세포 펠릿을 현탁시키고 얼음에서 30분 동안 배양합니다.
   참고: 세포 펠릿을 용해하려면 70-80μL로 충분합니다.
7. 21,000 x g 에서 4 °C에서 15 분 동안 샘플을 원심 분리합니다.
8. 상층액을 1.5mL 튜브에 조심스럽게 제거하고 펠릿을 버립니다.
   참고: 상층액은 세포 균질액을 나타냅니다.
9. 총 단백질^18,19의 비색 검출 및 정량화를 위해 bicinchoninic acid (BCA)를 사용하여 세포 균질액의 단백질 농도를 측정합니다.

7. 서쪽 blotting

1. 30μg의 세포 균질액을 준비하고(단계 6.8에서) 상업적으로 이용 가능한 SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼를 추가합니다( 재료 표 참조).
2. 모든 단백질의 분자량에 따라 폴리아크릴아미드 겔 전기영동-SDS²⁰ (PAGE-SDS)에서 해결합니다.
   참고: PPARγ, C/EBPα, PLIN1, CD36 및 UCP1의 경우 10% PAGE-SDS, OXPHOS의 경우 12% PAGE-SDS, TOM20의 경우 15% PAGE-SDS를 사용합니다( 재료 표 참조).
3. 350mA에서 2시간 동안 단백질을 PVDF 멤브레인( 재료 표 참조)으로 전기전사합니다.
   알림: 얼음 용기는 1시간 후에 교체해야 합니다. 전체 과정에서 챔버를 얼음 위에 유지하십시오.
4. 항체 데이터시트의 권장 사항에 따라 Tris-buffered saline(TBS) 0.1% Tween 20(TBS-T)에 5% BSA 또는 무지방 우유로 멤브레인을 2시간 동안 차단합니다.
5. 1차 항체(이 연구에 사용된 항체는 재료 표에 자세히 설명되어 있음)와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   참고: 이 연구에 사용된 모든 항체는 차단 용액에서 1:1,000으로 희석되었습니다.
6. 멤브레인을 0.1% TBS-T로 3회 세척하고 상온에서 2시간 동안 고추냉이 과산화효소(HRP) 접합 2차 항체( 재료 표 참조)로 배양합니다.
7. 멤브레인을 0.1%로 3번 세척합니다. TBS-T입니다. 1x TBS로 마지막 세척을 수행합니다. 시각화할 때까지 멤브레인을 1x TBS에 보관합니다. 최대 1시간 동안 보관하는 것이 좋습니다.
8. chemiluminescence²⁰ 또는 다른 선호되는 방법으로 멤브레인을 시각화합니다.

8. 고해상도 이미징

1. 아래 단계에 따라 면역형광 분석을 수행합니다.
   1. P0.5 신생아 마우스(단계 4.8에 따름)의 갈색 지방세포의 1차 배양을 광학 바닥이 있는 96웰 플레이트에서 파종하고 구별합니다( 재료 표 참조).
   2. 분화 0일차와 7일차에 4% PFA로 세포를 20분 동안 고정하고 멸균 PBS로 3회 세척합니다.
   3. 0.1% Triton X-100으로 15분 동안 세포를 투과시키고 실온에서 1시간 동안 3% 생선 젤라틴( 재료 표 참조)으로 차단합니다.
   4. 멸균 PBS로 3회 세척하고 습한 챔버에서 4°C에서 하룻밤 동안 1% BSA/PBS에 PLIN1 항체(1:400, 재료 표 참조)로 배양합니다.
   5. 멸균 PBS로 3회 세척하고 실온에서 1시간 동안 1:1,000(1% BSA/PBS)( 재료 표 참조)에서 형광단 접합 2차 항체로 배양합니다.
   6. 실온에서 30분 동안 1μg/mL Hoechst 33342로 핵을 염색하고 지질 방울을 1μg/mL BODIPY로 염색합니다.
      참고: 형광 이미지는 세포 이미징 시스템을 사용하여 획득했습니다( 재료 표 참조). 전체적으로, 웰당 9개 또는 16개의 사진을 20배 배율로 2-3개의 채널로 획득했습니다.
2. 아래 단계에 따라 투과 전자 현미경을 수행합니다.
   1. 35 mm x 10 mm 세포 배양 접시에서 갈색 지방세포를 성장시키고 분화합니다.
   2. 분화 0일째 및 7일째에 배지를 제거하고 0.1M 카코딜산나트륨 완충액, pH 7.0에 2.5% 글루타르알데히드로 1시간 동안 세포를 고정합니다( 재료 표 참조).
   3. 0.05M sodium cacodylate buffer로 10분 동안 세포를 3회 세척하고 1% 수성 오스뮴 테트라옥사이드( 재료 표 참조)로 15분 동안 처리합니다.
   4. 세포를 이중 증류수로 5분 동안 3회 세척하고 1% 수성 우라닐 아세테이트( 재료 표 참조)로 15분 동안 처리합니다.
   5. 매번 30, 50%, 70%, 95% 및 100%의 에탄올 구배로 5분 동안 세포를 탈수합니다.
   6. 셀을 1:1 에폰/에탄올에 30분 동안 사전 삽입한 다음 1시간 동안 에폰에 삽입합니다( 재료 표 참조).
      참고: 세포 포함은 전체 세포 배양 단층을 덮기 위해 신선한 에폰을 첨가하여 접시에 직접 수행됩니다. 에폰을 60°C의 오븐에서 24시간 동안 중합시킵니다.
   7. 세포 배양 접시를 액체 질소에 2분 동안 담근 다음 펜치를 사용하여 플라스틱 개재물을 느슨하게 합니다.
   8. 세포가 있는 개재물 세그먼트를 수지 블록에 붙여서 초박편절기의 표면과 평행한 미세한 절단(80nm)을 얻습니다( 재료 표 참조).
   9. Reynolds et ^al.21에 따르면 1% 수성 우라닐 아세테이트로 절단부를 4분 동안 염색하고 구연산납으로 5분 동안 염색합니다.
   10. 전자 현미경에서 그리드를 시각화합니다( 재료 표 참조).

지방 형성은 갈색 지방 세포 형성을 유도하고 기능하는 주요 단백질의 발현을 담당하는 전사 인자 네트워크에 의해 조절됩니다22 PPARγ 및 C/EBPα 23,24,25와 같은 고전적인 지방 생성 조절제와 성숙한 지방 세포의 마커를 포함합니다 26,27. 열발생 갈색 지방 표현형의 획득을 허용하는 로시글리타존의 다양한 농도를 테스트함으로써, 본원에 기술된 방법은 신생아 P0.5 마우스의 iBAT의 SVF에 존재하는 지방세포를 성숙한 갈색 지방세포로 분화할 수 있도록 한다. 유도 및 유지 배지에 5μM 로시글리타존을 첨가하면 이 PPARγ 작용제(1nM)의 농도가 더 낮았던 것에 비해 분화 7일째에 지방 형성 조절제와 UCP1의 단백질 수준이 현저히 증가했습니다(그림 3). 미분화 지방세포(0일)는 매우 낮거나 검출할 수 없는 수준의 PPARγ, C/EBPα, PLIN1 및 CD36을 나타냅니다. 대조적으로, 이러한 마커는 분화 7일째에 유의하게 높았습니다(그림 4A-F). 이전에 발표된 결과15와 일치하게, 갈색 지방세포는 분화 프로토콜 전반에 걸쳐 여러 지질 방울을 축적했습니다(그림 5).

미토콘드리아 질량은 갈색 지방 형성 동안 증가하며 지질 방울 축적과 밀접한 관련이 있다28. 본 프로토콜은 분화 7일차에 미토콘드리아 질량 마커 TOM20(그림 6) 및 OXPHOS 복합체(그림 7) 단백질 수준을 현저하게 증가시켰습니다. UCP1은 성숙한 갈색 지방세포에서 높게 발현되며 이 세포 유형29의 진정한 마커입니다. 그림 6에서 볼 수 있듯이 UCP1은 미분화 지방세포(0일)에서 검출되지 않았지만 분화 7일째에 눈에 띄게 증가했습니다.

갈색 지방생성 분화는 미토콘드리아 형태의 변화 및 다른 세포소기관과의 물리적 연관성과 관련이 있다1 5,30. 그림 8에서 볼 수 있듯이 미토콘드리아는 0일째에 길쭉한 관 모양에서 7일째에 "둥글다" 또는 "콩 같은" 모양으로 진화했습니다(그림 8A,B). 미토콘드리아 내부 구조는 또한 지방 형성에 의해 변형되어 평행하게 포장된 크리스타의 밀도가 높아졌습니다. 중요한 것은 미토콘드리아가 분화된 갈색 지방세포의 지질 방울과 밀접하게 연관되어 있었기 때문에 미토콘드리아의 외막과 지질 방울 표면 사이의 식별 가능한 거리는 고해상도 투과 전자 현미경으로도 감지할 수 없었다는 것입니다(그림 8C,D).

그림 1: iBAT의 SVF에서 1차 배양된 지방세포의 생성. 지방세포-함유 SVFs는 신생아(P0.5) 마우스의 견갑간 지방 조직으로부터 수득하였다. 견갑골 간 갈색 지방 조직은 콜라겐분해효소 II형 소화 완충액으로 절단하였다. 혈액 세포를 ACK 완충액으로 용해시켰다. SVF에 포함된 지방세포는 24웰 플레이트에 파종되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 1차 배양 지방세포에서 지방형성 유도. SVF 세포가 밀도에 도달하면 유도 매체로 지방 형성을 유도했습니다. 분화 3일째에, 이 배지는 7일째까지 유지 배지로 교체되었습니다. 약어: DMEM-F12 = Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12; FBS = 소 태아 혈청; DEX = 덱사메타손; IBMX = 이소부틸메틸크산틴; RSG = 로시글리타존; T3 = 트리요오드티로닌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 1nM 또는 5μM 로시글리타존으로 분화된 분화된 갈색 지방세포에서 PPARγ, C/EBPα 및 UCP1의 단백질 수준. (A) 분화 7일째의 지방성 조절인자와 UCP1의 대표적인 면역블롯 이미지. (B) PPARγ, (C) C/EBPα 및 (D) UCP1 단백질 수준의 면역블롯 정량화; 빈쿨린 수준으로 정규화됨(실험 조건당 n = 4). 1 nM 대 5 μM 로시글리타존으로 처리된 지방세포 간의 평균 ± SD. ***p < 0.001 및 ****p < 0.0001로 표현된 결과. p-값은 스튜던트 t-검정을 사용하여 계산되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 분화된 갈색 지방세포에서 갈색 지방형성 조절인자와 성숙한 지방세포 마커의 단백질 수준. (A) 분화 0일째 및 7일째에 분화된 갈색 지방세포의 PPARγ, C/EBPα, PLIN1 및 CD36의 대표적인 면역블롯 이미지. (B) PPARγ, (C) C/EBPα, (D) PLIN1 및 (E) CD36 단백질 수준의 면역블롯 정량화; vinculin 수준으로 정규화됩니다 (분화 일당 n = 4). 결과는 평균 ± SD로 표현되었습니다. **p 는 미분화(0일)와 분화된 갈색 지방세포(7일) 사이에서 0.01을 <. p-값은 스튜던트 t-검정을 사용하여 계산되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 분화된 갈색 지방 세포에 의한 지질 방울의 축적. BODIPY(녹색) 및 PLIN1(빨간색)을 사용한 중성 지질의 염색과 분화 0일차 및 7일차에 갈색(사전)지방세포에서 Hoechst 33342(파란색)를 사용한 핵의 염색을 보여주는 대표적인 면역형광 이미지. (A) 갈색 지방세포, 분화 0일차. (B) 갈색 지방 세포, 분화 7일째. 눈금 막대: 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 분화된 갈색 지방세포에서 미토콘드리아 질량 및 열발생 마커의 단백질 수준. (A) 분화 0일째 및 7일째의 TOM20 및 UCP1의 대표적인 면역블롯 이미지. (B) UCP1 및 (C) TOM20 단백질 수준의 면역블롯 정량화; 빈쿨린 수준으로 정규화됩니다(차등 일당 n = 4). 결과는 미분화(0일)와 분화된 갈색 지방세포(7일) 사이에서 평균 ± SD. *p < 0.05였습니다. p-값은 스튜던트 t-검정을 사용하여 계산되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 분화된 갈색 지방세포에서 OXPHOS subunit의 단백질 수준. (A) 분화 0일차 및 7일차의 대표적인 OXPHOS 면역블로팅. (B) 복합체 I, 소단위 NDUFB8, (C) 복합체 II, 소단위체 30, (D) 복합체 III, 소단위 코어, (E) 복합체 IV, 소단위체 I, (F) ATP 합성효소, 소단위 α의 면역블롯 정량화; vinculin 수준으로 정규화됩니다 (분화 일당 n = 4). 미분화(0일)와 분화된 갈색 지방세포(7일) 사이에서 평균 ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001로 표현된 결과. p-값은 스튜던트 t-검정을 사용하여 계산되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: 분화된 갈색 지방세포의 미토콘드리아 형태. 분화 0일차와 7일차에 투과 전자 현미경의 대표 이미지. (ᅡ,나) 분화 0일째의 갈색 지방세포; 배율: 각각 4,200x 및 16,500x. (씨,디) 분화 7일째에 갈색 지방세포; 배율: 각각 8,500x 및 28,000x. 약어 : LD = 지질 방울; M = 미토콘드리아. 눈금 막대: (A) = 5 μm; (B,C) = 1μm; (D) = 500nm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 완충액 및 배지 준비. 콜라겐분해효소 II형 소화 완충액: 멸균 탈이온수로 준비하고, 여과하고, 생물안전 캐비닛에서 분주합니다. 장기 보관의 경우 -20 °C에서 유지하고 사용 직전에 해동하는 것이 좋습니다. 배양 배지: pH 7.2로 조정. 보관을 위해서는 4 °C에서 유지하는 것이 좋습니다. 유도 및 유지 매체 : DMEM-F12, 10 % FBS, 1 % 항생제 - 항진균제, pH 7.2로 제조. 이 두 매체는 모두 사용 직전에 새로 준비해야 합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: 보고된 다양한 연구에서 사용된 분화 매체의 비교. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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