Method Article

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 장내 마이크로바이옴의 정량화 및 분석을 위한 유동 지렁이 측정법의 적용

DOI:

10.3791/64605

⸱

March 31st, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research and Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Development, Disease Models and Therapeutics Program, Graduate School of Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 은 숙주-마이크로바이옴 상호작용을 유도하는 분자 결정 요인을 조사할 수 있는 강력한 모델입니다. 우리는 예쁜꼬마선충(C. elegans ) 생리학의 주요 측면과 함께 장내 마이크로바이옴 집락화의 단일 동물 수준을 프로파일링하는 고처리량 파이프라인을 제시합니다.

Abstract

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장내 마이크로바이옴의 구성은 동물의 발달과 생활 전반에 걸쳐 숙주 생리학에 극적인 영향을 미칠 수 있습니다. 마이크로바이옴의 조성 변화를 측정하는 것은 이러한 생리적 변화 사이의 기능적 관계를 식별하는 데 매우 중요합니다. 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans )은 숙주-마이크로바이옴 상호작용의 분자 동인을 조사하기 위한 강력한 숙주 시스템으로 부상했습니다. 투명한 신체 구조와 형광 태그가 부착된 천연 미생물을 통해 개별 예쁜꼬마선 충 동물의 장내 미생물 군집 내 미생물의 상대적 수준은 대형 입자 분류기를 사용하여 쉽게 정량화할 수 있습니다. 여기에서는 마이크로바이옴의 실험적 설정, 원하는 생애 단계에서 예쁜꼬마선충 개체군의 수집 및 분석, 분류기의 작동 및 유지 관리, 결과 데이터 세트의 통계 분석을 위한 절차를 설명합니다. 또한 관심 미생물을 기반으로 분류기 설정을 최적화하기 위한 고려 사항, 예쁜꼬마선충(C. elegans )의 생애 단계에 대한 효과적인 게이팅 전략 개발, 장내 마이크로바이옴 구성을 기반으로 동물 개체군을 풍부하게 하기 위해 선별기 기능을 활용하는 방법에 대해서도 논의합니다. 잠재적인 응용 프로그램의 예가 프로토콜의 일부로 제시되며, 여기에는 처리량이 많은 응용 프로그램으로의 확장 가능성이 포함됩니다.

Introduction

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동물의 진화는 끊임없는 미생물의 영향을 받고 있다1. 동물 숙주는 환경의 다양한 미생물로부터 숙주의 능력을 확장하고 생리적 특성과 질병에 대한 감수성을 촉진하는 특정 파트너2를 획득한다3. 예를 들어, 장내 마이크로바이옴에 대한 메타게놈 분석은 비만 마우스에서 더 많은 에너지 수확 및 저장을 제공할 수 있는 미생물 유전자의 풍부한 대사 클래스를 밝혀냈으며4 그 중 다수는 인간의 장내 마이크로바이옴에서도 발견된다5. 인과 관계를 확립하고 마이크로바이옴 영향의 분자 결정 요인을 정확히 찾아내야 할 필요성이 여전히 크지만, 대규모 스크리닝에 대한 숙주 시스템의 마이크로바이옴 복잡성과 다루기 쉬움으로 인해 진전이 방해를 받고 있습니다.

예쁜꼬마선충(C. elegans) 모델 유기체는 마이크로바이옴과 숙주 생리학 간의 연관성에 대한 분자적 이해를 증진할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 점막층과 융모 구조를 가진 20개의 장 세포를 가지고....

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Protocol

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1. 마이크로바이옴 혼합물의 제조

  1. 글리세롤 냉동고 스톡에서 박테리아를 리소겐 브로스(LB) 플레이트 또는 적절한 성장 배지에 스탬핑 또는 줄무늬를 제거하고 관심 박테리아 균주를 기반으로 최적의 온도( 일반적으로 예쁜꼬마선충 천연 미생물의 경우 25°C)에서 밤새 성장합니다.
  2. LB 플레이트에서 각 박테리아 분리물(예: CeMbio 컬렉션의 박테리아 12개)에서 단일 콜로니를 사용하여 1mL 딥 웰 플레이트의 별도 웰에 800μL의 LB 배지를 접종합니다. 250rpm에서 진탕하여 최적의 온도에서 하룻밤 동안 배양합니다.
    참고: 이 프로토콜은 정의된 천연 마이크로바이옴(예: CeMbio)과 함께 사용하도록 최적화되어 있지만 적절한 조건 또는 기타 배양 용기(튜브)에서 성장을 통해 개별 미생물에 맞게 쉽게 조정할 수 있습니다.
  3. 분광광도법으로 각 미생물의 성장을 평가합니다. 20μL 부분 표본을 80μL의 LB로 옮기고 용액을 투명하고 평평한 바닥 96웰 플레이트에 추가합니다. 플레이트 리더에서 OD600 을 측정합니다.
  4. 하룻밤 동안 성장시킨 후 딥웰 배양 플레이트를 4,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 박테리아를 펠릿화하고 96웰....

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Results

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성충 및 유충 개체군 게이트 정의
여기에서 동기화된 예쁜꼬마선충(C. elegans) L1은 표준 실험실 식단인 E. coli OP50(Eco)으로 파종된 NGM 플레이트에서 성장했습니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans) 개체군은 20°C에서 96시간 또는 120시간 성장한 후 LPS 분석을 위해 수집되었습니다(그림 2A). 멸종의 점도표(EXT, 신체 밀도의 대리물)와 비행 시간(TOF, 신체 길이의 대리)은 시각적으로 분리된 두 개의 동물 구름을 만듭니다. 각 점은 유충에 비해 성충에서 더 높은 EXT 및 TOF 값이 관찰되는 단일 동물을 나타냅니다(그림 2B). 이 두 매개변수는 개체군 증가와 생리학에 대한 귀중한 추론입니다. 예를 들어, 유충 TOF의 밀도 플롯은 유충 단계의 분포를 시각화할 수 있습니다. 생후 2일 된 성체의 자손.......

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Discussion

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유동 지렁이 측정법은 여러 연구에서 병원균 집락화 및 독성에 대한 예쁜꼬마선충 유전자 및 경로를 특성화하는 데 사용되었습니다21,22. 여기에서는 예쁜꼬마선충(C. elegans)을 사용하여 장내 마이크로바이옴이 숙주 생리학을 조절하는 방법을 조사하는 고처리량 조정 가능한 접근법을 제시합니다. 콜로니 형성 단위(CFU) 또는 16S rRNA 앰플리콘 염기서열분석 9,16,17,23,24를 사용하는 기존 방법과 비교할 때 이 접근 방식은 노동 집약적인 계수가 필요하거나 잠재적인 PCR 바이어스를 도입하지 않습니다.

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Disclosures

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저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 NIH 보조금 DP2DK116645(B.S.S.), Dunn Foundation 파일럿 상 및 NASA 보조금 80NSSC22K0250(B.S.S.)의 지원을 받았습니다. 이 프로젝트는 또한 베일러 의과대학의 세포분석 및 세포 분류 코어(Cytometry and Cell Sorting Core)의 지원을 받아 CPRIT Core Facility Support Award(CPRIT-RP180672), NIH(S10 OD025251, CA125123 및 RR024574), Joel M. Sederstrom의 지원과 LPS NIH 보조금(S10 OD025251)을 위한 계측 보조금을 받았습니다. 일부 균주는 NIH Office of Research Infrastructure Programs(P40 OD010440)에서 자금을 지원하는 CGC에 의해 제공되었습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15mL 원뿔형 바닥 원심분리기 튜브VWR10026-076
96개의 딥 웰 플레이트(1mL)AxygenP-DW-11-C
96개의 딥 웰 플레이트(2mL)AxygenP-DW-20-C
96웰 Costar 플레이트Corning3694
AgarMillipore SigmaStandard 세균학 한천도 충분합니다.
흡인 매니폴드V& P scientificVP1171A
BleachClorox
Bleach 솔루션 표백제와 5M 나트륨 차아염소산염 2:1 (v/v)
세포 이미징 멀티모드 리더혼합 BiotekCytation 5세균 OD 측정
원심분리기Thermo scientific Sorvall Legend XTR96 웰 플레이트 및 원추형 튜브
형광 현미경NikonTiE
ggplot: 데이터 플로팅을 위한 다양한 R 프로그래밍 도구.R 패키지버전 3.3.2
대형 입자 자동 시료 주입기Union BiometricaLP Sampler
대형 입자 분류기Union BiometricaCOPAS Biosorter
LevamisoleFisherAC187870100
Lysogeny Broth (LB)RPIL24066Bacto-tryptone, 효모 추출물 및 NaCl을 사용한 표준 LB 가정용 레시피도 있습니다. 충분한.
M9 솔루션 22 mM KH2PO4 모노염기성, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
선충 성장 매체RPIN81800-1000.01 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 오토클레이빙 후 첨가.
RStudioGNU버전 1.3.1093
차아염소산나트륨Sigma-Aldrich5M NaOH
스테레오 현미경NikonSMZ745
멸균 10cm 직경 페트리 접시Corning351029
멸균 12웰 플레이트VWR10062-894
멸균 24웰 플레이트VWR10062-896
멸균 직경 6cm 페트리 접시Corning351007
Triton X-100Sigma-AldrichT8787

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).
  2. Seedorf, H., et al.

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