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방법 논문

생쥐의 단일 문합 십이지장-회장 우회술(Single-Anastomosis Duodeno-Ileal Bypass with Sleeve Gastrectomy Model in Mice)

2.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/64610

⸱

2023년 2월 10일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CHU Nantes, CNRS, INSERM, l'institut du thorax, Nantes Université, 2Chirurgie Cancérologique, Digestive et Endocrinienne, Institut des Maladies de l'Appareil Digestif, Hôtel Dieu, CHU Nantes

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

단일 문합 십이지장-회장 우회술(SADI-S)은 중요한 대사 효과가 있는 새로운 비만 절차입니다. 이 기사에서는 마우스에서 SADI-S의 신뢰할 수 있고 재현 가능한 모델을 제시합니다.

초록

비만은 전 세계적으로 주요 건강 문제입니다. 이에 대한 대응으로 비만 및 관련 동반 질환(예: 당뇨병, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염, 심혈관 사건 및 암)을 제한적이고 흡수 불량 기전을 통해 치료하기 위한 비만 수술이 등장했습니다. 이러한 절차가 이러한 개선을 허용하는 메커니즘을 이해하려면 유전자 변형 동물을 쉽게 생성할 수 있기 때문에 종종 동물, 특히 생쥐로의 전이가 필요합니다. 최근에는 위소매절제술을 동반한 단문합십이지장회장우회술(SADI-S)이 제한적 효과와 흡수불량 효과를 모두 사용하는 시술로 등장하여 주요 비만의 경우 위우회술의 대안으로 사용되고 있다. 지금까지 이 절차는 강력한 대사 개선과 관련이 있어 일상적인 임상 실습에서 사용이 현저하게 증가했습니다. 그러나 이러한 대사 효과의 기본 메커니즘은 동물 모델의 부족으로 인해 제대로 연구되지 않았습니다. 이 기사에서는 수술 전후 관리에 특히 중점을 두고 생쥐에서 신뢰할 수 있고 재현 가능한 SADI-S 모델을 제시합니다. 이 새로운 설치류 모델의 설명과 사용은 과학계가 SADI-S에 의해 유도된 분자, 대사 및 구조적 변화를 더 잘 이해하고 임상 실습을 위한 수술 적응증을 더 잘 정의하는 데 도움이 될 것입니다.

서론

비만은 유병률이 증가하는 새로운 풍토병 상황으로, 전 세계 성인 20명 중 약 1명에게 영향을 미칩니다1. 비만 수술은 최근 몇 년 동안 영향을 받은 성인에게 가장 효과적인 치료 옵션이 되었으며, 체중 감소와 대사 장애를 모두 개선하고2,3, 사용된 수술 절차에 따라 결과가 달라집니다.

비만 시술의 효과와 관련된 두 가지 주요 메커니즘이 있습니다: 포만감을 증가시키는 것을 목표로 하는 제한(예: 위의 80%가 제거되는 위소매절제술(SG))과 흡수 장애. 제한과 흡수 장애를 모두 암시하는 절차 중 위소매절제술을 동반한 단일 문합 십이지장-회장 우회술(SADI-S)이 Roux-en-Y 위 우회술(RYGB)의 대안으로 제안되었으며, 여기서 약 20%의 환자에서 체중 회복이 관찰됩니다 4,5. 이 기술에서 위소매절제술은 소장 재배열과 관련이 있으며 담즙과 짧은 총사지(전체 소장 길이의 1/3)로 나뉩니다(그림 1A). 기술적으로 SADI-S는 RYGB에 비해 단일 문합만 필요하다는 장점이 있어 작동 시간이 약 30% 단축됩니다. 또한,이 방법은 유문을 보존하여 소화성 궤양 질환의 위험을 줄이고 문합 누출을 제한합니다. SADI-S는 또한 높은 신진 대사 개선율과 관련이 있으며, 지난 몇 년 동안 그 사용을 강력하게 선호했습니다 6,7.

대사 효과가 비만 시술의 기초가 되고 있기 때문에 그 메커니즘을 설명하는 것이 중요해 보입니다. 따라서 비만 시술을 위한 동물 모델의 사용은 동물 모델의 대사 효과와 관련된 세포 및 분자 경로를 더 잘 이해하는 데 가장 중요하다8. 이러한 모델은, 예를 들어, 통제된 환경9에서 SG 또는 RYGB 후 음식 섭취량의 변화를 더 잘 이해하고, 장 장벽을 통한 포도당 또는 콜레스테롤 플럭스의 연구에 기여하였다10,11; 이러한 정보는 임상 연구에서 거의 사용할 수 없습니다. 이 지식은 최적의 수술 적응증을 정의하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이전에 SG 및 RYGB12의 마우스 모델에 대해 설명했습니다. 그러나 임상 실습에서 유망한 결과에도 불구하고 SADI-S는 쥐13,14,15에서만 개발되고 설명되었습니다. 그러나, 그의 유전적 가단성을 감안할 때, 마우스 모델은 과거에 이러한 절차의 다양한 대사 효과를 연구하는 데 유용했으며(16,17,18), SADI-S 마우스 모델은 기술적 어려움에도 불구하고 SADI-S의 효과를 평가하는 데 유용할 수 있다.

이 기사에서는 재현 가능한 방식으로 마우스(그림 1B)에서 SADI-S 절차의 적응에 대해 설명합니다. 수술 전후 관리에 대한 설명에 특별한주의를 기울입니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 동물 실험을 위한 현지 프랑스 윤리 위원회(Comité d'éthique en expérimentation animale; 참조 CEEA-PdL n 06)의 승인을 받았습니다.

1. 수술 전 준비

  1. 수술 3 일 전에 일반 식단에 젤 다이어트 식품을 추가하십시오. 수술 6시간 전에 마우스를 금식시킵니다.
  2. 산소(1L/min)가 있는 전용 챔버에서 5% 이소플루란(1L/min)으로 마취를 유도합니다. 마우스에 부프레노르핀(0.1mg/kg), 아목시실린(15mg/kg), 메토클로프라미드(1mg/kg), 멜록시캄(1mg/kg) 및 철(0.5mg/kg)을 피하 주사합니다.
  3. 전기 면도기를 사용하여 xiphoid 과정부터 시작하여 마우스 복부의 처음 2/3 부분을 면도하십시오. 마우스의 복부를 요오드 폴리비돈 용액을 사용하여 두 단계로 소독합니다.
  4. 깨끗한 언더패드로 덮인 전용 열 패드에 마우스 앙와위를 놓습니다. 산소(0.4L/min)와 함께 2%-2.5% 이소플루란(0.4L/min)이 포함된 노즈콘을 사용하여 마취를 유지합니다. 발가락 핀치 테스트를 사용하여 마취 깊이를 확인하십시오.
  5. 멸균 된 플라스틱 랩으로 마우스를 덮으십시오. 마우스의 복부에 과신전을 적용하려면 아래쪽 발을 고정하고 마우스 등 뒤에 놓인 1mL 주사기 또는 이에 상응하는 것을 사용합니다. 미래 절개 크기의 멸균 압축으로 개구부를 잘라내어 마우스를 덮는 수술 영역으로 사용하십시오. 일반 설치는 그림 2A에 나와 있습니다.
  6. 수술 전에 안면 마스크, 스크럽 캡 및 멸균 장갑을 사용하십시오. 수술을 위해 멸균 된 도구를 사용하십시오.

2. SADI-S 프로토콜

  1. 중앙 개복술
    1. 양안 현미경 (8 배 배율)에서 xiphoid process에서 복부 중앙까지 복부 피부를 열어 가위 또는 메스로 중앙 개복술을 수행합니다. xiphoid 과정과 musculoaponeurotic 층이 보이는지 확인하십시오 (그림 2B).
      참고: 부피바카인(3mg/kg)을 피부 절개 5분 전에 수술 부위에 피하 투여합니다.
    2. 복부 근육 사이의 가위로 linea alba를 따라 복벽을 엽니 다. 흉강에 들어가지 않도록 주의하십시오(그림 2C).
  2. 십이지장 배제
    1. 축축한 면봉을 사용하여 복강에서 십이지장을 부드럽게 동원하여 앞쪽과 뒤쪽을 봅니다. 작은 대망과 십이지장의 뒤쪽에있는 양안 현미경으로 즉시 볼 수있는 주요 담관을 국소화하십시오 (그림 3A, 검은 색 화살표).
    2. 주요 담관에서 근위부로 쌍안 현미경으로 십이지장 동맥 사이의 영역을 시각화합니다(그림 3A, B, 파란색 점선). 십이지장의 한쪽에서 다른 쪽으로 구부러진 마이크로 집게를 사용하여 이 영역을 관통하고 6-0 비흡수성 봉합사를 사용하여 동맥 사이의 십이지장 결찰을 수행합니다(그림 3C-E). 십이지장 동맥의 가지를 결찰하지 않도록주의하십시오.
  3. 위소매절제술
    1. 축축한 면봉과 비 외상성 클램프를 사용하여 복강에서 위를 동원합니다. 미세 가위를 사용하여 위를 주변 장기와 분리하십시오 : 더 큰 망막을 분리하고, 위와 비장 사이의 짧은 위 동맥 (비장 동맥의 가지)을 자르고, 위와 식도의 하부를 연결하는 지방종 (그림 4A, B).
    2. 마이크로 가위를 사용하여 안저를 열어 5mm 위절개술을 수행하고 면봉을 사용하여 잔여 음식물을 제거합니다(그림 4C, 화살표). 제거된 위 내용물로 인한 오염을 방지하기 위해 멸균 식염수(37°C)로 위절개술 부위를 헹굽니다.
    3. 위의 더 큰 곡률을 따라 수술용 클립(중간 크기, 5.6mm)을 적용하여 위의 약 80%를 배제합니다. 두 개의 클립으로 충분합니다. 제외된 위를 마이크로 가위로 잘라 제거합니다(그림 4D-G).
    4. 위 절제술의 시작부터 끝까지 실행 봉합사(8-0)를 수행하여 불투과성을 확인하기 위해 수술 클립을 고정합니다(그림 4H).
  4. 십이지장-회장 문합
    1. 양안 현미경으로 맹장 바로 앞에 위치한 마지막 회장 루프를 시각화합니다(그림 5A). 마지막 회장 루프에서 복강 외부의 소장을 부드럽게 동원합니다. 그림 5B에 표시된 대로 마지막 회장 루프가 왼쪽에 위치하도록 소장을 배치합니다. 이전 크기의 봉합사를 사용하여 마지막 회장 루프에서 10cm(소장 전체 길이의 약 1/3)를 측정합니다. 이것은 미래의 문합의 장소가 될 것입니다.
    2. 미래의 담즙 사지가 왼쪽에서 문합 부위로 오도록하기 위해 미래의 문합 부위 주위에 소장의 큰 고리를 만드십시오. 마이크로 가위를 사용하여 이 시점에서 소장을 열어 4mm 장절개술을 수행합니다(그림 5C-E). 오염을 방지하기 위해 멸균 식염수(37°C)로 장 절개술 부위를 헹굽니다.
    3. 십이지장의 제외 된 부분, 유문 직후, 위와 2.2.2 단계에서 수행 된 결찰 사이의 4mm 장 절개술을 수행합니다 (그림 5F). 항상성을 높이기 위해 흡수성 5mm x 5mm 지혈 콜라겐 압축을 배치합니다.
    4. 비흡수성 8-0 사용 봉합사, 좌우로 십이지장 - 회장 문합을 수행하십시오. 후방 문합으로 시작하여 전방 문합이 이어집니다(그림 5G-I).
  5. 복부 폐쇄
    1. 담즙 사지가 복부의 상부 왼쪽에서 문합에 도달하고 일반 사지가 복부의 하부로 떨어지도록 복강 내 소장을 표시하십시오.
      참고: 약 5mL의 멸균 0.9% 식염수(37°C)로 복부를 세 번 세척합니다. 그런 다음 복부에서 체액을 흡입하여 잔류 위장관액과 소화된 음식을 제거하여 세균 감염 및 후속 복부 염증을 방지합니다.
    2. 1 mL 주사기를 사용하여 복강에 직접 적용하여 37°C 식염수 500μL로 마우스를 재수화합니다.
    3. 단일 6-0 비 흡수성 달리기 봉합사를 사용하여 근 건막 층을 닫습니다. 6-0 비흡수성 분리 봉합사를 사용하여 복부 피부를 닫습니다(그림 5J,K).

3. 일반적인 수술 후 관리

  1. 이소플루란을 멈춘 후 코 마스크를 주입한 0.4L/min O2 미만의 열 패드에서 마우스를 깨우십시오. 완전히 깨어났을 때(완전한 운동 회복으로 보장할 수 있음) 마우스를 30°C 인큐베이터의 케이지에 단독으로 넣습니다. 마우스를 30°C 인큐베이터에 5일 동안 방치한다(가스 또는 습도에 대한 특정 조건 없음).
    알림: 케이지는 미리 예열해야 합니다.
  2. 수술 직후 물에 자유롭게 접근 할 수 있습니다. 프로토콜이 끝날 때까지 비타민 B1, B9, B12 및 지용성 비타민(A, D, E, K)을 포함한 비타민 보충제를 물(800mg/물 180mL)에 추가합니다.
  3. 부프레노르핀 피하주사(0.1mg/kg)를 1일차부터 3일차까지 1일 2회, 이후 5일차까지 1일 1회 피하 주사하여 진통을 유지한다. 아목시실린(15mg/kg), 멜록시캄(1mg/kg) 및 메토클로프라미드(1mg/kg) 피하 주사를 3일까지 하루에 한 번 계속합니다. 프로토콜이 끝날 때까지 하루에 한 번 철분(0.5mg/kg)을 피하 주사합니다.

4. 일반적인 측정 및 안락사

  1. 수술 후 5 일까지 매일 생쥐의 체중을 측정하십시오. 그런 다음 7 일째에 체중을 측정 한 다음 매주 체중을 측정하십시오.
  2. 일일 음식 섭취량을 측정하려면 케이지 당 한 마리의 마우스를 넣으십시오. 알려진 고형 사료의 체중을 놓고 24시간 후에 남아 있는 고형 사료의 중량을 측정합니다. 3일, 4일, 5일, 7일째 및 매주 음식 섭취량을 측정합니다.
  3. 혈액 샘플링을 위한 심장 좌심방 절개 후 부프레노르핀(0.1mg/kg)을 피하 주사하여 전신 마취(5% 이소플루란(1L/min)와 산소(1L/min) 하에서 경추 탈구(500-600μL)로 마우스를 안락사시킵니다.
  4. 20μL의 혈액이 필요한 자동 혈액학 분석기를 사용하여 혈중 헤모글로빈 농도를 측정합니다.

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결과

학습 곡선
이 모델의 학습 곡선은 그림 6에 나와 있습니다. 수술 시간의 점진적인 감소가 관찰되어 4주간의 집중 훈련 후 약 60분의 수술에 도달합니다(그림 6A). 수술 후 5일 생존율도 시간이 지남에 따라 개선되어 정기적인 진료 기간 동안 77%에 도달했습니다(그림 6B). 사망의 가장 빈번한 원인은 문합 누출과 담즙성 복막염을 유발하는 구심성 루프 증후군이었습니다. 우리는 이 원고에 설명된 기술로 첫 달 후반에 사망을 관찰하지 못했습니다. 주목할 점은 수술용 클립을 봉합사로 고정하지 않고 수행된 이전 실험에서 사례의 3분의 2에서 클립 이동이 발생하여 31일에 소장 폐색으로 인한 사망 1건이 발생했다는 것입니다. 이러한 결과는 이 모델을 마스터하려면 집중적인 훈련이 필요하다는 것을 강조합니다.

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토론

기술이 지속적으로 발전하고 있는 비만 수술은 현재 비만 및 관련 대사 동반 질환에 대한 가장 효과적인 치료법인 것으로 보입니다 3,19,20. 20074에서 처음 기술된 SADI-S 시술은 다른 흡수 장애 수술보다 더 큰 대사 효과와 관련된 유망한 시술이다. 동물 모델, 특히 유전자 변형 모델의 빠른 생성을 허용하는 마우스는 이러한 개선의 기본 메커니즘을 완전히 이해하는 데 강력히 필요합니다. 여기서 우리는 생쥐에서 SADI-S의 신뢰할 수 있고 번식 가능한 모델을 설명합니다.

SADI-S 절차의 첫 번째 중요한 단계는 십이지장을 배제하여 담즙과 췌장 분비물만 십이지장과 소장의 처음 2/3로 이동할 수 있도록 하는 것입니다. 인간의 경우 십이지장이 절단되어 종단에서 측면으...

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공개 사항

클레어 블랜차드(Claire Blanchard)는 메드트로닉으로부터 임상 몰입 과정을 제공하기 위해 급여를 받았습니다.

감사의 글

봉합사와 수술용 클립을 친절하게 제공해 주신 Ethicon(Johnson and Johnson surgical technologies)에 감사드립니다. 이 작업은 NExT Talent Project, Université de Nantes, CHU de Nantes의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Agagani 바늘 26 GTerumo050101B26 G 바늘
Betadine dermique Pharma-gdd3300931499787Povidone 솔루션
Betadine 스크럽Pharma-gdd  3400931499787Povidone 용액
쌍안 현미경Optika 현미경 이탈리아SZN-9쌍안 실체 현미경
BuprecareAnimalcare3760087151244Buprenorphin
Castroviejo, 스트레이트 9cmF.S.T12060-02마이크로 가위
Castroviejo, 스트레이트 9cmF.S.T12060-02바늘 홀더
Chlorure de sodium Fresenius 0.9%Fresenius Kabi BE182743NaCl 0.9 %
ClamoxylMed'vet5414736007496Amoxicilline
면봉Comed2510805면봉
Element HT5ScilvetElement HT5자동 혈액학 분석기
EmepridCEVA3411111914365Metoclopramid
Extra Fine Graefe Forceps, curved (팁 폭 : 0.5mm)F.S.T11152-10수술용 집게
미세 Graefe 집게, 직선 (팁 너비: 0.5 mm)F.S.T11150-10수술용 집게
FercobsangVetopriceQB03AE04철, 종합 비타민 및 미네랄 
ForaneBaxter1001936060Isoflurane
Graefe 겸자, 직선 (팁 폭 : 0.8 mm)FS11050-10집게
GraphPad Prism 버전 8.0GraphPad Software, Inc.버전 8.0통계 분석을 위한 소프트웨어
히트 패드Intellibio innovationA-2101-00300히트 패드
인큐베이터Bioconcept Technologies주문형제조 인큐베이터 
조명Optika 현미경 이탈리아CL-30현미경 용 조명
OcrygelMed'vet3700454505621 Carboptol 980 NF
Pangen 2.5 cm x 3.5 cmUrgovetA02978지혈 콜라겐 압축
Prolene 6/0B.Braun3097915Optilene 6/0 (0.7 미터법) 75 cm 2XDR13 CV2 RCP, 봉합사
코드 Prolene 8/0Ethicon87322 x BV175-6 MP, 3/8 원형, 8 mm,  봉합 코드
가위F.S.T146168-09수술용 가위
멸균 압축 Laboartoire Sylamed211S05-50부직포 멸균 압축
Terumo 주사기Terumo508281 mL 주사기
티타늄 지혈 클립P é ters SurgicalB2180-1수술 클립
Vannas WolffF.S.T15009-08마이크로 가위
Vita RongeurVirbac3597133087611비타민 보충제
Vitaltec 스테인리스Pé ters SurgicalPB 220-EB 중형수술용 클립 어플리퍼
초

참고문헌

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