여기에서 우리는 기능적 혈관화된 베이지색 지방 조직을 엔지니어링하기 위한 간단한 접근 방식으로 설치류 또는 인간 지방 조직에서 분리된 미세혈관 조각의 사용을 설명하는 자세한 프로토콜을 제시합니다.
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방법 논문
Microvascular Fragments에서 Vascularized Thermogenic Adipose Tissue의 3차원 배양
이 논문에서
요약
초록
공학적 열 발생 지방 조직(예: 베이지색 또는 갈색 지방 조직)은 대사 질환에 대한 잠재적 치료법 또는 건강 검진 및 약물 검사를 위한 개인화된 미세 조직의 설계를 위한 것으로 조사되었습니다. 현재의 전략은 종종 매우 복잡하며 열 발생 지방 조직의 다세포 및 기능적 특성을 정확하게 완전히 묘사하지 못합니다. 지방 조직에서 분리된 세동맥, 세정맥 및 모세혈관으로 구성된 작고 손상되지 않은 미세혈관인 미세혈관 단편은 혈관화 및 지방 조직 형성을 가능하게 하는 단일 자가 세포 공급원 역할을 합니다. 이 기사에서는 지방 조직 및 배양 조건에서 미세혈관 단편을 분리하기 위한 프로토콜을 포함하여 미세혈관 조각에서 3차원, 혈관화 및 기능적 열발생 지방 조직을 생성할 수 있도록 배양 조건을 최적화하는 방법을 설명합니다. 또한 조작된 조직을 특성화하는 기술과 마찬가지로 모범 사례에 대해 논의하고 설치류 및 인간 미세혈관 단편의 샘플 결과를 제공합니다. 이 접근법은 비만 및 대사 질환 치료법의 이해와 개발에 활용될 가능성이 있습니다.
서론
이 프로토콜의 목표는 잠재적으로 자가 소스인 단일 미세혈관 단편(MVF)에서 혈관화된 베이지색 지방 조직을 개발하기 위한 접근 방식을 설명하는 것입니다. 갈색 및 베이지색 지방 조직은 대사 조절과 관련된 유익한 특성을 나타내는 것으로 입증되었습니다. 그러나, 성인의 이러한 지방 조직 저장소의 소량은 특히 비만이나 제2형 당뇨병과 같은 질병 상태에서 전신 대사에 대한 잠재적 영향을 제한한다 1,2,3,4,5,6,7. 비만 및 그 동반 질환과 관련된 유해한 대사 효과를 예방하기 위한 치료 표적으로서 갈색/베이지색 지방에 상당한 관심이 있습니다 8,9,10,11,12.<....
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프로토콜
본 연구는 동물복지법 및 동물복지 시행규정에 따라 실험동물 관리 및 사용 가이드의 원칙에 따라 수행되었다. 모든 동물 절차는 샌안토니오에 있는 텍사스 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
참고: 아래에 설명된 단계에서는 수컷 Lewis Rats가 사용됩니다. 암컷과 생쥐 미세혈관 조각(MVF) 수집에 대해 약간의 프로토콜 조정이 이루어져야 한다29. 인간 MVF(h-MVF)를 사용하는 프로토콜의 경우 필요한 유일한 단계는 제조업체의 프로토콜에 따른 h-MVF의 재현탁, 성장 배지 준비(1.3), 피브린 하이드로겔 형성(5) 및 배양(6)입니다. 프로토콜에 대한 개요는 그림 1을 참조하십시오.
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결과
베이지색/갈색 지방 조직의 몇 가지 주요 표현형 형태학적 특징이 있습니다: 다안성/작은 지질 방울을 포함하고, 많은 수의 미토콘드리아를 보유하고(생체 내에서 특징적으로 "갈색"으로 보이는 이유), 이에 따라 높은 산소 소비율/미토콘드리아 생물 에너지를 가지며, 혈관이 많이 형성되고, 지방 분해/인슐린 자극 포도당 흡수가 증가하고, 가장 악명 높게, 열 발생 호흡에 관여하는 미토콘드리아 단백질인 uncoupling protein 1 (UCP1)을 높은 수준으로 발현한다19,30.
따라서 MVF가 베이지색 지방 조직으로 분화하는 능력을 특성화할 때 MVF의 변형을 시각화하고(그림 7, 그림 8), 유전적으로 확인하고(그림 9, 그림 10) 기능적으로 측정(.......
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토론
갈색 / 베이지 색 지방 조직 공학 분야는 대체로 미성숙 22,23,24,25,26,27,28이며, 대부분의 지방 모델은 백색 지방 조직 8,22,31을 위해 개발되고 있습니다 . 조작된 갈색/베이지색 미세조직은 전형적으로 천연 갈색 지방 조직의 표현형 특성의 하위집합을 얻기 위한 다중 세포 공급원 또는 유전적 변형으로 구성된다
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공개 사항
저자는 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.
감사의 글
Acosta 박사는 국립 보건원 보조금 CA148724 및 TL1TR002647의 지원을 받습니다. 곤잘레스 포라스 박사는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소 (National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases)의 지원을 받고 있습니다. 이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health, 5SC1DK122578)과 텍사스 대학교 샌 안토니오 생물 의학 공학과 (University of Texas at San Antonio Department of Biomedical Engineering)의 지원을 받았습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 그림은 부분적으로 Biorender.com 로 만들어졌습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아미노카프로산 | 시그마 알드리치 | A2504-100G | 1mg/mL |
| 무딘 가위 | Fisher scientific | 12-000-172 | 오토클레이브에서 살균 |
| Bovin, 혈청, 알부민(BSA), | Millipore | 126575-10GM | PBS에서 4mg/mL 및 1mg/mL |
| 콜라겐분해효소, 1형 | Fisher, scientific | , NC9633623 | BSA 4 mg/mL에서 6 mg/mL로 희석, 다진 지방 |
| Dexamethasone | Thermo Scientific | AC230302500 2 mg/ml 스톡 농도에서 에탄올에 희석 | |
| 일회용 언더패드 | Fisher scientific | 23-666-062 | 수술 중 유체 흡수용 |
| 해부 가위 | Fisher scientific | 08-951-5 | 오토클레이브 |
| 에서 살균둘베코&프라임; s 수정된 독수리&프라임; s 매체 (DMEM) | Fisher scientific | 11885092 | |
| Dulbecco′ s 수정된 독수리&프라임; s 중간/영양 혼합물 F-12 햄 (DMEM/F12) | Sigma Aldrich | D8062 | |
| 태아 소 세럼 | Fisher Scientific | 16140089 | DMEM에 20% v/v로 추가되었습니다. |
| 피브리노겐 | Sigma Aldrich | F8630-25G | 20 mg/mL의 농도로 DMEM에 용해, 혈장에서 발견되는 단백질 및 하이드로겔 |
| 플라스크의 주성분, 250 mL | Fisher scientific | FB500250 | 넓은 표면적을 사용하여 지방의 소화를 허용합니다 |
| 집게 | Fisher scientific | 50-264-21 | 오토클레이브에서 살균, 조직 및 필터 취급용 |
| Forskolin | Sigma Aldrich | 10mM 재고 농도에서 에탄올에 희석된 | |
| Human MVF | Advanced Solutions Life Scienes, LLC | 3명의 다른 환자(52세, 54세 및 56세 여성)로부터 분리한 https://www.advancedsolutions.com/microvessels Human MVF(hMVF)를 본 연구에서 사용했습니다. | |
| 인도메타신 | Sigma Aldrich | I7378 | 12.5 mM 재고 농도의 에탄올에 희석 |
| 인슐 | Sigma Aldrich | I5523 | 5 mg/ml 재고 농도에서 0.01 N HCl에 희석 |
| MycoZap | Fisher scientific | NC9023832 | DMEM에 0.2% w/v로 첨가, Mycoplasma 예방적 |
| 페니실린/스트렙토마이신(10,000 U/mL) | Fisher 과학 | 15140122 | DMEM에 1% v/v로 첨가되었습니다. |
| 페트리 접시, 폴리스티렌 (100mm x 15mm). | Fisher Scientific | 351029 | 3은 혈관 제거 및 다지기를 위한 것이고, 8은 스크린 사전 담금질을 위한 것이고 8은 500 또는 37 µ로 여과할 때 사용하기 위한 것입니다. M 스크린 |
| 페트리 접시, 폴리스티렌 (35mm x 10mm). | Fisher scientific | 50-202-036 | 파편 계수용 |
| 인산염 완충액 식염수(PBS) | Fisher scientific | 14-190-250 | 멸균 탈이온수로 1배로 희석. |
| 랫 클리퍼 (Andwin Mini Arco Pet Trimmer) | Fisher scientific | NC0854141 | |
| Rosiglitazone | Fisher scientific | R0106200MG | 10 mM 재고 농도에서 DMSO로 희석 |
| 가위 | Fine Science Tools | 14059-11 | 초기 절개용 1개, 부고환 절개용 1개, 팁 클리핑 |
| Screen 37 µ 남 | Carolina Biological Supply Company | 652222R | 3" 둥근 사각형으로 자르고 에틸렌 옥사이드에서 살균, 매우 작은 단편/단일 세포 및 파편의 단편 포착 및 제거 |
| Screen 500 µ 남 | Carolina Biological Supply Company | 652222F | 3" 둥근 사각형으로 자르고 에틸렌 옥사이드에서 살균, 더 큰 조각/잔해를 제거합니다 |
| 톱니 모양의 Hemostat | Fisher scientific | 12-000-171 | 오토클레이브에서 살균, 절개 전 피부 클램핑을 위해 |
| Steriflip 필터 0.22 μ 엠 | Millipore | SE1M179M6 | |
| Thrombin | Fisher scientific | 6051601KU | deionzed 물에 10 U/mL로 희석, 피브리노겐을 피브린으로 바꾸는 응고제로 사용 |
| 갑상선 호르몬 (T3) | Sigma Aldrich | T2877 | 0.02 mM 재고 농도에서 1N NaOH에 희석 |
| Zucker 당뇨병 지방 (ZDF) 쥐 - 비만 (FA/FA) 또는 마른 (FA/+) 남성 | 찰스 리버 | https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611 | 찰스 리버(매사추세츠주 윌밍턴)에서 획득. 쥐는 생후 4주령에 획득하여 안락사(생후 15-19주)까지 Purina 5008을 먹였습니다. 포도당 수치(외측 복재정맥에서 추출한 혈액)는 연구에 사용된 모든 FA/FA 쥐에서 300mg/dL 이상이었다. 모든 동물은 12시간의 명암 주기로 온도가 조절되는 환경에 수용되었으며 임시로 먹이를 주었습니다. |
참고문헌
- Cohen, P., Spiegelman, B. M. Brown and beige fat: molecular parts of a thermogenic machine. Diabetes. 64 (7), 2346-2351 (2015).
- Liu, X., et al. Brown adipose tissue transplantation reverses obesity in Ob/Ob mice. Endocrinology. 156 (7), 2461-2469 (2....
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재인쇄 및 허가
