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방법 논문

3D 오가노이드에서 구강-식도 편평 세포 암종 모델링

4.4K 조회수

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DOI:

10.3791/64676

⸱

2022년 12월 23일

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1Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University, 2Organoid and Cell Culture Core, Columbia University Digestive and Liver Diseases Research Center, Columbia University, 3Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, Columbia University, 4Histopathology Facility, Fox Chase Cancer Center, 5Division of Digestive and Liver Diseases, Department of Medicine, Columbia University, 6Department of Genetics and Development, Columbia University, 7Section of Oral, Diagnostic and Rehabilitation Sciences, College of Dental Medicine, Columbia University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 화학적 발암을 통해 유도된 정상, 전종양 및 편평 세포 암종 병변을 나타내는 쥐 구강-식도 3D 오가노이드를 생성하고 특성화하는 주요 단계를 설명합니다.

초록

식도 편평 세포 암종(ESCC)은 전 세계적으로 널리 퍼져 있으며 매년 모든 식도암 사례의 90%를 차지하며 모든 인간 편평 세포 암종 중에서 가장 치명적입니다. ESCC 시작 및 개발에 수반되는 분자 변화를 정의하는 최근의 진전에도 불구하고 환자의 예후는 여전히 좋지 않습니다. 이러한 분자 변화의 기능적 주석은 필요한 다음 단계이며 ESCC의 분자 특징을 포착하고 기능적 주석을 위해 쉽고 저렴하게 조작할 수 있는 모델이 필요합니다. 담배 연기 모방체 4-니트로퀴놀린 1-옥사이드(4NQO)로 처리된 마우스는 예상대로 ESCC 및 식도 전종양을 형성합니다. 참고로, 4NQO 병변은 구강, 가장 일반적으로 혀와 전위에서도 발생하며, 모두 층화 편평 상피를 공유합니다. 그러나 이러한 마우스는 동종 마우스 모델을 생성하는 데 시간과 리소스가 많이 소요되기 때문에 기능 가설 테스트를 위해 간단히 조작할 수 없습니다. 여기에서 우리는 생체 외에서 쥐 ESCC 또는 전종양 세포를 특성화하기 위해 4NQO로 처리된 마우스에서 단일 세포 유래 3차원(3D) 오가노이드를 생성함으로써 이러한 한계를 극복합니다. 이러한 오가노이드는 ESCC와 식도 전종양의 두드러진 특징을 포착하고, 저렴하고 신속하게 활용하여 동종 모델을 형성할 수 있으며, 동종 이식 실험에 활용할 수 있습니다. 우리는 정상, 전종양 및 SCC 쥐 식도 조직에서 3D 오가노이드를 생성하고 이러한 오가노이드를 유지 및 냉동 보존하는 방법을 보여줍니다. 이러한 다용도 오가노이드의 응용 분야는 광범위하며 유전자 조작 마우스의 활용과 유세포 분석 또는 면역조직화학에 의한 추가 특성 분석, CRISPR 기술을 사용한 동종 오가노이드 라인 생성, 약물 스크리닝 또는 동유전자 이식을 포함합니다. 우리는 이 프로토콜에서 입증된 기술의 광범위한 채택이 ESCC의 심각한 부담을 해결하기 위해 이 분야의 발전을 가속화할 것이라고 믿습니다.

서론

식도 편평 세포 암종(ESCC)은 늦은 진단, 치료 저항성 및 전이로 인해 인간 편평 세포 암종 중 가장 치명적입니다 1,2. ESCC는 식도의 내강 표면을 감싸는 층화 편평 상피에서 발생합니다. 편평 상피는 증식성 기저 세포와 기저상 세포층 내의 분화된 세포로 구성됩니다. 생리학적 조건에서 기저 세포는 p63, Sox2, 사이토케라틴 K5 및 K14와 같은 마커를 발현하는 반면 분화된 세포는 K4, K13 및 IVL을 발현합니다. 기저 세포 자체는 이질적이며 K153 및 CD734와 같은 마커에 의해 정의된 추정 줄기 세포를 포함합니다. 항상성에서 기저 세포는 기저 상부 세포층 내에서 유사분열 후 말단 분화를 겪는 반면, 분화된 세포는 내강으로 이동하여 박리되어 상피 재생을 완료합니다. 기원 세포를 연상시키는 ESCC는 다양한 정도로 편평 세포 분화를 나타냅니다. ESCC는 종종 비정형 기저 세포를 포함하는 상피내 종양(IEN) 또는 이형성증으로 알려진 다초점 조직학적 전구체 병변을 동반합니다. 상피 변화 외에도 ESCC는 암 관련 섬유아세포(CAF)의 활성화와 면역/염증 세포의 모집이 일어나 종양 촉....

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프로토콜

쥐 실험은 규정 및 동물 프로토콜 #AABB1502에 따라 계획되고 수행되었으며 Columbia University의 Institutional Animal Care and Use Committee에서 검토 및 승인했습니다. 마우스는 마우스의 인도적 치료를 보장하고 마우스에 대한 적절한 수의학적 치료와 실험실 직원을 위한 실험실 안전 교육을 제공하는 적절한 동물 관리 시설에 수용되었습니다.

1. 생쥐를 4NQO로 처리하여 식도 IEN 및 ESCC 병변을 유도 (시간 고려 : 최대 28 주)

참고: 신생물성 식도 병변을 나타내는 MEO를 생성하기 위해 마우스는 이전에 Tang et al.14에 의해 설명된 바와 같이 4NQO 매개 화학 발암에 노출됩니다. 정상/비종양성 MEO는 처리되지 않은 마우스에서 생성됩니다.

  1. 마우스
    1. 케이지 당 4-5 마리의 마우스를 수용하고 실험을 시작하기 전에 최소 1 주일 동안 동물 시설에 적응시킵니다. 노화 관련 장애로 인해 전체 28 주 실험이 조기 종료 될 가능성을 줄이려면 8 주령에서 16 주령의 마우스로 시작하십시오.
      참고: 무게가 약 20-30g인 C5....

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결과

이 프로토콜은 음용수로 투여된 16주간의 4NQO와 10주에서 12주간의 관찰 기간으로 구성된 특정 치료 요법에 따라 4NQO 처리된 마우스의 정상 식도 조직 또는 ESCC 종양 조직에서 쥐 식도 오가노이드(MEO)를 생성하는 과정을 설명합니다(그림 1). 그런 다음 마우스는 혀 또는 식도 조직의 해부를 위해 안락사됩니다(그림 2 및 그림 3). 우리는 손상되지 않은 식도에서 상피층을 분리하는 방법(그림 4)을 후속 단일 세포 분리에 활용하는 방법을 설명합니다. 식도 유래 상피 세포는 처음에 기저막 기질 및 잘 특성화된 무혈청 세포 배양 배지(그림 5)에 세포를 포함하는 50μL 액적에 웰당 5,000개의 세포로 도말하고 평균 7-10일 동안 오가노이드를 형성하도록.......

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토론

여기에 설명된 프로토콜에서 MEO의 생성 및 분석을 위한 몇 가지 중요한 단계와 고려 사항이 있습니다. MEO 실험에서 재현성과 엄격함을 보장하려면 생물학적 및 기술적 복제가 모두 중요합니다. 생물학적 복제물의 경우, ESCC를 보유하는 2-3개의 독립적인 마우스는 일반적으로 실험 조건당 충분합니다. 그러나 적절한 생물학적 복제 횟수는 개별 연구에서 테스트할 매개변수에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 거시적으로 보이는 병변이나 조직학적 IEN 및 ESCC 병변이 없는 4NQO 처리된 마우스에서 신생물 오가노이드가 얼마나 일찍 그리고 얼마나 자주 검출될 수 있는지는 현재 알려져 있지 않습니다. 비록 4NQO가 다양한 마우스 균주에서 식도 병변을 유도하였지만14, MEO는 C57BL/6 마우스에서만 생성되었다. ESCC의 발달 및 진행은 Trp53 손실 및 사이클린 D1 과발현과 같은 유전자 조작 유전적 병변이 있는 마우스에서 가속화됩니다 7,14,15.

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공개 사항

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 글

기술 지원을 위해 컬럼비아 대학교 허버트 어빙 종합 암 센터(Herbert Irving Comprehensive Cancer Center)의 공유 리소스(유세포 분석, 분자 병리학, 공초점 및 특수 현미경)에 감사드립니다. 도움이 되는 토론을 해주신 Alan Diehl 박사, Adam J. Bass, Kwok-Kin Wong 박사(NCI P01 식도 발암 메커니즘)와 Rustgi 및 Nakagawa 연구소 구성원에게 감사드립니다. 이 연구는 다음 NIH 보조금의 지원을 받았습니다: P01CA098101(HN 및 AKR), R01DK114436(HN), R01AA026297(HN), L30CA264714(SF), DE031112-01(FMH), KL2TR001874(FCC), 3R01CA255298-01S1(JG), 2L30DK126621-02

(J.G.) R01CA266978 (CL), R01DK132251 (CL), R01DE031873 (CL), P30DK132710 (CM 및 HN) 및 P30CA013696 (AKR). HN과 CL은 Columbia University Herbert Irving Comprehensive Cancer Center Multi-PI Pilot Award를 수상했습니다. HN은 Fanconi Anemia Res....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.05% 트립신-EDTAThermo Fisher Scientific25-300-120
0.25% 트립신-EDTAThermo Fisher Scientific25-200-114
0.4% 트리판 블루Thermo Fisher ScientificT10282
1 mL 투베르쿨린 주사기(바늘 미포함BD309659
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브Thermo Fisher Scientific05-408-129
100 &마이크로; m 세포 여과기Thermo Fisher Scientific22363549
15 mL 코니컬 튜브Thermo Fisher Scientific14-959-53A
200 µ L 와이드 보어 마이크로 피펫 팁Thermo Fisher Scientific212361A
21G 바늘BD305167
24웰 플레이트Thermo Fisher Scientific12-556-006
4-니트로퀴놀린-1-옥사이드(4NQO)Tokyo Chemical IndustryNO250
50mL 원뿔형 튜브Thermo Fisher Scientific12-565-270
6웰 플레이트Thermo Fisher Scientific12556004
70 µ m 세포 여과기Thermo Fisher Scientific22363548
99.9% 에틸렌 프로필렌 글리콜SK picglobal
Advanced DMEM/F12Thermo Fisher Scientific12634028
Amphotericin BGibco, Thermo Fisher Scientific15290018재고 농도 250 µ g/mL, 최종 농도 0.5 & 마이크로; g/mL
항생제-항진균제Thermo Fisher Scientific15240062재고 농도 100x, 최종 농도 1x
B-27 보충제Thermo Fisher Scientific17504044재고 농도 50x, 최종 농도 1x
Bacto 한천BD214010
CO2 incubator, e.g.Heracell 150iThermo Fisher Scientific51026406또는 동급
Countess II FL 자동 세포 계수기Thermo Fisher ScientificAMQAX1000또는 동급
CryovialsThermo Fisher Scientific03-337-7D
DietGel 76AClear H2O72-07-5022
Dimethyl sulfoxide (DMSO)MilliporeSigmaD4540
DispaseCorning354235재고 농도 50 U/mL, 최종 농도 2.5– 5 U/mL
해부 가위VWR25870-002
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(PBS)Thermo Fisher Scientific14190250재고 농도 1x
소 태아 혈청(FBS)HyCloneSH30071.03
집게VWR82027-386
냉동 용기Corning432002또는 등가
젤라틴Thermo Fisher ScientificG7-500
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061스톡 농도 100x, 최종 농도 1x
HEPESThermo Fisher Scientific15630080스톡 농도 1M, 최종 농도 10mM
핫 플레이트/교반기CorningPC-420D또는 동급
Lab Armor bead bath (또는 water bath)VWR89409-222또는 동급
실험실 저울Ohaus71142841또는 동급
의 Matrigel 기저 멤브레인 추출물 (BME)Corning354234
Microcentrifuge MinispinEppendorf22620100또는 동급의
Microcentrifuge 튜브 랙Southern Labware0061
N-2 보충제Thermo Fisher Scientific17502048재고 농도 100x, 최종 농도 1x
N-아세틸시스테인(NAC)Sigma-AldrichA9165재고 농도 0.5 M, 최종 농도 1
mM Parafilm M wrapThermo Fisher ScientificS37440
파라포름알데히드(PFA)MilliporeSigma158127-500G
병리학 카세트Thermo Fisher Scientific22-272416
위상차 현미경Nikon또는 이에 상응하는
재조합 마우스 표피 성장 인자(mEGF)Peprotech315-09-1mg재고 농도 500 ng/µ L, 최종 농도 100 ng/mL
R-Spondin1 및 Noggin(RN CM)을 발현하는 RN 세포 조절 배지/A/A 요청 시 Organoid 및 Cell Culture Core를 통해 사용 가능, 최종 농도 2%
Sorval ST 16R 원심분리기Thermo Fisher Scientific75004380또는 이에 상응하는
대두 트립신 억제제(STI)MilliporeSigmaT9128재고 농도 250 µ g/mL
ThermoMixer CThermo Fisher Scientific14-285-562 PM또는 동급
Y-27632Selleck ChemicalsS1049재고 농도 10 mM, 최종 농도 10 &마이크로; 미디엄
) 의 의 의 N N

참고문헌

  1. Rustgi, A. K., El-Serag, H. B. Esophageal carcinoma. The New England Journal of Medicine. 371 (26), 2499-2509 (2014).
  2. Dotto, G. P., Rustgi, A. K. Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics. Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).
  3. Giroux, V., <....

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