여기에서 우리는 평생 생리학적 매개변수 추적 및 형광 정량화를 위해 고체 배지에서 분리된 개별 선충을 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 배양 시스템에는 동물이 도망가는 것을 방지하기 위해 단일 벌레 우물 주위에 팔미트산 장벽이 포함되어 있어 병원성 박테리아 및 화학적 스트레스 요인을 포함한 혐오적인 개입을 사용할 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
Longitudinal Fluorescence Monitoring and Averseive Interventions를 위한 고체 배지에서 개별 Caenorhabditis elegans 의 장기 배양
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Caenorhabditis elegans 는 노화 생물학을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 예쁜꼬마선충 노화 연구의 표준 관행은 고체 선충 성장 배지(NGM)에서 벌레 그룹을 배양하여 생존 및 기타 생리학적 표현형에 대한 개체군 수준 데이터를 효율적으로 수집하고 형광 바이오마커 정량화를 위해 하위 집단을 주기적으로 샘플링할 수 있도록 하는 것입니다. 이 접근법의 한계는 (1) 시간이 지남에 따라 개별 벌레를 추적하여 관심 표현형에 대한 연령 궤적을 개발하고 (2) 배양 환경의 맥락에서 형광 바이오마커를 직접 모니터링할 수 없다는 것입니다. 대체 배양 접근법은 액체 배양 또는 미세 유체 공학을 사용하여 시간이 지남에 따라 개별 동물을 모니터링하며, 경우에 따라 형광 정량화를 포함하여 배양 환경이 고체 NGM과 문맥상 구별된다는 단점이 있습니다. WorMotel은 고체 NGM에서 분리된 웜을 배양하기 위한 이전에 설명한 미세 조립식 다중 웰 장치입니다. 각 벌레는 C. elegans의 접촉 방수제인 황산구리로 채워진 해자로 둘러싸인 고체 NGM을 포함하는 우물에 유지되어 개별 동물의 세로 모니터링이 가능합니다. 우리는 황산구리가 식이 제한, 병원성 박테리아 및 세포 스트레스를 유발하는 화학 물질을 포함하여 노화 연구에서 흔히 볼 수 있는 혐오적인 개입을 받을 때 벌레가 도망가는 것을 방지하기에 불충분하다는 것을 발견했습니다. 멀티웰 장치는 또한 형광 이미징에서 높은 배경 아티팩트를 생성하는 폴리디메틸실록산으로 성형됩니다. 이 프로토콜은 원래 인간 백혈구 항원(HLA) 유형 지정을 위해 설계된 상업적으로 이용 가능한 폴리스티렌 마이크로트레이를 사용하여 고체 NGM에서 분리된 회충을 배양하는 새로운 접근 방식을 설명하여 수명 전반에 걸쳐 생존, 생리학적 표현형 및 형광을 측정할 수 있습니다. 팔미트산 장벽은 혐오스러운 조건에서도 벌레가 도망가는 것을 방지합니다. 각 플레이트는 최대 96마리의 동물을 배양할 수 있으며 식이 제한, RNAi 및 화학 첨가물을 포함한 다양한 조건에 쉽게 적응할 수 있으며 수명 및 활동 데이터 수집을 위한 자동화 시스템과 호환됩니다.
서론
예쁜꼬마선충은 유전학, 세포생물학, 분자생물학 연구를 위한 강력한 모델 유기체로, 실험실에서 쉽게 배양할 수 있고, 생성 시간과 수명이 짧으며, 포유류와 높은 수준의 단백질 상동성을 공유하고, 형광 단백질과 염료를 생체 내에서 시각화할 수 있는 투명한 신체 구조를 가지고 있기 때문입니다1. 예쁜꼬마선충을 발달 생물학 및 노화를 포함한 다양한 분야에서 주요 모델 시스템으로 오랫동안 사용해 온 결과, 이들의 성장과 발달이 잘 이해되고 게놈이 완전히 시퀀싱되었으며, 게놈 차원의 RNAi 공급 라이브러리와 수천 개의 돌연변이 및 형질전환 균주를 포함한 강력한 유전 도구가 만들어졌습니다. 역사적으로 예쁜꼬마선충은 고체 한천 선충 성장 배지(NGM)에서 개체군으로 재배되며 표현형은 직접 관찰 또는 이미징 및 다운스트림 분석을 통해 수동으로 평가됩니다. 형광 현미경은 염료 또는 개별 예쁜꼬마선충 에서 형질전환적으로 발현된 형광 태그를 사용하여 다양한 분자 표현형을 캡처하는 데 사용됩니다.형광 이미징은 일반적으로 침습적이고 종종 치명적일 수 있는 얇은 아가로스 패드가 포함된 슬라이드에 동물을 고정하거나 마비시키는 것을 포함합니다. 또한 levamisole 또는 sodium azide....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 조리법
알림: 마이크로트레이 플레이트 준비를 시작하기 전에 스톡 용액을 준비하십시오.
- 저융점 아가로스 선충 성장 배지(lmNGM)를 위한 스톡 솔루션
- 1 L 병에 1 L의 멸균 탈이온수에 174.18 g의K2HPO4를 용해시켜 1 M K2HPO4를 제조한다. 용액을 121°C, 15psi에서 30분 동안 오토클레이브하고 실온(RT)에서 보관합니다.
- 1 L 병에 1 L 멸균 탈이온수 136.09 g의 KH2HPO4를 용해시켜 1MKPi (pH 6.0)를 제조한다. pH 6.0을 달성하기 위해 용액을 1 M K2HPO4로 적정합니다. 용액을 121°C, 15psig에서 30분 동안 오토클레이브하고 RT에 보관합니다.
- 500mL 병에 500mL의 멸균 탈이온수에 73.5g의 CaCl2를 용해시켜 1MCaCl2 를 준비합니다. 용액을 121°C, 15psig에서 30분 동안 오토클레이브하고 RT에서 보관
- 500mL 병에 500mL....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
여기에 설명된 마이크로트레이 기반 단일 벌레 배양 환경은 수명 및 건강 기간, 활동 및 움직임, 체형 및 크롤링 기하학, 시간 경과에 따른 개별 동물에서 형질전환적으로 발현된 형광 바이오마커의 발현을 포함한 다양한 표현형을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 마이크로트레이 배양 시스템은 수동 스코어링 또는 이미지 수집 및 다운스트림 이미징 분석을 통한 수명 분석과 호환됩니다. 페트리 플레이트(21) 상의 표준 배양과 마찬가지로, 웜은 자극(예를 들어, 플레이트를 두드리거나 청색광에 노출)에 따른 움직임에 기초하여 수동으로 죽거나 살아 있는 것으로 스코어링될 수 있다. 이미지 기반 수명 분석의 경우 자극이 적용된 후 촬영된 이미지 간의 프레임 간 차이를 비교하여 각 웜이 움직임을 멈추는 시점을 결정합니다. 이는 자동화된 이미지 수집 및 분석 시스템과 호환되며 각 시점에서 개별 동물의 활동 수준 형태로 추가 데이터를 제공합니다. 이 정보는 수명 (운동 중단)뿐만 아니라 건강 기간 (활동 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
여기에서는 원래 인간 백혈구 항원 조직 유형 분석을 위해 개발된 마이크로트레이를 적용하여 C. elegans 연구의 표준인 한천 기반 NGM과 맥락적으로 유사한 고체 배지 환경에서 시간이 지남에 따라 단일 예쁜꼬마선충의 분리 및 특성화를 허용하는 새로운 배양 시스템에 대해 설명합니다. 이 시스템은 식이 제한, 외인성 약물 치료, 화학적 또는 환경적 스트레스 요인에 대한 도전 및 RNAi를 포함한 다양한 개입과 호환됩니다. 또한 개별 동물에서 생체 내 형광 바이오마커의 종단 모니터링을 가능하게 합니다. 개체군 내에서 개별 동물을 추적할 수 있는 능력은 행동, 병인, 스트레스 상태에 대한 반응 및 건강 감소를 포함하여 뚜렷한 시간적 구성 요소를 가진 표현형에 대해 개체군 내에서 개인 내 가변성을 평가할 수 있도록 합니다. 또한 인구 내에서 다양한 초기 생애 특성이 수명 및 건강을 포함한 후기 생애 결과와 연결될 수 있습니다. 다른 단일 웜 이미징 기술과 유사하게, 이 마이크로트레이 기.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없다고 말합니다.
감사의 글
이 작업은 GLS에 대한 NIH R35GM133588, LE에 대한 NIHT32GM008659 교육 보조금, GLS에 대한 미국 국립 의학 아카데미 촉매 상, 애리조나 이사회에서 관리하는 애리조나 주 기술 및 연구 이니셔티브 기금의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3D 프린팅 테라사키 인서트 | 맞춤형 인쇄 회사 | Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL | FDM 인쇄, 노즐 크기 0.6mm, 표준 PLA 플러스 필라멘트 |
| AirClean 시스템 AC624LF 수직 층류 흄 후드 | 사용 Fisher Scientific | 36-100-4376 | |
| Bacto 펩톤 | Thermo Scientific | 211677 | |
| CaCl2 | Acros organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | Goldbio | C-103-25 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | G-560 | |
| FUdR | Research Products International | F10705-1.0 | |
| 수분 공급 물 결정체 | M2 Polymer Technologies | Type S | Type S 초흡수성 폴리머 |
| 이소프로필ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | 작업 와이프 |
| LB 국물, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Leica K5 sCMOS 흑백 카메라 | Leica Microsystems | 11547112 | |
| Leica M205 FCA 형광 실체 현미경 | Leica Microsystems | 10450826 | |
| 저용융 아가로스 | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| NaCl | Fisher 생물 시약 | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray 단일 웰 플레이트 | Thermo Scientific | 264728 | |
| Nystatin | Sigma | N1538 | |
| 팔미트산 | Acros 유기물 | 129700010 | |
| 종이 타월 | Coastwide Professional | 365374 | |
| Parafilm M | Parafilm | 16-101 | |
| Stratagene UV Stratalinker 2400 | Stratagene | 400075 | UV crosslinker |
| Terasaki 트레이 (람다) | 하나의 람다 | 151431 | |
| Thermolyne Dri-bath | Thermolyne | DB28125 | |
| Tween | 써모 사이언티픽 | J20605-AP |
참고문헌
- Shaham, S. Methods in Cell Biology. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19784/ (2006).
- Boulin, T., et al. Eight genes are required for functional....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
태그
